一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取人纤维蛋白原的制备工艺

摘要

本发明公开了一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取人纤维蛋白原的制备工艺，其特征在于包括：冷沉淀溶解、2%氢氧化铝凝胶吸附、调节离子强度、串联过滤、S/D病毒灭活、离子交换层析、EDTA除Ca2+、甘氨酸沉淀、第一次低温乙醇沉淀、AT-Ⅲ抑制凝血酶、第二次低温乙醇沉淀、纳米膜过滤以及干热灭活。本发明为了确保安全性，除了S/D及干热灭活外，新增纳米膜过滤除病毒；新增AT-Ⅲ灭活凝血酶及EDTA除Ca2+工艺，有效阻止在生产过程中纤维蛋白原激活成纤维蛋白；用甘氨酸沉淀去除制品中的纤维蛋白单体和多聚体，以获得高纯度的人纤维蛋白原；所得制剂产品安全可靠，复溶时间短，满足临床上救急之需，同时间接节约稀缺血浆资源具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取人纤维蛋白原的制备工艺，属于生物制药领域。

背景技术

纤维蛋白原（Fg），由肝细胞合成和分泌，为机体止血生理中重要的凝血因子。贮存稳定性较好，但热稳定性差，在56℃可形成不可逆沉淀，正常人血浆中Fg浓度为2.4～4.0g/L。

Fg作为一种急性时相反应蛋白，其血液含量异常是缺血性心脑血管病等疾病的危险因子。Fg增加往往是机体的一种非特异反应，常见于毒血症、肺炎、胆囊炎、肺结核等感染及肾病综合征、风湿热、恶性肿瘤、脑血栓、心肌梗死等无菌性炎症；另外如外科手术、放射治疗、妊娠期也可见Fg轻度增高。Fg减少较少见，但当其低于1.0g/L时，机体可出现出血征象。一种先天性纤维蛋白原缺乏症是极为罕见的遗传性疾病，通过常染色体隐性基因遗传，此患者肝脏不能合成Fg；继发性纤维蛋白原减少的原因是由于纤维蛋白溶解酶溶解纤维蛋白所致，如胎盘早期剥离，分娩时羊水进入血管形成血栓，引起弥漫性血管内凝血，激活纤维蛋白溶解酶原，使血中纤维蛋白溶解酶活力增加，溶解纤维蛋白，消耗体内原有的Fg，使其含量减少；严重的肝实质损害，如各种原因引起的肝坏死、慢性肝病晚期等也可出现Fg的减少。

临床上Fg主要用于治疗先天性、获得性纤维蛋白原减少或缺乏症，及严重肝脏损伤、肝硬化、弥散性血管内凝血、产后大出血和因大手术、外伤或内出血等引起的凝血障碍。

研究表明冷沉淀中富含纤维蛋白原等凝血因子类物质，400ml全血得到的冷沉淀中纤维蛋白原≥150mg。在血浆原料日趋紧缺的今天，通过冷沉淀来制备人纤维蛋白原，对冷沉淀的综合利用，节约稀缺血浆资源，提高市场竞争力具有重大意义。

现有技术中，传统纤维蛋白原制备工艺于S/D灭活前一般不进行凝胶吸附除杂质，如发明专利《人纤维蛋白原的生产方法》（申请公布号：101703763A）等，或者使用DEAE Sephadex A50凝胶吸附，如发明专利《由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法》（申请公布号：102295696A）。目前仅发现发明专利《从血浆组分沉淀中提取人凝血因子Ⅷ和人纤维蛋白原的工艺》（申请公布号：103351432 A）使用氢氧化铝凝胶，且氢氧化铝添加比例为3g/Kg。DEAE Sephadex A50凝胶在膨胀状态时的机械强度较差，在柱层析中体积和流速会发生变化。

其次，传统制备工艺一般只采用甘氨酸沉淀法或者低温乙醇沉淀法纯化层析后纤维蛋白原液，如《从血浆组分沉淀中提取人凝血因子Ⅷ和人纤维蛋白原的工艺》（申请公布号：103351432 A）、《由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法》（申请公布号：102295696A）采用二步甘氨酸沉淀法纯化得纤维蛋白原；《纤维蛋白原的制备方法》（申请公布号：102286095A）采用二步低温乙醇沉淀法纯化经灭活后的血浆上清液。 

再则，在制备工艺中还应该注意到溶解性和复溶时间等问题。溶解困难甚至溶解后有大量变性蛋白析出，是由纤维蛋白原激活引起的。纤维蛋白原很容易激活，尤其是在Ca²⁺和凝血酶存在的情况下，凝血酶将原本可水溶的纤维蛋白原激活成纤维蛋白单体，后者经聚合，并在Ca²⁺存在下形成不溶于水的纤维蛋白，纤维蛋白再扭结成团，形成纤维蛋白胶，因此，工艺制备过程中容易造成过滤困难及制品复溶时间长。

可见，现有的的人纤维蛋白原仍存在一些问题：（1）纯度不高，产品杂质含量偏多，临床使用易发生播散性血管内凝血、皮疹、心动过速、发热等不良反应；（2）溶解性低，在使用时复溶时间过长，不便于使用，特别是在急救情况下。有些溶解后甚至会有大量变性蛋白析出。大部分产品复溶时间在20分钟左右，有些甚至到达30分钟左右；（3）得率不高，特别是从冷沉淀中提取人纤维蛋白原。

目前，纤维蛋白原市场仍处于短缺状况，开发出新的高纯度和高溶解性的人纤维蛋白原提取工艺显得尤为必要。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种高纯度、复溶时间短的从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取人纤维蛋白原的制备工艺。

本发明的主要技术构思如下：

本发明于S/D病毒灭活前优化添加2%氢氧化铝凝胶进行吸附；

本发明对经层析后的蛋白液经一步甘氨酸沉淀法除纤维蛋白单体、纤维蛋白复合物及纤维蛋白裂解物后，再经二步低温乙醇法纯化，去除杂质蛋白，确保产品纯度进一步提高；

本发明新增添加AT-Ⅲ灭活凝血酶、EDTA去除Ca²⁺、离心去除纤维蛋白单体杂质等步骤，以获得高纯度、复溶时间短的人纤维蛋白原。

本发明的制备工艺，它依次包括：冷沉淀溶解、2%氢氧化铝凝胶吸附、调节离子强度、串联过滤、S/D病毒灭活、离子交换层析；离子交换层析得收集洗脱液，洗脱液经超滤、透析、过滤，用于凝血因子VIII的生产，再从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料即收集经层析柱流出来的液体中提取人纤维蛋白原；依次包括：EDTA除Ca²⁺、甘氨酸沉淀、第一次低温乙醇沉淀、AT-Ⅲ灭活凝血酶、第二次低温乙醇沉淀、纳米膜过滤以及干热灭活。

本发明是这样来实现的，其具体工艺方案如下：

（1）、检疫期检疫合格的人血浆领取后，75%乙醇擦拭血浆袋表面，用注射用水冲洗，合并到融浆罐中，用30～35℃以下循环水融化，血浆温度控制不高于4℃；待融化后，离心，出液温度控制在0~4℃，收集冷沉淀；

（2）、将步骤（1）的制得物加入3IU/ml肝素钠溶液中，搅拌至冷沉淀完全溶解，循环水的温度控制在20～28℃；开始离心，收集上清液，称重；

（3）、将步骤（2）的制得物上清液用0.5mol/L HCL调节PH至6.6～7.2；加入2%氢氧化铝凝胶，搅拌；开始离心，收集上清液，称重；

（4）、按“W（调节离子强度缓冲液）=上清液重量/19”计算，称取计算量的调节离子强度缓冲液至步骤（3）的制得物上清液中；调节上清液PH至6.8～7.5；用调节蛋白浓度缓冲液调节蛋白浓度不大于15.0g/L；用1.0um的滤芯和0.45um的滤芯串联后过滤，收集过滤液，称重；调节离子强度缓冲液的配制方法：48.5g三羟甲基氨基甲烷，1.7g氯化钙，69.0g氯化钠，28.1g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节PH为6.8～7.2；调节蛋白浓度缓冲液的配制方法：量取0.05L调节离子强度缓冲液，加注射用水至1L，调节PH为6.4～6.8；

（5）、按步骤（4）的制得物过滤液体积的1/10加入S/D溶液，搅拌均匀，温度控制在24～26℃，连续保温6小时；0.45um滤芯过滤；过滤液用100KD超滤膜浓缩至蛋白浓度1.5%，然后用蛋白液重量的2倍以上洗涤缓冲液恒体积超滤，得超滤液，称重；洗涤缓冲液的配制方法：2.5g三羟甲基氨基甲烷，1.5g氯化钙，14.5g氯化钠，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节PH为6.4～6.8；

（6）、将步骤（5）的制得物超滤液用离子交换柱进行层析纯化，用洗涤液洗涤柱子直至成基线，用洗脱液洗脱，收集洗脱液（洗脱液经超滤、透析、过滤，用于凝血因子VIII的生产）；收集经层析柱流出来的液体，称量；加入适量0.01mol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）液体溶解，轻微搅拌10小时，温度控制在2～4℃，PH控制在7.1～7.3；离心，收集上清液；洗脱缓冲液的配制方法：2.4g三羟甲基氨基甲烷，0.09g氯化钙，40.9g氯化钠，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节PH为6.4～6.8；

（7）、在步骤（6）收集的液体中，添加适量甘氨酸，使终甘氨酸浓度为6%，温度控制在-1～-3℃，搅拌离心，收集沉淀；沉淀加入10倍量枸橼酸钠、氯化钠缓冲液中，搅拌溶解约30min进行压缩过滤，收集滤液，将滤液温度降温至0～1℃；加-15℃以下的95%乙醇，使乙醇终浓度为8％（V/V），温度控制在-1～-3℃，加完乙醇后pH值为6.95～7.15；搅拌30分钟；离心，离心过程中出液温度控制在-1～-3℃，收集离心后沉淀，称重；枸橼酸钠、氯化钠缓冲液的配制方法：14g枸橼酸钠、9g氯化钠，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节PH为7.00～7.10；

（8）、量取10倍量步骤（7）所述的枸橼酸钠、氯化钠缓冲液，加入AT-Ⅲ达1mU/ml，将步骤（7）的制得物沉淀加入溶解液中，搅拌溶解约30min进行压缩过滤；收集滤液，将滤液温度降温至0～1℃；加-15℃以下的95%乙醇，使乙醇终浓度为8％（V/V），温度控制在-1～-3℃，加完乙醇后pH值为6.95～7.15；搅拌30分钟；离心，离心过程中出液温度控制在-1～-3℃，收集离心后沉淀，称重；

（9）、将步骤（8）的制得物沉淀加入5倍量枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸缓冲液中，搅拌溶解进行压缩过滤；收集滤液，计量；稀配，调整蛋白含量为2.0～3.0℅，调整pH为7.0±0.1；纳米膜过滤（35nm），收集滤液；枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸缓冲液中的配制方法：15.5±0.5g枸橼酸钠、8.5g氯化钠、45g盐酸精氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节PH为6.90～7.10；

（10）、将步骤（9）的制得物滤液经0.2μm除菌滤芯过滤分装；分装好的制品传入冻干柜进行冷冻干燥；出柜扎盖；99～100℃、30分钟干热病毒灭活；送检，检验合格后包装、入库；

所述百分数除有限定之外，其余为质量百分数。

本发明的积极效果：

1、在血浆原料日趋紧缺的今天，通过冷沉淀来制备人纤维蛋白原，对冷沉淀的综合利用，提高市场竞争力具有重大意义，另一方面也能间接节约稀缺血浆资源。

2、在离子交换层析提纯纤维蛋白原的过程中，用适当洗脱液（2.4g三羟甲基氨基甲烷，0.09g氯化钙，40.9g氯化钠，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节PH为6.4～6.8）洗脱下来的溶液，再经超滤、透析、过滤等工序，可用于生产凝血因子Ⅷ。

本发明相比于传统纤维蛋白原的制备工艺，创新点在于： 

1、Ca²⁺存在情况下，可催化凝血酶原变成凝血酶，凝血酶将纤维蛋白原激活成纤维蛋白，造成过滤困难及复溶时间长。为此，本发明第二次低温乙醇沉淀前新增AT-Ⅲ灭活凝血酶及离子交换上样流穿液添加EDTA除去Ca²⁺工艺，并经离心去除纤维蛋白单体等杂质，以获得高纯度、复溶时间短的人纤维蛋白原，能在室温下快速溶解，满足临床上救急之需。本发明工艺，人纤维蛋白原的复溶时间由传统工艺的30min左右，缩短为15min之内。

2、为了确保产品安全性，于S/D灭活前优化添加2%氢氧化铝凝胶进行吸附；除了S/D及干热灭活外，于稀配后、除菌分装前新增纳米膜DV35过滤除病毒。

3、对经层析后的蛋白液经一步甘氨酸沉淀法除纤维蛋白单体、纤维蛋白复合物及纤维蛋白裂解物后，再经二步低温乙醇法纯化，去除杂质蛋白，确保了产品纯度进一步提高，降低不良反应发生率。

4、本发明通过试验得二步-15℃以下冷乙醇沉淀纯化纤维蛋白原时，乙醇最优终浓度为8％（V/V）。

本发明方法制备的产品与《中国药典》（2010年版，三部）中描述的人纤维蛋白原在关键质量指标的对比如下表1。

表1

项目本发明《中国药典》（2010年版，三部）纯度应≥85.0%不低于70.0%复溶时间应在15分钟内完全溶解加入30～37℃灭菌注射用水，轻轻摇动，应于30分钟内完全溶解热稳定性57±0.5℃4小时，肉眼观察应无凝胶化或絮状物复溶后置30～37℃水浴中保温60分钟，应无凝块或纤维蛋白析出。凝固活力应不超过55秒二次测定结果平均值应不超过60秒。渗透压摩尔浓度240～1000mOsmol/kg应不低于240mOsmol/kg

总之，本发明为了确保安全性，除了S/D及干热灭活外，新增纳米膜过滤除病毒；新增AT-Ⅲ灭活凝血酶及EDTA除Ca²⁺工艺，有效阻止在生产过程中纤维蛋白原激活成纤维蛋白；用甘氨酸沉淀去除制品中的纤维蛋白单体和多聚体，以获得高纯度的人纤维蛋白原；所得制剂产品安全可靠，复溶时间短，满足临床上救急之需。对于冷沉淀的综合利用，间接节约稀缺血浆资源具有重要意义。

附图说明

  图1为本发明工艺流程图。

具体实施方式

本发明通过下面的实施例可以对本发明作进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。

实施例1：以20000升血浆为例，具体制备工艺如下：

（1）、检疫期检疫合格的人血浆领取后，75%乙醇擦拭血浆袋表面，用注射用水冲洗，合并到融浆罐中，用30～35℃以下循环水融化，血浆温度控制不高于4℃；待融化后，离心，出液温度控制在0～4℃，收集得冷沉淀136.9kg；

（2）、将步骤（1）的制得物冷沉淀加入3IU/ml肝素钠溶液中，搅拌至冷沉淀完全溶解，循环水的温度控制在20～28℃；开始离心，收集上清液，称重得507.8kg；

（3）、将步骤（2）的制得物上清液用0.5mol/L HCL调节PH至6.6～7.2；加2%氢氧化铝凝胶，搅拌；开始离心，收集上清液，称重得540.2kg；

（4）、按“W（调节离子强度缓冲液）=上清液重量/19”计算，称取计算量的调节离子强度缓冲液至步骤（3）的制得物上清液中；调节上清液PH至6.8～7.5；用调节蛋白浓度缓冲液调节蛋白浓度不大于15.0g/L；用1.0um的滤芯和0.45um的滤芯串联后过滤，收集过滤液，称重得568.7kg；

（5）、按步骤（4）的制得物过滤液体积的1/10加入S/D溶液，搅拌均匀，温度控制在24～26℃，连续保温6小时；0.45um滤芯过滤；过滤液用100KD超滤膜浓缩至蛋白浓度约1.5%，然后用蛋白液重量的2倍以上洗涤缓冲液恒体积超滤，即超滤液，称重得611.6L；

（6）、将步骤（5）的制得物超滤液用离子交换柱进行层析纯化，用洗涤液洗涤柱子直至成基线，用洗脱液洗脱，收集洗脱液（洗脱液经超滤、透析、过滤，用于凝血因子VIII的生产）；收集经层析柱流出来的液体，称量；加入适量0.01mol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）液体溶解，轻微搅拌10小时，温度控制在2～4℃，PH控制在7.1～7.3；离心，收集上清液，称量得614.4L； 

（7）、在步骤（6）收集的液体中，添加适量甘氨酸，使终甘氨酸浓度为6%，温度控制在-1～-3℃，搅拌离心，收集沉淀；沉淀加入10倍量枸橼酸钠、氯化钠缓冲液中，搅拌溶解约30min进行压缩过滤，收集滤液，将滤液温度降温至0～1℃；加-15℃以下的95%乙醇，使乙醇终浓度为8％（V/V），温度控制在-1～-3℃，加完乙醇后pH值为7.00～7.10；搅拌30分钟；离心，出液温度控制在-1～-3℃，收集离心后沉淀，称重得31.5kg；

（8）、量取10倍量步骤（8）所述的枸橼酸钠、氯化钠缓冲液，加入AT-Ⅲ达1mU/ml，将步骤（7）的制得物沉淀加入溶解液中，搅拌溶解约30min进行压缩过滤；收集滤液，将滤液温度降温至0～1℃；加-15℃以下的95%乙醇，使乙醇终浓度为8％（V/V），温度控制在-1～-3℃，加完乙醇后pH值为7.00～7.10；搅拌30分钟；离心，出液温度控制在-1～-3℃，收集离心后沉淀，称重得23.1kg；

（9）、将步骤（8）的制得物沉淀加入5倍量枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸缓冲液中，搅拌溶解进行压缩过滤；收集滤液，计量得135L；稀配，调整蛋白含量为2.0～3.0℅，调整pH为7.0±0.1；纳米膜过滤（35nm），收集滤液，称量得173.2L； 

（10）、将步骤（9）的制得物滤液经0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装装量为每瓶25mL，分装数量为6765瓶；分装好的制品传入冻干柜进行冷冻干燥；出柜扎盖；99～100℃、30分钟干热病毒灭活；送检，检验合格后包装、入库；

所述百分数除有限定之外，其余为质量百分数。

经本实施例制备出的产品的检定结果参见下表2～表6。

表2：复溶时间测定

表3、渗透压摩尔浓度测定

表4：稳定性试验

表5、凝固活力测定

表6 ：纯度及纤维蛋白原总量测定

1、样品蛋白质含量测定：

2、样品可凝固蛋白质含量测定：取复溶后样品10.0 ml，加生理氯化钠稀释至50  ml，取稀释后样品 5.0 ml，加生理氯化钠5.0 ml，加入每ml含3IU凝血酶溶液（含0.05mmol/L氯化钙）10.0 ml。混匀。置37℃水浴 20 分钟，分离凝固蛋白，再将凝固蛋白准入消化管中。

3、结果计算：

3.1纤维蛋白原纯度（%）=可凝固蛋白质含量/蛋白质含量×100

                       =2.16% /2.54 ×100=85.1%

3.2纤维蛋白原总量（g/瓶）=可凝固蛋白质含量×样品标示溶解体积

                         =2.16% ×25=0.5g/瓶。