综合回收酶法阿莫西林母液中有效成分的方法

摘要

本发明涉及综合回收酶法阿莫西林母液中有效成分的方法。所述方法包括步骤：(1)阿莫西林母液浓缩：将酶法合成阿莫西林母液pH调节至8.0～9.5，纳滤浓缩，得到母液浓缩液；(2)酶催化合成阿莫西林：母液浓缩液在pH5.8～7.0，在合成用固定化青霉素酰化酶存在下，6-APA和D-对羟基苯甘氨酸甲酯转化为阿莫西林；(3)采用超滤和纳滤制备D-对羟基苯甘氨酸浓缩液：在酶催化反应结束后，分离得到阿莫西林晶体和阿莫西林二次母液，该二次母液经超滤、纳滤，得到D-对羟基苯甘氨酸浓缩液；以及(4)D-对羟基苯甘氨酸结晶。本发明通过酶催化合成阿莫西林的间接方法消耗了母液中残留的6-APA和D-对羟基苯甘氨酸甲酯，并提高了D-对羟基苯甘氨酸的产品质量和产率。

说明书

技术领域

本发明属于制药技术领域，涉及综合回收酶法阿莫西林母液中有效成分 的方法。

背景技术

阿莫西林(Amoxicillin)，又名安莫西林或安默西林，是一种最常用的青 霉素类广谱β-内酰胺类抗生素。阿莫西林杀菌作用较强，具有广谱、高效、 毒副作用小的特点，在医药卫生领域得到了广泛的应用，其制剂主要有胶囊、 片剂、颗粒剂、分散片等。

目前合成阿莫西林的方法主要有两种：一种为化学合成法，另一种为酶 催化合成法(简称酶法)。阿莫西林工业生产始于二十世纪六、七十年代，传 统上采用化学合成法合成，由于其工艺成熟，合成产率高，目前仍然是大多 数国家和企业普遍采用的生产工艺。化学合成法需要活化、缩合、保护和去 保护等步骤，反应复杂，整个反应过程需要用到多种有机化学原料，而且反 应条件苛刻，同时还产生大量的三废，污染较严重。另外，出于整个反应体 系的组成比较复杂，后期的产物分离提纯难度很大，得到的产品往往含有一 定量的杂质，因此在实际的应用中受到了一定的限制。而利用酶法合成阿莫 西林，可避免有机溶媒的使用，反应条件温和、能耗低、易操作、整个过程 绿色环保；同时，酶法合成的阿莫西林纯度高于化学法合成的产品，药物的 安全性和稳定性得到大幅提升。目前酶法存在的不足就是青霉素酰化酶水解 活性较强，反应产率与合成水解比值不高，限制了酶法生产技术的产业化推 广。2011年，随着酶固定化技术的发展，催化性能优异的固定化青霉素酰化 酶随之面世，酶法已逐步取代化学合成法成为阿莫西林生产的最主要的方法。

酶法合成阿莫西林工艺中，大都采用D-对羟基苯甘氨酸甲酯作为酰基侧 链供体，在合成用固定化青霉素酰化酶催化作用下与6-APA(6-氨基青霉烷酸) 缩合生成阿莫西林。由于缩合反应是在水相中进行的，青霉素酰化酶自身的 水解活性较强，因此原料D-对羟基苯甘氨酸甲酯和产物阿莫西林都有一定程 度的水解，结晶母液中有大量的D-对羟基苯甘氨酸存在，此外母液中仍有部 分未被提取的阿莫西林以及未参与合成反应的6-APA和D-对羟基苯甘氨酸甲 酯，这就使得酶法合成阿莫西林的经济性大打折扣，成为产业化推广的技术 瓶颈。所以，如何有效地综合回收利用母液中的上述有效成分成为当前阿莫 西林酶法合成工艺面临的重要研究课题。

中国专利文献CN102392060A公开了一种利用纳滤膜回收酶法合成阿莫 西林母液中有效成分的方法，该方法使用纳滤膜将青霉素酰化酶水解后的母 液进行浓缩处理，再利用等电点结晶法分离回收母液中的6-APA和D-对羟基 苯甘氨酸。中国专利文献CN102816803A公开了一种酶法合成阿莫西林母液 中有效成分的回收利用方法，是将青霉素酰化酶水解后的母液经过大孔吸附 树脂处理，得到的6-APA洗脱液作为酶法合成阿莫西林工艺中原料套用，而 D-对羟基苯甘氨酸洗脱液经超滤、纳滤、结晶而得到成品。这些专利文献中 虽然给出了解决酶法合成阿莫西林母液中有效成分的回收利用方法，但其仍 存在许多不尽如人意的地方。例如，母液提取回收过程中的酶裂解工艺步骤 使过程中产生了多种降解物，而该溶液直接采用纳滤浓缩，不仅能耗大，且 浓缩后的溶液所含成分复杂，由此方法回收6-APA和D-对羟基苯甘氨酸效率 低下，产品纯度差。另外，在CN102816803A中利用大孔吸附树脂处理母液， 虽然D-对羟基苯甘氨酸和6-APA都被回收，但是6-APA洗脱液中含有大量的 杂质，直接用于阿莫西林合成，这些杂质势必会累积到产品中，进而影响产 品的质量和安全，此外，树脂的使用会有大量的废水产生，不仅增加了产品 的回收成本，而且对环境造成较大的影响。且两件专利文献中均没有涉及母 液中D-对羟基苯甘氨酸甲酯、阿莫西林的转化或回收。在现有技术中，对更 加有效地且环境友好地综合回收阿莫西林母液中残留的有效成分、最大程度 地挖掘残留母液的价值，存在需要。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供一种工艺设计合理、操作简便、回收效果 好、产品质量优异且环境友好的综合回收酶法阿莫西林母液中有效成分的方 法，即回收母液中D-对羟基苯甘氨酸和阿莫西林，母液中残留的6-APA和 D-对羟基苯甘氨酸甲酯经浓缩后，在合成用固定化青霉素酰化酶的催化作用 下转化为阿莫西林时也被回收利用。

为了实现本发明目的，本发明所采用的技术方案为：利用合成用固定化 青霉素酰化酶将阿莫西林母液浓缩液中的6-APA和D-对羟基苯甘氨酸甲酯转 化为阿莫西林，结晶得到阿莫西林产品，再将二次母液中的D-对羟基苯甘氨 酸经超滤、纳滤、结晶后回收利用。根据本发明，本发明提供的综合回收酶 法阿莫西林母液中有效成分的方法，包括如下步骤：

(1)阿莫西林母液浓缩

酶法合成阿莫西林母液在阿莫西林结晶分离之后，使用碱将该母液pH调 节至8.0～9.5，然后采用截留分子量为150～300道尔顿的纳滤膜将该阿莫西 林母液浓缩，得到阿莫西林母液浓缩液；

(2)酶催化合成阿莫西林

将上述步骤(1)得到的阿莫西林母液浓缩液用酸调节pH至5.8～7.0， 向其中投入合成用固定化青霉素酰化酶，浓缩液中的6-氨基青霉烷酸和D-对 羟基苯甘氨酸甲酯在酶的作用下转化为阿莫西林，在反应60～120分钟后， 加入阿莫西林晶种使得阿莫西林充分合成并以结晶形式析出；

(3)采用超滤和纳滤制备D-对羟基苯甘氨酸浓缩液

在酶催化反应结束后，采用筛网将固定化青霉素酰化酶从反应液中分离 出，得到阿莫西林悬浊液；该阿莫西林悬浊液经滤布过滤得到阿莫西林晶体 和阿莫西林二次母液；采用截留分子量为1000～1500道尔顿的超滤膜将阿莫 西林二次母液超滤除杂，得到超滤滤出液；然后采用截留分子量为150～300 道尔顿的纳滤膜将上述滤出液进行浓缩，得到D-对羟基苯甘氨酸浓缩液；

(4)D-对羟基苯甘氨酸结晶

在30℃～45℃条件下，用酸将上述步骤(3)得到的D-对羟基苯甘氨酸 浓缩液的pH值调节至4.5～5.5，D-对羟基苯甘氨酸结晶逐渐析出，降温至 0℃～10℃，养晶，过滤，干燥，得到D-对羟基苯甘氨酸。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

通过对酶法阿莫西林母液中各种成分的有效浓缩，在合成用固定化青霉 素酰化酶的作用下，将母液中浓缩富集的6-APA和D-对羟基苯甘氨酸甲酯转 化为阿莫西林，然后分别提取阿莫西林和D-对羟基苯甘氨酸，做到了母液中 有效成分的综合回收。本发明使用全新的工艺成功回收了母液中的阿莫西林， 创造了新的经济增长点，而且通过酶催化合成阿莫西林的间接方法消耗了母 液中残留的6-APA和D-对羟基苯甘氨酸甲酯，并提高了D-对羟基苯甘氨酸的 产品质量。

附图说明

图1为本发明的综合回收酶法阿莫西林母液中有效成分的方法的工艺流 程图。

具体实施方式

下面，更具体地说明本发明的综合回收酶法阿莫西林母液中有效成分的 方法。

在所述步骤(1)阿莫西林母液浓缩中，酶法合成阿莫西林母液在阿莫西 林结晶分离之后，利用碱将pH调节至8.0～9.5，然后采用截留分子量为150～ 300道尔顿的纳滤膜将该阿莫西林母液浓缩，得到阿莫西林母液浓缩液。

其中，酶法合成阿莫西林母液在阿莫西林结晶分离之后，利用碱将pH调 节至8.0～9.5，且优选8.5～9.0，所用碱可以为氢氧化钠或氨水；在该pH条 件下母液中的各物质的溶解度都相对较高，保证了母液在纳滤浓缩过程中不 会有晶体析出。

然后，采用截留分子量为150～300道尔顿的纳滤膜，更优选截留分子量 为150～200道尔顿的纳滤膜，最优选截留分子量为150道尔顿的纳滤膜，将 该阿莫西林母液浓缩，一般在5～8℃低温条件下将阿莫西林母液浓缩，该过 程中仅有部分无机盐透过膜进入滤出液，其他物质均被截留在浓缩液中。

在所得到的母液浓缩液中，一般D-对羟基苯甘氨酸的浓度为27～37g/L， 6-APA的浓度为9～16g/L，阿莫西林的浓度为15～25g/L，D-对羟基苯甘氨酸 甲酯的浓度为9～16g/L；且优选D-对羟基苯甘氨酸的浓度为30～34g/L， 6-APA的浓度为11～14g/L，阿莫西林的浓度为18～21g/L，D-对羟基苯甘氨 酸甲酯的浓度为11～15g/L。

在所述步骤(2)酶催化合成阿莫西林中，将上述步骤(1)得到的母液 浓缩液用酸调节pH至5.8～7.0，向其中投入合成用固定化青霉素酰化酶，浓 缩液中的6-氨基青霉烷酸和D-对羟基苯甘氨酸甲酯在酶的作用下转化为阿莫 西林，在反应60～120分钟后，加入阿莫西林晶种使得阿莫西林充分合成并 以结晶形式析出。

在所述步骤(2)中，所用酸可以为盐酸；所用的合成用固定化青霉素酰 化酶活力一般为70～150U/g，且优选合成用固定化青霉素酰化酶活力为95～ 130U/g，每升母液浓缩液所对应的投酶量为8000～12000U，该合成用固定化 青霉素酰化酶可以市购得到，例如湖南福莱格生物技术有限公司生产的合成 用固定化青霉素酰化酶(SIPA)；反应过程中无需对pH进行调节，仅需控制 温度15～20℃，优选18～20℃；在反应60～120分钟后，加入阿莫西林晶种 使得阿莫西林充分合成并以结晶形式析出，养晶30～60分钟后反应结束。

在所述步骤(3)采用超滤和纳滤制备D-对羟基苯甘氨酸浓缩液中，在酶 催化反应结束后，采用筛网将固定化青霉素酰化酶从反应液中分离出，得到 阿莫西林悬浊液；该阿莫西林悬浊液经滤布过滤得到阿莫西林晶体和阿莫西 林二次母液；采用截留分子量为1000～1500道尔顿的超滤膜将阿莫西林二次 母液超滤除杂，得到超滤滤出液；然后采用截留分子量为150～300道尔顿的 纳滤膜将上述滤出液进行浓缩，得到D-对羟基苯甘氨酸浓缩液。

其中，在酶催化反应结束后，首先使用80～100目筛网，优选90目筛网， 完成固定化青霉素酰化酶颗粒与阿莫西林悬浊液的分离，固定化青霉素酰化 酶经过洗涤后可以重复使用，而分离得到的阿莫西林悬浊液再经1～10微米 滤布，优选5微米滤布过滤后，进一步完成阿莫西林结晶体与阿莫西林二次 母液的分离。该二次母液中含有下一步需要回收的大量的D-对羟基苯甘氨酸， 此外仍含有少量的阿莫西林、6-APA、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、杂质和无机盐。

采用截留分子量为1000～1500道尔顿的超滤膜，更优选截留分子量为 1000道尔顿的超滤膜，将阿莫西林二次母液超滤除杂，得到超滤滤出液。该 过程中只有无机盐与D-对羟基苯甘氨酸透过膜进入滤出液，其他组分均被截 留除去，因而获得纯度非常高的D-对羟基苯甘氨酸滤出液。

采用截留分子量为150～300道尔顿的纳滤膜，更优选截留分子量为150～ 200道尔顿的纳滤膜，最优选截留分子量为150道尔顿的纳滤膜，将上述滤出 液进行浓缩，该过程中又有部分盐被除去，最终得到浓缩的D-对羟基苯甘氨 酸溶液，其中纳滤的滤出液可以循环用于洗涤上述超滤的浓残物。

在所得到的D-对羟基苯甘氨酸浓缩液中，一般D-对羟基苯甘氨酸的浓度 为60～70g/L，6-APA的浓度为0～0.5g/L，阿莫西林的浓度为0～0.5g/L，D- 对羟基苯甘氨酸甲酯的浓度为1～2g/L；且优选D-对羟基苯甘氨酸的浓度为 63～67g/L，6-APA的浓度为0～0.5g/L，阿莫西林的浓度为0～0.5g/L，D-对 羟基苯甘氨酸甲酯的浓度为1～2g/L。

在所述步骤(4)D-对羟基苯甘氨酸结晶中，在30℃～45℃，优选35℃～ 40℃条件下，可以用浓盐酸将浓缩的D-对羟基苯甘氨酸溶液的pH值缓慢调 节至4.5～5.5，优选5.0～5.5，D-对羟基苯甘氨酸结晶逐渐析出，缓慢降温至 0℃～10℃，优选5℃～10℃，养晶，过滤，所得固体干燥，即得到质量符合 标准的D-对羟基苯甘氨酸产品。其中的结晶母液可以循环至上述步骤(3)超 滤过程的二次母液中，从而大幅提高D-对羟基苯甘氨酸的收率。

下面通过实施例更具体地说明本发明，但本发明的保护范围不局限于这 些实施例中。

实施例1

按如下步骤综合回收酶法阿莫西林母液中有效成分：

(1)阿莫西林母液浓缩

取阿莫西林结晶分离之后的酶法合成阿莫西林母液1000L，高效液相色谱 检测母液中各成分的含量，检测结果示于下面表1中。用40wt％氢氧化钠溶 液将母液pH调节至9.0，使得母液中的各种物质的溶解度都相对较高，保证 了在纳滤浓缩过程中不会有晶体析出；然后采用截留分子量为150道尔顿的 纳滤膜在5～8℃条件下将阿莫西林母液纳滤浓缩至100L，该过程中仅有部分 无机盐和少量D-对羟基苯甘氨酸透过膜进入滤出液，其他组分均被截留，浓 缩后的母液中各成分高效液相色谱检测结果示于下面表1中。

(2)酶催化合成阿莫西林

在20℃，将上述步骤(1)得到的母液浓缩液用体积分数比为30％浓盐酸 调节pH至6.5，向其中投入酶活力为95U/g的合成用固定化青霉素酰化酶(湖 南福莱格生物技术有限公司)10526g，浓缩液中的6-氨基青霉烷酸和D-对羟 基苯甘氨酸甲酯在酶的作用下转化为阿莫西林，当反应60分钟以后，加入44g 阿莫西林晶种，此时阿莫西林快速合成并以晶体形式析出，养晶30分钟后反 应结束，反应液中的6-APA和D-对羟基苯甘氨酸甲酯被充分地利用。

(3)采用超滤和纳滤制备D-对羟基苯甘氨酸浓缩液

在酶催化反应结束后，采用90目筛网将固定化青霉素酰化酶从反应液中 分离出，得到阿莫西林悬浊液；该阿莫西林悬浊液经5微米滤布过滤后得到 阿莫西林晶体(3871g)和阿莫西林二次母液，该阿莫西林二次母液体积约为 97L，该母液中含有高浓度的D-对羟基苯甘氨酸和少量的阿莫西林、6-APA、 D-对羟基苯甘氨酸甲酯和杂质，二次母液各组分检测结果参见表1；

采用截留分子量为1000道尔顿的超滤膜将阿莫西林二次母液超滤除杂， 得到超滤滤出液，该过程中大部分D-对羟基苯甘氨酸透过膜进入滤出液，其 他组分均被截留，该步得滤出液90L，其各成分检测结果参见表1；

然后采用截留分子量为150道尔顿的纳滤膜将上述滤出液进行浓缩，得 到D-对羟基苯甘氨酸浓缩液40L，其各成分检测结果参见表1；

(4)D-对羟基苯甘氨酸结晶

在38℃～40℃条件下，用体积分数比为30％浓盐酸将上述步骤(3)得到 的D-对羟基苯甘氨酸浓缩液的pH值缓慢调节至5.5，D-对羟基苯甘氨酸晶体 逐渐析出，而后降温至5℃，养晶，过滤，干燥，得到D-对羟基苯甘氨酸产 品(1473g)。

其中分离出的结晶母液可以循环至上述步骤(3)超滤过程的二次母液中， 从而大幅提高D-对羟基苯甘氨酸的总收率，总收率从41.49提高至73.46％， 即单批多产出D-对羟基苯甘氨酸1135g。

表1为各个步骤中高效液相色谱检测母液中各成分的含量

实施例2

按如下步骤综合回收酶法阿莫西林母液中有效成分：

(1)阿莫西林母液浓缩

取阿莫西林结晶分离之后的酶法合成阿莫西林母液1000L，高效液相色谱 检测母液中各成分的含量，检测结果示于下面表2中。用体积分数比为25％ 浓氨水将母液pH调节至8.5，使得母液中的各种物质的溶解度都相对较高， 保证了在纳滤浓缩过程中不会有晶体析出；然后采用截留分子量为200道尔 顿的纳滤膜在5～8℃条件下将阿莫西林母液纳滤浓缩至98L，该过程中仅有 部分无机盐和少量D-对羟基苯甘氨酸透过膜进入滤出液，其他组分均被截留， 浓缩后的母液中各成分高效液相色谱检测结果示于下面表2中。

(2)酶催化合成阿莫西林

在18℃，将上述步骤(1)得到的母液浓缩液用体积分数比为15％盐酸调 节pH至6.3，向其中投入酶活力为120U/g的合成用固定化青霉素酰化酶(湖 南福莱格生物技术有限公司)8333g，浓缩液中的6-氨基青霉烷酸和D-对羟基 苯甘氨酸甲酯在酶的作用下转化为阿莫西林，当反应80分钟以后，加入44g 阿莫西林晶种，此时阿莫西林快速合成并以晶体形式析出，养晶30分钟后反 应结束，反应液中的6-APA和D-对羟基苯甘氨酸甲酯被充分地利用。

(3)采用超滤和纳滤制备D-对羟基苯甘氨酸浓缩液

在酶催化反应结束后，采用90目筛网将固定化青霉素酰化酶从反应液中 分离出，得到阿莫西林悬浊液；该阿莫西林悬浊液经5微米滤布过滤后得到 阿莫西林晶体(3546g)和阿莫西林二次母液，该阿莫西林二次母液体积约为 99L，该母液中含有高浓度的D-对羟基苯甘氨酸和少量的阿莫西林、6-APA、 D-对羟基苯甘氨酸甲酯和杂质，二次母液各组分检测结果参见表2；

采用截留分子量为1500道尔顿的超滤膜将阿莫西林二次母液超滤除杂， 得到超滤滤出液，该过程中大部分D-对羟基苯甘氨酸透过膜进入滤出液，其 他组分均被截留，该步得滤出液93L，其各成分检测结果参见表2；

然后采用截留分子量为200道尔顿的纳滤膜将上述滤出液进行浓缩，得 到D-对羟基苯甘氨酸浓缩液40L，其各成分检测结果参见表2；

(4)D-对羟基苯甘氨酸结晶

在35℃～37℃条件下，用体积分数比为15％浓盐酸将上述步骤(3)得到 的D-对羟基苯甘氨酸浓缩液的pH值缓慢调节至5.2，D-对羟基苯甘氨酸晶体 逐渐析出，而后降温至10℃，养晶，过滤，干燥，得到D-对羟基苯甘氨酸 (1458g)。

其中分离出的结晶母液可以循环至上述步骤(3)超滤过程的二次母液中， 从而大幅提高D-对羟基苯甘氨酸的收率。

表2为各个步骤中高效液相色谱检测母液中各成分的含量

实施例3

按如下步骤综合回收酶法阿莫西林母液中有效成分：

(1)阿莫西林母液浓缩

取阿莫西林结晶分离之后的酶法合成阿莫西林母液1000L，高效液相色谱 检测母液中各成分的含量，检测结果示于下面表3中。用40％(wt％)氢氧化钠 溶液将母液pH调节至8.5，使得母液中的各种物质的溶解度都相对较高，保 证了在纳滤浓缩过程中不会有晶体析出；然后采用截留分子量为300道尔顿 的纳滤膜在5～8℃条件下将阿莫西林母液纳滤浓缩至100L，该过程中仅有部 分无机盐和少量D-对羟基苯甘氨酸透过膜进入滤出液，其他组分均被截留， 浓缩后的母液中各成分高效液相色谱检测结果示于下面表3中。

(2)酶催化合成阿莫西林

在20℃，将上述步骤(1)得到的母液浓缩液用体积分数比为30％盐酸调 节pH至6.0，向其中投入酶活力为150U/g的合成用固定化青霉素酰化酶(湖 南福莱格生物技术有限公司)6667g，，浓缩液中的6-氨基青霉烷酸和D-对羟 基苯甘氨酸甲酯在酶的作用下转化为阿莫西林，当反应90分钟以后，加入44g 阿莫西林晶种，此时阿莫西林快速合成并以晶体形式析出，养晶30分钟后反 应结束，反应液中的6-APA和D-对羟基苯甘氨酸甲酯被充分地利用。

(3)采用超滤和纳滤制备D-对羟基苯甘氨酸浓缩液

在酶催化反应结束后，采用90目筛网将固定化青霉素酰化酶从反应液中 分离出，得到阿莫西林悬浊液；该阿莫西林悬浊液经5微米滤布过滤后得到 阿莫西林晶体(3635g)和阿莫西林二次母液，该阿莫西林二次母液体积约为 98L，该母液中含有高浓度的D-对羟基苯甘氨酸和少量的阿莫西林、6-APA、 D-对羟基苯甘氨酸甲酯和杂质，二次母液各组分检测结果参见表3；

采用截留分子量为1000道尔顿的超滤膜将阿莫西林二次母液超滤除杂， 得到超滤滤出液，该过程中大部分D-对羟基苯甘氨酸透过膜进入滤出液，其 他组分均被截留，该步得滤出液91L，其各成分检测结果参见表3；

然后采用截留分子量为300道尔顿的纳滤膜将上述滤出液进行浓缩，得 到D-对羟基苯甘氨酸浓缩液39L，其各成分检测结果参见表3；

(4)D-对羟基苯甘氨酸结晶

在38℃～40℃条件下，用体积分数比为30％浓盐酸将上述步骤(3)得到 的D-对羟基苯甘氨酸浓缩液的pH值缓慢调节至5.0，D-对羟基苯甘氨酸晶体 逐渐析出，而后降温至5℃，养晶，过滤，干燥，得到D-对羟基苯甘氨酸(1423g)。

其中分离出的结晶母液可以循环至上述步骤(3)超滤过程的二次母液中， 从而大幅提高D-对羟基苯甘氨酸的收率。

表3为各个步骤中高效液相色谱检测母液中各成分的含量