一种基于LAMP技术对多菌灵高抗灰葡萄孢菌株的快速检测方法

摘要

本发明公开了一种对多菌灵高抗灰葡萄孢菌株的快速检测方法，可用于引起作物灰霉病的灰葡萄孢菌对多菌灵的抗性群体的动态监测及流行预警。本发明是以环介导恒温扩增技术(LAMP)为基础建立起来的一种快速、便捷、特异性强、灵敏度高和成本低廉的分子检测技术。该检测方法通过在灰葡萄孢菌对多菌灵的高抗菌株的β微管蛋白上设计2对特异性引物，进行LAMP扩增，根据反应产物颜色判定是否为灰葡萄孢菌对多菌灵的高抗菌株。LAMP扩增产物显示为天蓝色，电泳图谱呈梯状条带，有产物扩增，鉴定为灰葡萄孢菌对多菌灵的高抗菌株；LAMP扩增产物显示为紫色，电泳图谱无条带，无产物扩增，鉴定为灰葡萄孢菌对多菌灵的非高抗菌株。本发明简便、快速、成本低，对作物灰霉病的抗性风险评估及合理用药具有重要的现实意义。

说明书

技术领域

本发明是基于环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)对灰 葡萄孢菌的多菌灵高等抗性水平菌株的快速分子检测方法，可用于灰葡萄孢菌对多菌灵抗性 群体发展的动态监测与抗性风险评估，为灰霉病的抗性治理、流行预警及合理用药指导提供 重要的理论依据。

背景技术

环介导恒温扩增反应(LAMP)是2000年由日本学者Notomi等发明的一种新颖的恒温 核酸体外扩增技术，广泛应用于动物、植物等疾病的基因诊断。该技术原理是：利用一套(4 种)特异性引物，在一种高活性链置换DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃ 范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。羟 基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色， 阴性(没有扩增出产物)时为紫色，阳性(有产物扩增)时为天蓝色。LAMP方法的最大特 点就是实现恒温扩增，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成； 扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性 强；操作简便、快捷，极适于病原的快速诊断及抗性检测。

灰霉病是一类由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的植物真菌病害，可危害200多种蔬菜、 果树以及观赏性植物等重要的经济作物，该病的发生可引起植物幼苗、果实及贮藏器官的猝 倒、落叶、花腐、烂果及烂窑，造成严重的经济损失。近年来，随着保护地蔬菜生产的发展， 加重了灰霉病的发生和流行。目前由于作物种质资源缺少高抗灰霉病的品种，采用化学药剂 是控制灰霉病最有效方便的途径之一。多年来，灰霉病主要采用苯并咪唑类杀菌剂或以这类 药剂为主的复配剂进行防治。但是随着使用年限的增长的使用剂量的增加，田间逐渐产生了 抗药性群体，从而导致该病防效显著下降。经过多年的研究，南京农业大学杀菌剂生物学实 验室发现灰葡萄孢菌对多菌灵的抗药性菌株主要是由灰葡萄孢菌β-微管蛋白基因 (BC1G_00122)突变造成，该基因编码第198位氨基酸密码子的突变可引起灰葡萄孢菌对多 菌灵高等抗药性的产生。198位氨基酸的突变可分为3种突变基因型，分别为GAG(Glu) →GCG(Ala)、GAG(Glu)→AAG(Lys)和GAG(Glu)→GTG(Val)，约占所有抗药性 突变类型总量的96％，成为病原菌产生田间抗药性的主要原因。

病原菌在自然界的数量巨大，抗药性个体在群体中的比例达到3％时，即可引起抗药性病 害流行，导致药剂防治失败。传统的检测方法需要分离培养病原菌，然后在含药培养基上培 养，再根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴别抗药性。本发明在抗药性机制研究的基础上，基 于LAMP技术能快速、准确检测灰葡萄孢菌对多菌灵的抗药性。该检测方法具有简单、快速、 成本低，灵敏性高等特点，能大大提高检测效率，对灰霉病的有效防治、抗药性流行预警具 有重要的现实意义。然而，经检索目前国内外尚未有灰葡萄孢菌对多菌灵高抗菌株的LAMP 快速分子检测的相关报道。

发明内容

已报道的灰葡萄孢菌对多菌灵抗性菌株的鉴定及检测方法存在费时、费力、成本高的缺 点。针对这一缺点，根据灰葡萄孢菌对多菌灵高抗菌株的基因型，通过实验条件优化，建立 了一种快速检测灰葡萄孢菌对多菌灵高抗菌株的方法。该方法具有简便、快速、省时省力、 灵敏度高、检测成本低等特点，对灰霉病的抗药性监测、控制病害发生与流行、指导合理用 药及减少经济损失具有实用价值。目前在国内外，本发明是LAMP技术在灰葡萄孢菌对多菌 灵抗性检测中的首次报道。

田间采集的多菌灵抗性灰葡萄孢菌株的96％左右的突变类型是由于灰葡萄孢菌的β微管 蛋白基因编码的第198位氨基酸密码子突变造成的。该位点的突变可分为3种突变基因型， 分别为GAG(Glu)→GCG(Ala)、GAG(Glu)→AAG(Lys)和GAG(Glu)→GTG(Val)。 本发明所述的快速检测灰葡萄孢菌对多菌灵高等抗性水平菌株的分子生物学方法，可同时检 测上述3种突变基因型，步骤是：

(1)在灰葡萄孢菌的β微管蛋白基因上包括198位氨基酸的序列设计1对外引物和1对 内引物，利用该引物在恒温条件下，进行LAMP扩增；

①LAMP反应所用的外引物对：

F3：GCAACTCTCTCTGTCCATCAA

B3：GCCAACTTTCGGAGATCTGA

②LAMP反应所用的内引物对：

FIP：GGTTGCTGAGCTTCAAGGTTCTCAGGTTGAGAACTCTGACAYGAC

BIP：TCTTAACCACTTGGTTTCCGCCGAAGTTGACCAGGGAAACGG

③LAMP最佳反应体系及条件：

反应体系(10μL)：

反应条件：

62℃60min，80℃10min；

(2)对上述LAMP扩增产物观察其颜色变化，并在3.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观察 扩增结果；

(3)鉴定是否为多菌灵高抗的灰葡萄孢菌株；LAMP扩增产物显示天蓝色，电泳图谱应 为梯状条带，判定为多菌灵高抗的灰葡萄孢菌株；扩增产物为紫色，电泳图谱无条带扩增， 判定为多菌灵非高抗的灰葡萄孢菌株。

本发明提供的快速检测对多菌灵高抗的灰葡萄孢菌的分子生物学方法，具有灵敏度高， 特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是：

1、简便易行：该检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行实验，通过反应 产物颜色变化即可判定结果，省去了昂贵的仪器设备及繁琐的电泳过程；

2、检测高效性：该检测方法所用检测时间仅需1小时，大大提高了检测效率，而传统的 室内生物测定法需要几天时间，PCR检测需要繁琐的电泳过程，也要数小时；

3、灵敏度高：将构建的质粒载体稀释成不同的浓度，作为模板，进行灵敏度检测，最低 检测下限为普通PCR检测下限的10倍；

4、特异性强：该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于PCR 引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之降低；

5、准确性高：该方法几乎不受反应混合液中存在的大量外源DNA和杂质的影响，不需 要从样本中纯化DNA，可直接利用发病组织及病残体提取DNA进行快速检测，大大提高检 测准确度；

6、本发明是国内外首次利用LAMP技术对多菌灵高抗灰葡萄孢菌株进行检测，这种方 法简便快捷，对抗性菌株的准确诊断、及时了解抗性群体发展动态、指导科学用药、降低成 本及减少环境污染具有重要的现实意义；

7、对所采集的96株灰葡萄孢菌对多菌灵抗性菌株的LAMP检测结果与传统的室内生物 测定法鉴定结果及PCR扩增后克隆测序结果完全吻合。

附图说明

图1：LAMP检测的反应温度优化

图2：LAMP检测的反应时间优化

图3：LAMP检测的灵敏度优化

图4：LAMP检测的特异性优化

图5：LAMP检测的重复性优化

具体实施方式

实施例1LAMP反应体系优化

为了节省检测成本，保证该检测方法的稳定性和可靠性，对反应体系中Bst DNA聚合酶 (8U/μL)(0.8-4.0U)、Mg²⁺(25mM)浓度(0.6-2.0μL)、引物FIP/BIP(40μM)及F3/B3 (10μM)浓度(0.1-0.5μL)，甜菜碱(8M)浓度(0.4-2.0μL)、HNB(2.5mM)浓度(0.4-1.2 μL)进行了优化，确定了最佳反应体系为：Bst DNA聚合酶(8U/μL)0.3μL，10×ThermoPol 1μL，MgCl₂(25mM)1.4μL，dNTP(10mM)1.0μL，FIP(40μM)0.3μL，BIP(40μM) 0.3μL，F3(10μM)0.2μL，B3(10μM)0.2μL，甜菜碱(8M)0.8μL，HNB(2.5mM) 0.8μL，基因组DNA 0.4μL，无菌ddH₂O 3.3μL。

实施例2LAMP反应条件优化

为了得到最适的反应温度和时间，保证该检测方法的高效性，对反应参数中的反应温度 及时间进行了优化，在反应温度和时间分别为58-65℃(图1)和45-90min(图2)的条件均 有DNA条带扩增，其中在62℃和60min时DNA条带丰度较大，因此得出最佳反应温度和 时间分别为62℃和60min。

实施例3LAMP反应灵敏度检测

为了确定LAMP反应的检测下限，本实验PCR扩增含有198位突变位点的DNA片段， 将该片段克隆至载体pMD-18，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子，提取质粒后，测定浓度后， 以10倍梯度稀释作为模板，分别进行LAMP及PCR扩增。最终得出，LAMP的最低检测下 限为普通PCR检测下限的10倍(图3)。

实施例4LAMP反应特异性检测

以灰葡萄孢菌对多菌灵高抗菌株(3种基因型：E198A，E198K，E198V)、中抗菌株(基 因型F200Y)和野生型菌株的基因组DNA为模板分别进行LAMP扩增。当模板为高抗菌株 时，反应产物颜色为天蓝色，电泳图谱成梯状条带(图4)；当模板为野生型菌株和中抗菌株 时，反应产物颜色为紫色，电泳无条带(图4)，上述结果表明该检测方法结果可靠，特异性 强。

实施例5LAMP反应重复性检测

对采集不同地理位置的13个多菌灵高抗的灰葡萄孢菌株基因组DNA为模板进行LAMP 检测，以野生型为对照，结果显示13个实验样品的反应颜色均为天蓝色，电泳图谱均呈梯状 条带(图5)。并经过突变基因的测序结果表明，13个样品均在β微管蛋白序列的198位发生 点突变。上述结果表明该检测方法结果可靠，重复性好。

本发明所建立的检测方法能准确、快速检测出灰葡萄孢对多菌灵高抗的菌株，为科学研 究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的检测技术，也为灰霉病对多菌灵抗性群体 的动态监测，抗药性病害的流行预警及合理用药提供了理论基础和技术指导。