棉花黄萎病菌致病相关基因VdPR1和VdPR3的克隆及功能分析

摘要

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)是引起棉花黄萎病的主要病原菌，该病害在全球范围内的产棉国家和地区大肆流行，造成严重的经济损失。但是由于其具有稳定的休眠体微菌核、变异性强且与寄主协同进化，因此V.dahliae致病分子机制十分复杂。近年来，随着V.dahliae基因组数据的公布，结合正向遗传学和反向遗传学手段对基因组中致病相关基因的功能进行不同层面的分析，推动了V.dahliae致病分子机制的研究进程，对于靶向控制棉花黄萎病具有重要的意义。
　　前期研究，本课题组已经建立了棉花黄萎病菌强致病力菌株Vd080的T-DNA插入突变体库，通过2轮的致病力筛选，得到了25株单拷贝插入的低致病力突变体。本研究从其中2个低致病力突变体出发，克隆得到了致病相关基因VdPR1和VdPR3并对其进行功能分析。主要研究结果如下：
　　1.VdPR1和VdPR3的克隆和基因结构分析。VdPR1位于V.dahliae第一条染色体上，由2239个碱基组成，包括4个外显子和3个内含子，编码464 aa。通过生物信息学软件预测得出VdPR1编码的蛋白为潜在的分泌蛋白。VdPR3全长762 bp位于V.dahliae第一条染色体上，包括2个外显子和1个内含子，ORF的长度为321 bp，编码106 aa，为假定蛋白。
　　2.基于同源重组原理，结合融合PCR、巢式PCR和Gateway技术，分别构建了致病相关基因VdPR1和VdPR3的敲除载体;利用酶切连接的方法，分别构建了VdPR1和VdPR3的互补载体。通过ATMT技术进而获得敲除突变体ΔVdPR1、ΔVdPR3和互补突变体ΔVdPR1-C、ΔVdPR3-C。
　　3.对致病相关基因VdPR1和VdPR3突变体的生长发育及致病性的研究发现，与野生型菌株Vd080相比，敲除突变体ΔVdPR1和ΔVdPR3的菌落形态都发生了变化，菌落中微菌核数量明显减少，在以纤维素为唯一碳源的培养基中，敲除突变体ΔVdPR1和ΔVdPR3的生长速率比野生型Vd080分别降低了21％和53％，致病力测定结果表明，敲除突变体ΔVdPR1和ΔVdPR3都能引起发病延迟，且棉株的褐化率降低。野生型菌株Vd080接种24天后病情指数高达52.11±3.7，且造成多数棉株死亡，而敲除突变体ΔVdPR1病情指数为20.42±2.0～22.28±2.7，仅为野生型Vd080的41％，降低了59％，而敲除突变体ΔVdPR3的病情指数则是20.67±3.2～26.71±0.3，极显著的低于野生型菌株。重新将致病相关基因VdPR1和VdPR3导入到缺失突变体中获得的互补突变体ΔVdPR1-C、ΔVdPR3-C，不仅致病力得到了恢复，达到了野生型Vd080的水平，其利用纤维素酶的能力与野生型Vd080相比差异不显著。通过qPCR测定了VdPR1、VdPR3突变体在棉花不同组织部位的生物量情况，结果发现，VdPR1和VdPR3也影响了V.dahliae在根部的定殖侵染和下胚轴中的扩展繁殖能力，呈现出与其致病力显著相关的特性。表明对V.dahliae的致病力有重要贡献。
　　综上所述，致病相关基因VdPR1和VdPR3与V.dahliae毒力密切相关，参与了调控V.dahliae的菌丝生长，孢子产量，微菌核的形成及CWDEs的活性，在侵染寄主棉花的过程中发挥着重要作用，对V.dahliae的致病力有重要贡献。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 棉花黄萎病及其危害

1．1．1 棉花黄萎病菌的概述

1．1．2 棉花黄萎病的危害

1．2 黄萎病菌侵染过程及致病机理

1．3 大丽轮枝菌致病相关基因的研究

1．4 大丽轮枝菌中功能基因的研究技术

1．4．1 基因组学途径

1．4．2 农杆菌介导的遗传转化

1．4．3 荧光定量技术

1．4．4 其他技术

1．5 本研究的目的与意义

第二章 棉花黄萎病菌致病相关基因的克隆及生物信息学分析

2．1 实验材料

2．1．1 棉花黄萎病菌菌株

2．1．2 培养基及试剂

2．1．3 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 棉花黄萎病菌的培养与基因组DNA的提取

2．2．2 棉花黄萎病菌RNA的提取和反转录

2．2．3 致病相关基因VdPR1和VdPR3克隆

2．2．4 致病相关基因连接T1载体、转化大肠杆菌及测序

2．2．5 致病相关基因VdPR1和VdPR3的生物信息学分析

2．3 实验结果

2．3．1 致病相关基因的克隆

2．3．2 致病相关基因的生物信息学分析

2．4 讨论

第三章 棉花黄萎病菌致病相关基因敲除和互补载体的构建

3．1 实验材料

3．1．1 菌株及质粒

3．1．2 培养基、试剂及试剂盒

3．2 实验方法

3．2．1 大丽轮枝菌基因组DNA的提取

3．2．2 敲除载体的构建

3．2．3 互补载体的构建

3．3 实验结果

3．3．1 敲除载体的构建

3．3．2 敲除重组质粒转化大肠杆菌及农杆菌

3．3．3 互补载体的构建

3．3．4 互补重组质粒转化大肠杆菌及农杆菌

3．4 讨论

第四章 棉花黄萎病菌致病相关基因敲除和互补突变体的获得及鉴定

4．1 实验材料

4．1．1 菌株

4．1．2 抗生素、培养基及其配制

4．2 实验方法

4．2．1 敲除突变体的获得

4．2．2 敲除突变体的鉴定

4．2．3 互补突变体的获得

4．2．4 互补突变体的鉴定

4．3 实验结果

4．3．2 敲除突变体的筛选及鉴定

4．3．3 互补突变体的筛选及鉴定

4．4 讨论

第五章 棉花黄萎病菌致病相关基因的功能研究

5．1 实验材料

5．1．1 菌株及鉴别寄主棉花

5．1．2 抗生素、培养基及其配制

5．2 实验方法

5．2．1 突变体菌落形态观察和生长速率测定

5．2．2 突变体产孢量和粗毒素含量测定

5．2．3 突变体胞外酶活性的测定

5．2．4 突变体致病力的测定

5．2．5 棉花根系提取物对突变体产孢量的影响

5．2．6 qPCR测定植物组织中的V．dahliae的生物量

5．3 实验结果

5．3．1 突变体菌落形态观察和生长速率测定

5．3．2 突变体产孢量和粗毒素的测定

5．3．3 突变体胞外酶活性的测定

5．3．4 突变体的致病力测定

5．3．5 棉花根系提取物对突变体产孢量的影响

5．3．6 qPCR测定植物组织中的V．dahliae的生物量

5．4 讨论

第六章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历