用于治疗神经变性疾病的天竺葵精油及其成分

摘要

本发明涉及有效量的Pelargonium graveolens精油或提取物或它的成分用于制备治疗患有或易患上神经变性症状的哺乳类动物的药物的用途，所述成分是选自：(S)(-)香茅醇、沉香醇、薄荷酮、异薄荷酮或者它们的任意组合，所述神经变性症状可通过抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)而被改善或被预防。

说明书

技术领域

本发明涉及用于治疗神经变性疾病的天竺葵精油制剂，特别是涉及能通过抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)而改善或预防神经变性疾病的天竺葵精油制剂。

背景技术

精油是民间药物，近年来，它们的用途已经全局扩展为包括对于多种类型的炎症疾病的治疗，例如，过敏、风湿、关节炎和支气管炎。这些活性作用主要是通过临床经验来认识的，但也有少量的实验性解释。

天竺葵精油是香水行业最重要的天然原料之一。它被用于生成玫瑰色产品，特别在香皂中。主要的产地是留尼旺岛和马达加斯加岛(波旁类型)，摩洛哥和埃及(北非类型)以及中国。

天竺葵精油是通过开花的草本植物Pelargonium graveolens l’Heritier exAiton,P.roseum Wilidenow蒸汽蒸馏法获得的，其他未定义的混合物已经在不同地理区域开发成为不同生态类型。该精油是琥珀色的，制成黄绿色液体，带有植物的特征性的玫瑰香气。

文献Maruyama et al.,Mediators Inflamm.2006；2006(3):62537教导了注射天竺葵精油抑制卡拉胶诱导的脚部水肿，以及增加组织髓过氧化酶活性，重复给药天竺葵精油可抑制胶原诱导的关节炎。

根据文献Abe et al.,Mediators of Inflammation,13(1),21-24(February 2004)，聚集进入小鼠腹膜腔的白细胞可通过腹腔内注射Pelargonium asperum而得以抑制。

公开号为20080268078的美国专利报道了：通过注射包括丁烯基、苯酞、香茅醇和香叶醇的天竺葵植物提取物，一氧化氮(NO)和前列腺素E2合成被抑制和/或减少。

根据文献Elmann et al.,Journal of Functional Foods 2(2010)17–22，采用小神经胶质细胞的初级培养物来测试天竺葵精油的抗神经炎性效果。天竺葵精油抑制NO产生，也抑制炎性酶环氧合酶-2(COX-2)，并在活化的小神经胶质细胞的初级培养物中诱导一氧化氮合成酶(iNOS)。

帕金森病(PD)是在阿尔茨海默病之后的第二位最流行的神经退行性疾病。临床上，它的主要特征包括：颤抖、肌肉强直、随意运动缓慢和姿势不稳。虽然PD神经病理学包含多种不同神经递质通路，上述的致残表现是被认为是主要由于脑中的多巴胺神经元丢失引起的(Nat Protoc.2007；2(1):141-51)。在脑中的不同多巴胺能的系统之间，上升的黑质纹状体通路已经被一致地识别为在PD中最严重的损伤，由于黑质纹状体多巴胺能神经元的死亡而凸显。

阿尔茨海默病是与脑中胆碱能神经元的选择性丢失有关的(Davies andMaloney,Lancet.1976Dec 25；2(8000):1403；Whitehouse et al.,Ann Neurol.1981Aug；10(2):122-6))。这些神经元的丢失是通过在神经递质乙酰胆碱的减少以及在感受性酶的减少而产生的，感受性酶合成和降解乙酰胆碱，例如乙酰胆碱基转移酶和乙酰胆碱酯酶(AChE)(Perry et al.,Lancet.1977Jan 22；1(8004):189；Bowenet al.,J Neurol Sci.1982Dec；57(2-3):191-202)。这些观察结果形成了阿尔茨海默病的胆碱能假说(Bartus et al.,Science.1982Jul 30；217(4558):408-14)，它假定：患有该病的病人经历至少一些认识能力下降，这是由于乙酰胆碱的缺乏导致的，因此导致胆碱能神经递质的缺失。这个假说建议，抑制AChE可提升在病人脑中的乙酰胆碱的水平，逆转认识能力下降(Muramoto et al.,Arch Neurol.1979Aug；36(8):501-3)，实验证据也支持这个建议(Camps et al.,Mol Pharmacol.2000Feb；57(2):409-17)。

乙酰胆碱酶抑制剂，例如和，都被用作对于轻度至中度的阿尔茨海默病的标准治疗，在阿尔茨海默病的症状上显示这个类别的药物的治疗效果。

文献Umezu T,Phytother.Res.26:884–891(2012)教导了：Pelargoniumgraveolens精油在小鼠的离散穿梭类型的条件性回避反应上不会产生任何效果(摘要)。这个离散穿梭类型的条件性回避反应是有用于区别CNS刺激物和CNS镇静剂。

现在令人惊喜地发现，Pelargonium graveolens精油以及它的成分对于预防和改善具有神经变性疾病的症状具有良好的效果。

发明内容

本发明涉及P.graveolens精油或提取物用于治疗神经变性疾病的用途。

已经发现，P.graveolens精油可被用作AChE抑制剂。也已经发现，选自以下的P.graveolens成分可被用作AChE抑制剂：(S)(-)香茅醇、沉香醇、薄荷酮、异薄荷酮。

发明人证实，仅对映异构体(S)(-)香茅醇能抑制乙酰胆碱酯酶的酶活性，而(R)(+)香茅醇则不能。当将这些结果与相同对映异构体在小神经胶质细胞内的活性氧簇(ROS)上的效果进行比较时，该结果是相当意外的。虽然在这两种对映异构体在ROS产生上都显示出显著减少(图1)，但仅有对映异构体(S)(-)香茅醇能显示出抑制乙酰胆碱酯酶的酶活性(图2和图3)。

本发明涉及有效量的任意一种Pelargonium graveolens成分在制备用于治疗患有或易患上神经变性症状的哺乳类动物的药物的用途，所述Pelargoniumgraveolens成分是选自：(S)(-)香茅醇、沉香醇、薄荷酮、异薄荷酮或者它们的任意组合；所述神经变性症状可通过抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)而被改善或被预防。

本发明还涉及有效量的任意一种上述Pelargonium graveolens成分用于治疗神经变性症状的用途，所述神经变性症状是选自：阿尔茨海默病、帕金森病、帕金森痴呆(PDem)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、神经性厌食、外伤性脑损伤(TBI)以及帕金森病伴认知障碍(CIND-PD)。

本发明还涉及用于治疗神经变性症状的Pelargonium graveolens精油，所述神经变性症状是选自：阿尔茨海默病、帕金森病、帕金森痴呆(PDem)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、神经性厌食、外伤性脑损伤(TBI)以及帕金森病伴认知障碍(CIND-PD)。

附图说明

图1显示天竺葵精油的对映异构体(S)(-)香茅醇(图1A)和(R)(+)香茅醇(图1B)在初级小胶质神经细胞内过氧自由基诱导的DCFH氧化上的效果。

图2显示在以天竺葵精油的不同成分以及以天竺葵精油自身培育后的乙酰胆碱酯酶的活性。

图3显示在以香茅醇的不同对映异构体培育后的乙酰胆碱酯酶的活性。

图4显示香叶醇、香茅醇(+)和香茅醇甲酸盐对于人细胞的乙酰胆碱酯酶的效果。

图5显示了天竺葵精油对于MPTP-PD小鼠的体重的效果。

图6显示天竺葵精油对于MPTP-PD小鼠的转棒(Rota-Rod)潜伏期(图6A)和距离(图6B)的效果。

图7显示天竺葵精油在MPTP诱导的帕金森病小鼠的社会识别上的效果。

图8显示天竺葵精油在塞梅林氏神经节(黑质)内对于多巴胺能神经元数量的效果。

具体实施方式

P.graveolens的精油或提取物或它们的成分被期望可导致在病人的大脑皮层和/或海马体和/或纹状体和/或整个大脑的乙酰胆碱含量的显著增加，所述成分是选自：(S)(-)香茅醇、沉香醇、薄荷酮、异薄荷酮。

可采用传统方法制备P.graveolens的提取物。一个示例性的提取方法将在下面进行说明。总的来说，制备方法包括：(1)干燥所选择的植物部分，研磨所干燥的植物部分成为细粉末；(2)将植物粉末与抽提溶剂相混合；(3)离心去除植物残留物，选择溶液上清；(4)通过旋转蒸发去除残留上清中的溶剂和水，干燥。本领域的普通技术人员应当认识到：该方法可以适当改变，例如，从小量的、或实验室的、批量的提取到商业化规模的方法。对于提取的目的，干燥过程也可以是不必需的。新鲜植物材料可被直接采用溶剂抽提，而无需干燥步骤。干燥的植物部分提供了运输和储藏的优势；然而，来自风干的植物提取物的活性会比冻干的提取物的活性更低，这可能是由于在风干作业时对成分的破坏程度增加所致。

抽提溶剂可以是微极性流体。“微极性”流体是指低等至中等极性的流体，正如本领域所熟知的。这里所用的微极性是指电极的中等不规则分布，它的特征是弱亲水性至平均程度。微极性流体包括所有直链和支链的初级醇和它们的化学衍生物，提供的附加化学基团不会破坏流体的极性或增加流体的极性至水的极性水平，它明确地不包括在微极性流体的定义中。优选的微极性流体是液体，例如低分子量、直链初级醇(例如乙醇)。水不是微极性流体，而是高极性水性流体。然而，水与微极性流体(例如乙醇)的混合物自身是微极性流体。后者的流体的一个例子是60％乙醇。多种的微极性流体(例如乙醇)可被用于从所选择的植物部分提取有效物质，包括甲醇、乙醇和异丙醇。当采用乙醇时，终产物是乙醇提取物。

在一个优选的具体实施例中，P.graveolens可以是精油的形式。该精油可以是从新鲜草本植物的叶子蒸汽蒸馏或水蒸馏一个小时，在130L直接蒸汽实验厂装置或在改良的分离装置中分别提取。

正如已经概述的，AChE的抑制剂可提升乙酰胆碱在这些病人的脑中的水平，并逆转它们的下降行为。

在一个优选的具体实施例中，P.graveolens的提取物或植物精油是用于治疗神经变性疾病的组合物中的唯一活性成分。在另一个优选实施例中，P.graveolens的提取物或植物精油是用于治疗神经变性疾病的唯一活性成分。

在另一个优选实施例中，活性成分的任意组合，也即是活性成分(S)(-)香茅醇、沉香醇、薄荷酮、异薄荷酮可被用于治疗神经变性疾病。

乙酰胆碱酯酶抑制物(例如，他克林，多奈哌齐，利伐司替明和加兰他敏)都广泛用于改善阿尔茨海默病的识别能力，并在路易体痴呆中显示有希望的临床结果。

病理学报告已经表明，在帕金森痴呆(PDem)中的前脑胆碱能神经元的缺失等于或大于在阿尔茨海默病(AD)中的前脑胆碱能神经元的缺失。文献Bohnenet al.,Arch Neurol.2003；60(12):1745-1748显示，与对照相比较，平均脑皮层AChE活性是在患有PDem的病人中最低的(-20.0％)，跟随患有帕金森病但无痴呆的病人(-12.9％；P<.001)。在体内，关于脑皮层乙酰胆碱酯酶(AChE)活性，在健康对照对象与患有轻微AD、PDem和没有痴呆的帕金森病的患者中采用AChE正电子发射断层扫描而被确定。因此，本发明的具体实施方式是P.graveolens精油或提取物的用途，(S)(-)香茅醇、沉香醇、薄荷酮、异薄荷酮在制备治疗帕金森痴呆(PDem)和没有痴呆的帕金森病的药物的用途。

文献Bohnen et al.,J Neurol Neurosurg Psychiatry 2007；78:641–643研究了在退行性症状的评级与在患有帕金森病(PD)和帕金森痴呆(PDem)的病人的体内脑皮质乙酰胆碱酯酶(AChE)活性之间的关系。PD和PDem患者，经受[11C]甲基-4-哌啶丙酸盐AChE正电子发射断层扫描成像以及包括康奈尔痴呆抑郁量表(CSDD)的临床评估。Bohnen等人总结：抑郁症状是与PD患者的脑皮层胆碱能去神经相关联的。

根据文献Ballard et al.,Drugs Aging.2011Oct 1；28(10):769-77，胆碱酯酶抑制剂利伐司替明随机对照试验(RCTs)已经表明，在识别、功能、全局性成果与在帕金森病痴呆(PDD)和路易体痴呆(DLB)中的神经精神性症状的适度的但显著的效果。因此，另一个具体实施例是P.graveolens精油或提取物(S)(-)香茅醇、沉香醇、薄荷酮、异薄荷酮在制备治疗帕金森病痴呆(PDD)和路易体痴呆(DLB)的药物中的用途。

患有神经性厌食的病人表现出妥协的情感，其特征为轻度狂躁、狂躁和抑郁症状，他们的胆碱能系统是被改变为乙酰胆碱释放量的降低(xpert Opin.Investig.Drugs(2009)18(5):569-571)。因此，本发明的另一个具体实施方式是P.graveolens精油或提取物(S)(-)香茅醇、沉香醇、薄荷酮、异薄荷酮在制备治疗神经性厌食的药物中的用途。

伴随外伤性脑损伤(TBI)的记忆损伤也被较好地认识，它很难治疗，特别对于那些经历过持续性失忆症的TBI幸存者。文献Morey et al.,Brain Injury,VOL.17,NO.9,Sept.2003,809–815报告了乙酰胆碱酯酶抑制剂安理申(盐酸多奈哌齐)可潜在地有用于治疗这种记忆问题。根据Morey等人的报道，通过在中枢神经系统抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)功能，安理申可增加在后合成受体上的乙酰胆碱可用性，已经显示出在治疗患有AD的病人的记忆损失的症状，最近以来，在治疗患有TBI的病人的记忆损失症状上是有效的。因此，本发明的另一个具体实施方式是P.graveolens精油或提取物(S)(-)香茅醇、沉香醇、薄荷酮、异薄荷酮在制备治疗在AD患者和TBI患者的记忆丧失的药物中的用途。

根据文献Rolinski M et al.Cochrane Database Syst Rev.(2012)，目前可用的证据支持乙酰胆碱酯酶抑制剂在患有帕金森病痴呆(PDD)和帕金森病伴认知障碍(CIND-PD)的认知缺损的用途，具有在全局评估、识别功能、行为障碍和日常生活活动的等级量表。因此，本发明的另一个具体实施方式是P.graveolens精油或提取物(S)(-)香茅醇、沉香醇、薄荷酮、异薄荷酮在制备治疗帕金森病痴呆(PDD)和帕金森病伴认知障碍(CIND-PD)的药物中的用途。

因此，根据本发明所述，可通过抑制AChE而改善或预防任意神经变性症状可被包括在本发明的范围之内。

图1显示了天竺葵精油的成分(S)(-)香茅醇与(R)(+)香茅醇在小胶质神经细胞中抑制对映异构体自由基诱导的DCFH氧化。小胶质神经细胞是以(S)(-)香茅醇(图1A)和(R)(+)香茅醇(图1B)培育一小时。小胶质神经细胞的初级培养物已经根据Elmann et al.,Journal of Functional Foods 2(2010),pp.18制备出来。正如在文献Elmann et al.BMC Complementary and Alternative Medicine 2011,11:98中所述，小胶质神经细胞的培养物然后以非荧光细胞渗透化合物2'7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)预负荷30分钟，以PBS清洗，之后加入2,2'-偶氮二异丁基脒(ABAP)(0.6mM)，在指定的时间点测定ROS水平。在图中的每个点表示2个实验(n＝8)的平均±SEM。

正如已经描述的，发明人已经意外地发现：仅对映异构体(S)(-)香茅醇能抑制乙酰胆碱酯酶的酶活性，而(R)(+)香茅醇则不能。这些意外发现的结果是通过实例说明的，例如，当将相同的对映异构体在小胶质神经细胞中对活性氧簇(ROS)上的效果进行比较时，该结果是相当意外的。虽然在这两种对映异构体在ROS产生上都显示出显著减少(图1)，但仅有对映异构体(S)(-)香茅醇能显示出抑制乙酰胆碱酯酶的酶活性(图2和图3)。

术语“神经变性症状或疾病”是指涉及神经功能逐渐丧失的任意症状或疾病。

这里所采用的术语“治疗”是与对象的神经变性疾病相关的，是指本发明所述的化合物、精油或提取物或药物组合物减少或消除神经变性疾病的症状和/或病因。

这里所采用的术语“预防”是与对象的神经变性疾病相关的，是指本发明所述的化合物、精油或提取物或药物组合物基本上预防和/或减少神经变性疾病的症状，而在未采用本发明所述的化合物、精油或提取物或药物组合物治疗的对象中症状会恶化。

术语“精油”是指通过以水或蒸汽来蒸馏制成的产品，或通过柑橘皮的机械加工制成的产品，或通过天然原料的干馏制成的产品。在蒸馏之后，精油是从水相物理地被分离的。

在所有治疗性应用中，除非另外说明，术语“Pelargonium graveolens”是指未分离植物的活性成分的Pelargonium graveolens精油或提取物。术语“Pelargonium graveolens成分”是指Pelargonium graveolens的特定的活性成分。

应用PET来确定治疗效果是否通过抑制AChE而导致的：

正电子发射断层扫描(PET)技术可测量AChE功能活性，它提供了确定体内胆碱能神经支配在神经变性疾病的早期阶段的预期。例如，在患有AD的人脑中的乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性已经采用PET和1-[11C]甲基哌啶-4-丙酸盐([11C]PMP)和N-[11C]甲基哌啶-4-丙酸盐放射性配体来绘图(Bohnen et al.,Arch Neurol.2003；60(12):1745-1748)。

因此，对于与乙酰胆碱水平下降相关联的神经变性疾病，PET技术结合已知的特别用于评估患者的神经变性疾病的状况的试验可被用于确定患者的症状改善是否AChE抑制的结果。因此，可在给药P.graveolens或它的成分之前与之后进行这个结合的测试(即，(1)PET和(2)用于评估患者状况的测试)。例如，为了评估在抑郁症状的等级与患有帕金森病(PD)和帕金森痴呆(PDem)的患者体内脑皮层的乙酰胆碱酯酶(AChE)活性之间的关系，PET可与康奈尔痴呆抑郁量表(CSDD)相结合。对于TBI，在于PET一起进行的基线测试期间，可进行特征试验(Token Test)与波士顿命名测试(Boston Naming Test)。对于路易体痴呆和帕金森病痴呆，DLB和PDD的随机对照试验(RCTs)可以与PET一起进行。而且，所有这些结合的测试可在给药P.graveolens或它的成分之前和之后进行。

药物组合物的制备是本领域已知的，例如，在雷明登氏药学全书(Remington'sPharmaceutical Sciences)(第18版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990)和美国国家药典(Pharmacopeia:National Formulary)(Mack出版社，Easton,Pa.,1984)。例如，化合物可被制备为以下多种形式的药物组合物：例如，水溶液、油性制剂、脂肪乳剂、乳剂、凝胶等，这些制备物可以肌肉注射或皮下注射而被给药，或者注射入器官，或作为嵌入式制剂或作为穿过鼻腔、直肠、子宫、阴道、肺等的转化粘液质的制剂来给药。该组合物可以口服制剂的形式来给药(例如，片剂、胶囊、颗粒或粉末等固体制剂；糖浆、乳剂或悬浮液等液体制剂)。包含所述化合物的组合物也可包括：防腐剂、稳定剂、分散剂、pH调节剂或等渗剂。合适的防腐剂的例子是：甘油、丙二醇、苯酚或苯甲醇。合适的稳定剂的例子是：葡聚糖、明胶、α-生育酚醋酸酯或α-二羟丙硫醇。合适的分散剂的例子包括：聚氧乙烯(20)、去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)、去水山梨糖醇单油酸酯(司盘30)、聚氧乙烯(160)聚氧乙烯(30)乙二醇(聚醚F68)或聚氧乙烯氢化蓖麻油60。合适的pH调节剂的例子包括：盐酸、氢氧化钠以及类似物。合适的等渗剂的例子是：葡萄糖、D-山梨醇或D-甘露醇。该组合物也可包含其他组分或添加剂，例如药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、悬浮剂、润滑剂、媒介物、传送系统、乳化剂、崩解剂、吸附剂、防腐剂、表面活性剂、着色剂、香料或甜味剂，考虑将被给药的组合物的物理和化学特性。

在另一个具体实施例中，P.graveolens精油是用于治疗例如帕金森病的神经变性疾病的组合物的单一活性成分。

在又一个具体实施例中，任意一种选自以下的Pelargonium graveolens组分：(S)(-)香茅醇、沉香醇、薄荷酮、异薄荷酮或者它们的任意组合，在用于治疗神经变性疾病的组合物中是单一活性成分。

在另一个具体实施例中，本发明提供了药物组合物，用于治疗帕金森病的用途。在另一个具体实施例中，本发明提供了药物组合物，用于预防帕金森病的恶化的用途。这个预防是在显示帕金森病症状的病人中由神经细胞凋亡的终止来反映的。与用于预防神经细胞凋亡伴随而揭示的结果(参见实施例7)是令人惊喜的。在预防多巴胺能神经细胞的直接和显著效果是发明人所意外发现的。

MPTP模型

为了说明P.graveolens在治疗帕金森病中的治疗效果，发明人已经采用了MPTP模型。在多种PD的毒性模型中，MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)模型已经称为最普遍使用的模型。MPTP是仅有的已知的多巴胺能的神经毒素，能导致在人类和猴子难以与PD区别的临床图片。第二，虽然处理MPTP需要一系列预防措施，它的应用不会遇到其他技术挑战：不需要任意特殊设备，例如立体定位架，也不需要在活动物上进行外科手术，关于羟多巴胺或者鱼藤酮。第三，MPTP产生了黑质纹状体多巴胺能通路的可靠的可重复的损伤，在它的系统给药之后，它通常不是其他记录的毒药的例子。MPTP导致在人类和灵长目的帕金森特征，作为在黑质纹状体通路的多巴胺能变性的结果。它的神经毒性效果也显示为参与能源耗损和自由基产生。MPTP是通过单胺氧化酶B(MAO-B)而被转变为它的代谢产物MPP+。MPP+是由高亲和性多巴胺转运体来选择性积聚，并被带到多巴胺能神经元的线粒体中，它通过抑制线粒体电子传递链的复合物I而中断了氧化磷酸化。这样导致ATP产生的障碍，提升了细胞内钙水平，和促使自由基产生。因而展示了多巴胺能的神经毒性。因此，MPTP是被广泛用作研究导致在帕金森病的动物模型中多巴胺能神经元的变性的分子事件的工具，并作为测试潜在的神经保护剂的工具。

天竺葵(P.graveolens)精油在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中的临床前评价。

在本发明的说明中，正如应用于小鼠，天竺葵(P.graveolens)精油的临床前疗效是在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导帕金森病的C57BL/6小鼠模型中被评估的(该患有帕金森病的小鼠现在被称为“MPTP PD小鼠”)。MPTP被注射到C57BL/6小鼠(每组11-13只小鼠)，在起始的5天(第1-5天)期间每天向腹膜腔内注射(i.p.)。天竺葵精油是在第1-11天被给药到MPTP PD小鼠，通过口服或皮下注射方式给药。在开始的5天内，在MPTP给药之前30分钟时给药精油。天竺葵精油在实验性PD诱导的小鼠内的运动协调和识别功能的效果是采用转棒(Rota Rod)和社会认知测试来分别评估的。在研究的末段，对象的大脑被移除并分子在黑质中的神经细胞损失。

正如所概述的，加速的转棒是被用于测量在小鼠中的运动协调。小鼠不得不保持它们在水平的旋转棒上的平衡，而转速是每5分钟加速4至20rpm。当小鼠被放置在旋转棒上时，测试开始，当小鼠落下时，测试停止，或者当5分钟时完成。每只小鼠每天经历3次，每次间隔10分钟。

实施例

在涉及天竺葵精油的实施例所揭示的所有结果，已经以植物Pelargoniumgraveolens(P.graveolens)的精油来获得。

实施例1：抑制乙酰胆碱酯酶活性的P.graveolens成分。

在这个实施例中，人红细胞乙酰胆碱酯酶(AChE)以不同浓度的天竺葵精油或它的每种成分来培育。

精油的制备与GC-MS分析。

P.graveolens是在Newe Ya’ar农业实验站的栽培条件下生长的。种子是从冷冻种子库中取出，并在Newe Ya’ar农业实验站播种。植物被栽培在当地的黏质土，在滴灌下栽培，正如在文献Dudai et al.,(2003),Flavour and FragranceJournal,18,334–337中所述。至少5kg的植物样品是在130L直接蒸汽实验厂装置蒸汽蒸馏1小时。以石油醚蒸馏精油，在注入到GC–MS,MSD(美国加州帕罗奥图的Agilent技术公司)带有自动取样仪Combi Pal(CTC Analytics,Zwingen，瑞士)，装备有Rtx-5SIL MS(30m×0.25mm i.d.×0.25lm)弹性石英毛细管柱(美国宾夕法尼亚州贝尔丰特的Restek公司)。氦气，在14.14psi恒压下和47cm-1线性速度，被用作载气。注射器被保持在250℃和1:50分裂模式。传输线被保持在280℃。毛细管柱在50℃维持1分钟，然后以5℃ min^-1程序升温至190℃，然后以10℃ min^-1程序升温至260℃。MSD是在70eV的电子电离模式中被操作的，m/z范围为42–350。通过比较化合物的相对滞留指数和那些真实样本的质谱来对化合物进行鉴别，辅以NIST 98和HPCH 2205 GC–MS图书馆。

酶活性。

在图2所示的结果中，不同成分是与人红细胞乙酰胆碱酯酶(25mU/mL)一起培育的。采用商业上可用的试剂盒(Arbor assays公司的乙酰胆碱酯酶荧光活性检测试剂盒)来确定乙酰胆碱酯酶的活性。图2显示了天竺葵精油、(S)(-)香茅醇、沉香醇、薄荷酮和异薄荷酮能抑制乙酰胆碱酯酶的酶活性。

实施例2：香茅醇的对应异构体之间在AChE活性上差异

天竺葵精油包含香茅醇的两种对映异构体，即[(R)(+):(S)(-)]，它们的比例是约80:20。因此，发明人已经测试了两种对映异构体在酶活性上的效果。正如所说明的，仅对映异构体(S)(-)香茅醇能抑制乙酰胆碱酯酶的酶活性，而(R)(+)香茅醇则不能。图3显示了在香茅醇的不同对映异构体对于AChE活性之间的差异是显著的。香茅醇的不同对映异构体是与人红细胞乙酰胆碱酯酶(25mU/mL)一起培育的。采用商业上可用的试剂盒(Arbor assays公司的乙酰胆碱酯酶荧光活性检测试剂盒)来确定乙酰胆碱酯酶的活性。

实施例3：P.graveolens成分不会抑制乙酰胆碱酯酶的活性。

在图4中，天竺葵精油的不同成分(香叶醇、香茅醇(+)和香茅醇甲酸盐)是与人红细胞乙酰胆碱酯酶(25mU/mL)一起培育的。采用商业上可用的试剂盒(Arbor assays公司的乙酰胆碱酯酶荧光活性检测试剂盒)来确定乙酰胆碱酯酶的活性。根据图4所示，香叶醇、香茅醇(+)和香茅醇甲酸盐都不能抑制AChE活性。

实施例4：天竺葵精油对于MPTP-PD小鼠的体重的效果

MPTP-PD小鼠的体重是统计学地显著低于对照组健康小鼠的体重。以天竺葵精油治疗，可阻碍在MPTP-PD小鼠观察到体重的减轻。图5显示了天竺葵精油对于MPTP-PD小鼠的体重的效果。在给药之前记录体重，以及每天在给药期间记录，贯穿整个研究。

MPTP制剂：将100mg MPTP溶解在5ml注射用水中，采用这个储备溶液用于MPTP(20mg/ml)剂量水平制备；剂量体积：10ml/kg；以及剂量水平：30mg/kg；用水稀释MPTP存储溶液(20mg/ml)至4mg/ml溶液；对每个组制备足够体积的溶液。

测试项目和装载制剂：测试项目的储备溶液为1000mg/ml；按以下方式稀释该测试项目的储备溶液：通过将80μl储备溶液加入到3.92ml MCT来制备4ml的20mg/ml溶液，混合均匀，再将0.1ml储备溶液加入到1.9ml MCT来制备4ml的20mg/ml溶液，混合均匀。

实施例5：天竺葵精油对于MPTP PD小鼠在转棒(RP)表现的效果

采用转棒(RP)表现反映了小鼠的运动协调。所有动物在第0分钟时，开始转速为3rpm，在5分钟内从4rpm加速到20rpm，每只小鼠每天经历3此测试，每次间隔10分钟。计算每只小鼠的平均潜伏期。所有进展是根据设定时间线进行，被近似估算。

在本研究的第11天，在以载体处理的MPTP PD小鼠上观察到在RP上花费的时间统计学地显著减少，相比于对照的健康小鼠(图6A)。在RP上的行走距离的类似地统计学地显著减少(图6B)也支持这个观察结果。以天竺葵精油治疗可显著增加MPTP PD小鼠的RP潜伏期和行走距离，相比于载体处理的MPTPPD小鼠(图6A和图6B)。

图6显示了天竺葵精油在MPTP PD小鼠的转棒潜伏期和行走距离的效果。在转棒上训练小鼠，每天3次测试，在第(-7)、(-5)和(-3)天，在第11天测试它们的RP表现。采用双程ANOVA重复测量来分析这些结果，Bonferroni效果测验。***(p<0.001)，**(p<0.01)。

实施例6：天竺葵精油在MPTP PD小鼠上社会认知上的效果。

MPTP诱导的PD小鼠以天竺葵精油处理，处理组小鼠与对照组健康小鼠都显示出社会记忆效应，通过花费较少时间调查相同的年幼动物，随后暴露。与之相反，在载体处理的MPTP PD小鼠的调查期间，是显著较高的，随后暴露，相比于对照的健康小鼠和相比于天竺葵处理的MPTP PD小鼠。互动率反映了社会认知记忆改善，载体处理的MPTP PD动物的互动率是显著较高的，相比于健康对照小鼠，以及相比于以天竺葵精油处理的MPTP PD小鼠(图7)。

社会认知测试测量基于嗅觉的记忆。图7显示了天竺葵精油在MPTP诱导的帕金森病小鼠的社会认知上的效果。在开始测试之前1小时，个别安置这些小鼠，以便分离它们的气味。成年小鼠和单个的年幼小鼠是放置在一个场地持续5分钟。在第一次(T-1)交互式试验期间，成年小鼠显示出调查行为，该行为包括接近跟随、嗅探或梳理年幼的小鼠。成年小鼠调查年幼小鼠所花费的时间量是由调查者按秒停钟来测量。然后，移出年幼小鼠和成年小鼠，放回它们的笼里。第二次(T-2)交互式试验是在相同的场地进行120分钟，再次监控和记录成年小鼠的调查行为。在第10天进行单独的记忆测试。计算调查在T-2中熟悉的年幼小鼠花费的时间除以调查在T-1中年幼小鼠花费的时间的认知比率(比率D11/2h)。通过双程ANOVA重复测量来分析这些结果，Bonferroni效果测验。***(p<0.001)。

实施例7：以天竺葵精油治疗对于在黑质中多巴胺能神经元的数量的效果

图8显示了以天竺葵精油治疗对于在黑质中多巴胺能神经元的数量的效果。来自(i)对照监控小鼠和(ii)MPTP PD小鼠和(iii)口服500mg/kg天竺葵精油的MPTP PD小鼠的所有鼠脑被固定、分区、免疫染色，计数在黑质中的多巴胺能神经元的数量。正如在图8中所示，在黑质中的多巴胺能神经元的数量是在MPTP PD小鼠的脑中显著减少的，相比于对照的健康小鼠。然而，以天竺葵精油治疗MPTP PD小鼠预防所观察到神经元细胞的凋亡。在第12天研究终止，以CO2窒息处死小鼠。所有鼠脑被快速移除，并存储在10％缓存的福尔马林溶液中。从每只小鼠采样三个域。进行变化的单程分析以比较不同组之间的差异。载体意味着溶剂，以该溶剂稀释天竺葵精油；在本例中，载体是MCT。

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