一种与小麦苗期耐低磷能力相关的SNP位点及其应用

摘要

本发明公开了一种与小麦苗期耐低磷能力相关的SNP位点及其应用。该SNP位点为序列4中自5’末端起第56位核苷酸，该第56bp位核苷酸为A和/或G；SEQ ID No.4所示DNA片段在小麦染色体1BL上的132.6cM位置。本发明还提供了一个新的耐低磷能力主效基因位点QPt.caas-1B及该位点的辅助筛选耐低磷能力强的小麦品种的SNP位点。利用该位点可以筛选耐低磷能力强的小麦，在小麦育种中发挥重要作用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种与小麦苗期耐低磷能力相关的SNP位点及其应用。 

背景技术

培育高产高效广适的新品种，不仅需要优良的农艺性状，而且需要较高的肥料利用效率。磷是作物生长发育过程中所需重要元素之一，但磷容易被土壤固定，在小麦中当季利用率只有10-20％，明显低于水稻和玉米(Lu等，2004)。虽然增加磷肥施用量可有效提高作物产量，但因品种肥料利用效率的限制，造成过量施用肥料产生不必要的浪费，既增加了生产成本同时非同化固定的磷肥又加剧了环境污染。人口和环境压力给我国农业生产带来极大挑战，探索创新、有效的植物营养方案，进一步提高新品种的肥料利用效率，对提高小麦生产效率具有重要意义。 

由于磷肥在农作物生产中具有重要作用，利用遗传育种方法培育磷利用效率高、适应性更广的新品种是重要的育种目标。虽然已知部分基因控制磷利用效率，如PHR1是植物磷胁迫响应基因，适量上调TaPHR1的表达可以促进小麦根系生长发育、增强磷吸收和诱导转运相关基因的表达，进而改善植株的磷营养，增加分蘖数、穗粒数，提高产量(王静，2011)，转运蛋白PHT1.2基因家族可以提高磷的吸收效率等(Wang等，2013)，但真正可用于农业生产中的主效基因很少。分子标记辅助选择技术可跟踪转育或聚合优良基因，为培育高产广适且水肥高效利用的小麦新品种提供了有效的技术手段。而发掘控制磷利用效率相关基因及基因标记是开展分子标记辅助育种的前提。由于磷的活化和转运因子等研究较复杂，植物肥料利用效率相关基因的定位研究起步较晚，已有的QTL定位研究多集中于不同肥料处理下的产量性状及相应肥料利用效率(Gallais等，2004；Loudet等，2003；Li等，2005)。目前，已报道的小麦磷利用效率相关QTL位点主要分布于1A、2B、2D、3A、3B、4B、5A、5B、5D、6A、6B和7A等染色体上，部分QTL位点与其它农艺性状相关基因连锁形成密集区，如位于5A和5D染色体上的位点与春化基因VRN-A1和VRN-D1连锁(Su等，2006；2009)。在水稻中，虽然已发现的与磷利用相关的QTL位点较多，但只有Pup1位点在不同遗传背景下表现稳定(Chin等2011；Vinod等，2012)。尽管氮、磷利用效率相关QTL定位研究已取得较大进展，但已知的控制氮、磷利用效率主效QTL位点却很少，明确植物对养分吸收、利用途径，发掘相应过程中作用基因并开发分子标记仍是研究的重点。 

京411曾是上世纪90年代的主栽品种，也是北部冬麦区骨干亲本之一；中麦175是本麦区的第一大品种和区试对照品种，具有极强的耐低肥和耐干旱能力，已在黄淮 旱肥地大面积推广；北京0045于2008-10年为河北省北部第一大品种，至今仍大面积种植；中麦415、中麦816和新冬37则于近几年分别通过了国家和新疆审定。营养液培养法已经被广泛应用于作物苗期培育以及根系特征、肥料敏感性等性状的研究(Su等，2006；肖永贵等，2014)。磷肥在作物苗期所起的作用尤为重要，可以促进提早分蘖。Peng等研究认为，在插秧后35天内积累氮最多的水稻品种氮肥利用效率最高(Peng等，1994)。在可控营养条件下，通过不同浓度磷处理，分析不同基因型苗期肥料利用效率及相关性状，并利用全基因组SNP标记分析所选材料携带的磷利用效率相关遗传区段，解析其在不同基因型间差异的原因，可以为培育高产高效广适的品种奠定理论基础和提供分子辅助选择手段。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种辅助鉴定小麦耐低磷能力的方法。 

本发明提供的方法，是检测待测小麦的1B染色体132.6cM位置的基因的第56位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G,以确定待测小麦1B染色体132.6cM位置的基因的基因型是AA还是AG还是GG，根据所述待测小麦的基因型确定耐低磷能力：GG基因型的待测小麦的耐低磷能力高于或候选高于AG或AA基因型的待测小麦；所述GG基因型为1B染色体132.6cM位置的基因的第56位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体，所述AG因型1B染色体132.6cM位置的基因的第56位脱氧核糖核苷酸为为A和G的杂合体，所述AA因型为1B染色体132.6cM位置的基因的第56位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体。 

上述方法中，所述检测待测小麦的1B染色体132.6cM位置的基因的第56位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G包括PCR扩增和对PCR扩增产物进行基因分型鉴定两个步骤； 

所述PCR扩增所用的引物对满足如下条件:以所述待测小麦的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有1B染色体132.6cM位置的基因的第56位脱氧核糖核苷酸。 

上述方法中，所述PCR扩增所用的引物由序列表中序列1所示的单链DNA分子、序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成的引物组； 

所述序列1所示的单链DNA分子的5’末端添加特异荧光序列FAM； 

所述序列2所示的单链DNA分子的5’末端添加特异荧光序列HEX； 

所述基因分型鉴定采用荧光酶标仪； 

所述耐低磷中磷的终浓度为0.25m mol/L； 

所述1B染色体132.6cM位置的基因的核苷酸序列为序列表中序列4。 

本发明的另一个目的是提供一种辅助鉴定小麦的耐低磷能力的试剂。 

本发明提供的试剂，是待测小麦的1B染色体132.6cM位置的基因的第56位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质。 

上述试剂中，所述物质为由序列表中序列1所示的单链DNA分子、序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成的引物组； 

上述序列1所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子为不同荧光标记，所述序列1所示的单链DNA分子的5’末端具体添加特异荧光序列FAM；所述序列2所示的单链DNA分子的5’末端具体添加特异荧光序列HEX。 

可以根据荧光颜色判断带型，上述序列1所示的单链DNA分子与序列3所示的单链DNA分子组合扩增，扩增SNP位点基因型为G:G的片段，携带FAM的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示红色； 

上述序列2所示的单链DNA分子与序列3所示的单链DNA分子组合扩增，扩增SNP位点基因型为A:A的片段，携带HEX的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示蓝色。 

本发明第三个目的是提供辅助鉴定小麦的耐低磷能力的试剂盒。 

本发明提供的试剂盒，含有上述的试剂。 

上述的试剂或上述的试剂盒在辅助检测小麦耐低磷能力的应用也是本发明保护的范围； 

或上述的试剂或上述的试剂盒在制备辅助检测小麦耐低磷能力产品中的应用也是本发明保护的范围。 

上述的方法、试剂或试剂盒在选育耐低磷小麦中的应用也是本发明保护的范围。 

本发明第四个目的是提供一种与小麦耐低磷能力相关的SNP位点。 

本发明提供的与小麦耐低磷能力相关的SNP位点，该位点为小麦的1B染色体132.6cM位置的基因的第56位脱氧核糖核苷酸，该第56bp位核苷酸为A和/或G；小麦的1B染色体132.6cM位置的基因的核苷酸序列为序列表中序列4。 

本发明第5个目的是提供一种与小麦耐低磷能力相关的含有SNP位点的DNA片段。 

本发明提供的与小麦耐低磷能力相关的含有SNP位点的DNA片段，其核苷酸序列为序列表中序列4，其中，该序列第56bp处碱基为A和/或G；且该DNA片段在小麦1B染色体上的132.6cM位置。 

上述应用中，所述小麦具体可为如下品种中任一种或几种：京冬17、烟农19、科遗5214、中麦895、中麦875、济麦22、济麦23、济麦24、山农715、石麦15、石麦19、石优20、衡观35、良星99、郑麦0943、周麦16、周麦18、周麦22、洛旱2号、矮抗58、小偃101、Wheatear。 

本发明的实验证明，本发明提供了一个新的耐低磷能力基因位点QPt.caas-1B及辅助筛选具有较强耐低磷能力的小麦品种的SNP位点。利用该SNP位点可以筛选耐低 磷能力优良的小麦，对培育高效型小麦品种具有重要作用。 

附图说明

图1为中麦175(左)和京冬17(右)在3个磷浓度下长势图 

图2为耐低磷能力相关SNP标记与QPt.caas-1B连锁图 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

实施例1、与小麦耐低磷能力相关的SNP位点的获得 

选用冬小麦骨干亲本京411及其14个衍生品种(系)，包括衍生一代6份，衍生二代8份。 

1、小麦苗期培养以及耐低磷能力调查 

采用营养液培养法，设置3个KH₂PO₄浓度营养液：0、0.005、0.25(m mol/L)KH₂PO₄。基础营养液为：K₂SO₄0.75、KCl 0.1、MgSO₄0.6、FeEDTA 4.0×10^-2、H₃BO₃1.0×10^-3、MnSO₄1.0×10^-3、ZnSO₄1.0×10^-3、CuSO₄1.0×10^-4、(Na)₆Mo₂O₄5.0×10^-6、Ca(NO₃)₂2.0。在不施和低磷处理中用KCl将K+补充到0.25m mol/L相同水平，具体配方如下： 

0m mol/L KH₂PO₄营养液(m mol/L)：除了基础营养液以外，补充0.25m mol/LKCl，组成0m mol/L KH₂PO₄营养液； 

0.005m mol/L KH₂PO₄营养液：将基础营养液与0.005m mol/L KH₂PO₄混合，另补充0.245m mol/L KCl，组成0.005m mol/L KH₂PO₄营养液； 

0.25m mol/L KH₂PO₄营养液：将基础营养液与0.25m mol/L KH₂PO₄混合，组成0.25m mol/L KH₂PO₄营养液。 

处理方法：每品种选取种子50粒，用10％的H₂O₂处理20-30分钟，无菌水冲洗5-6次。选取饱满且大小一致的种子置于铺有滤纸的培养皿中，在培养箱暗室催芽。待种子露白后，移栽至石英砂中培养一周。挑选长势均匀的幼苗移栽至有含有不同浓度KH₂PO₄营养液的培养盒中。每3天更换一次营养液，连续培养20天后收获。测量每个处理下地上部干重SDW₀(0m mol/L KH₂PO₄)、SDW₁(0.005m mol/L KH₂PO₄)、SDW₂(0.25mmol/L KH₂PO₄)，计算不施磷和低磷下的耐低磷能力(Ability of tolerance to low phosphorus,ATP)，计算公式如下： 

ATP₀＝(SDW₀/SDW₂)×100；ATP₁＝(SDW₁/SDW₂)×100。 

ATP₀和ATP₁分别为不施磷和低磷下的耐低磷能力。 

2、引物获得和SNP位点分析 

SNP(单核苷酸多态性)标记在博奥生物有限公司(CapitalBio Corporation,Beijing,China；http://bioservices.capitalbio.com)利用Illumina SNP基因分 型检测，主要分为以下步骤：1)将待测小麦品种基因组DNA进行全基因组扩增；2)扩增产物用随机内切酶酶切断化；3)将DNA片段与芯片进行杂交，芯片的微珠上连接有50-mers长度特异性捕获探针，gDNA酶切后产物与探针互补序列结合；4)清洗去除未杂交上的或错配杂交上的DNA片段；5)二硝基酚(dinitrophenol)和生物素(biotin)标记的核苷酸底物(A/T和C/G)在捕获探针上进行单碱基延伸，只有与gDNA发生互补结合的探针才能得到延伸；通过染色，A/T和C/G将分别标记不同的荧光染料；6)芯片扫描，并利用软件根据两种荧光判读并输出分型结果。 

利用Illumina SNP基因分型研究平台对京411及其衍生品种(系)DNA进行90k SNP芯片分型，包括BS、BobWhite、CAP、D_contig等系列标记，共计81587个，其中24080个SNP标记在京411衍生群体内存在差异。 

3、关联基因定位和连锁标记的发现 

利用SAS9.2软件(SAS Institute.2000)进行基本统计量、多重比较分析，并结合SAS的Glmselect程序对SNP数据和根系性状进行逐步回归，根据P值(P<0.01)判断关联位点。定位出控制小麦耐低磷能力的SNP标记BS00015519_51与基因Qpue.caas-1B关联(P<0.001)。 

4、BS00015519_51位点的等位基因特异标记鉴定 

分别提取京411及14个衍生品种的全基因组DNA。以各个基因组DNA为模板，用小麦耐低磷能力的SNP标记BS00015519_51位点的等位基因特异标记组合进行基因分型检测，出现G:G分型的片段则说明该标记能够有效鉴定小麦品种耐低磷能力基因。 

表1为耐低磷能力标记等位变异在京411衍生群体中的分离 

结果如表1，可以看出，BS00015519_51位点(序列4中自5’末端起第56位核苷酸)的基因型为G：G的小麦品种耐低磷能力高于BS00015519_51位点的基因型为A：A或G：A的小麦品种，因此，此位点可用于判断小麦耐低磷能力高低。 

根据Wheat DArT maps Version1.2(http://www.triticarte.com.au)和Allen等(2011)公布的小麦分子标记图谱，将标记BS00015519_51整合到小麦遗传图谱上，结果如图2所示，确定QPt.caas-1B在染色体1B上的132.6cM位置。 

5、扩增SNP位点的引物对的设计 

根据BS00015519_51的SNP位点所在染色体1B上的132.6cM位置的基因的核苷酸序列(序列4)，设计用于扩增该SNP位点的引物，共3条： 

序列1：5’caattcaactggccagccatcg 3’ 

序列2：5’gcaattcaactggccagccatca 3’ 

序列3：5’cgctcaacagagtcacttttggaaccaa 3’ 

在序列1所示引物的5’端添加特异荧光序列FAM(5’GAAGGTGACCAAGTTCATGCT3’)，在序列2所示引物的5’端添加特异荧光序列HEX(5’GAAGGTCGGAGTCAACGGATT3’)。 

实施例2、SNP位点的应用 

选用22个非京411后代作为测试品种，以中麦175作为耐低磷能力对照品种(图1)。测试品种分别是京冬17、烟农19、科遗5214、中麦895、中麦875、济麦22、济麦23、济麦24、山农715、石麦15、石麦19、石优20、衡观35、良星99、郑麦0943、周麦16、周麦18、周麦22、洛旱2号、矮抗58、小偃101、Wheatear。 

1、检测不同品种的小麦苗期耐低磷能力 

品种的苗期耐低磷能力检测在中国农科院作物科学研究所温室中进行。采用营养液培养法，设置3个KH₂PO₄浓度营养液：0、0.005、0.25(m mol/L)KH₂PO₄。基础营养液为：K₂SO₄0.75、KCl 0.1、MgSO₄0.6、FeEDTA 4.0×10^-2、H₃BO₃1.0×10^-3、MnSO₄1.0×10^-3、ZnSO41.0×10^-3、CuSO₄1.0×10^-4、(Na)₆Mo₂O₄5.0×10^-6、Ca(NO₃)₂2.0。在不施和低磷处理中用KCl将K+补充到0.25m mol/L相同水平，具体配方如下： 

0m mol/L KH₂PO₄营养液(m mol/L)：除了基础营养液以外，补充0.25m mol/LKCl，组成0m mol/L KH₂PO₄营养液； 

0.005m mol/L KH₂PO₄营养液：将基础营养液与0.005m mol/L KH₂PO₄混合，另补充0.245m mol/L KCl，组成0.005m mol/L KH₂PO₄营养液； 

0.25m mol/L KH₂PO₄营养液：将基础营养液与0.25m mol/L KH₂PO₄混合，组成0.25m mol/L KH₂PO₄营养液。 

处理方法：每品种选取种子50粒，用10％的H₂O₂处理20-30分钟，无菌水冲洗5-6次。选取饱满且大小一致的种子置于铺有滤纸的培养皿中，在培养箱暗室催芽。待种子露白后，移栽至石英砂中培养一周。挑选长势均匀的幼苗移栽至有含有不同浓度KH₂PO₄营养液的培养盒中。每3天更换一次营养液，连续培养20天后收获。测量每个处理下地上部干重SDW₀(0m mol/L KH₂PO₄)、SDW₁(0.005m mol/L KH₂PO₄)、SDW₂(0.25m mol/L KH₂PO₄)，计算不施磷和低磷下的耐低磷能力(Ability of tolerance to low phosphorus,ATP)，计算公式如下： 

ATP₀＝(SDW₀/SDW₂)×100；ATP₁＝(SDW₁/SDW₂)×100。 

ATP₀和ATP₁分别为不施磷和低磷下的耐低磷能力。 

结果见表2所示。 

2、检测不同品种小麦的SNP位点的基因型 

分别提取各个品种小麦的基因组DNA，以基因组DNA为模板，在序列1所示引物的5’端添加特异荧光序列FAM(5’GAAGGTGACCAAGTTCATGCT 3’)，在序列2所示引物的5’端添加特异荧光序列HEX(5’GAAGGTCGGAGTCAACGGATT 3’)。携带FAM的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示红色，而携带HEX的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示蓝色。 

将序列1与序列3组合，序列2与序列3组合，以这两组引物分别对同一材料DNA进行PCR扩增。序列1与序列3组合可以扩增SNP位点基因型为G:G的片段，序列2与序列3组合可以扩增SNP位点基因型为A:A的片段。 

PCR扩增体系如下：12μLPCR反应体系包括：特异引物组合中每条引物终浓度为0.25uM，终浓度为1mmol·L^-1的Tris-HCl(pH 9.0)，终浓度为5mmol·L^-1的KCl，终浓度为2.5mmol·L^-1的MgCl₂(Promega公司)，终浓度为200μmol·L^-1的dNTPs(TaKaRa公司)，Taq DNA聚合酶1.5U(Tiangen公司)，模板DNA 15ng。 

PCR扩增反应在PTC-200PCR扩增仪上进行，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性20s，50℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸4min；10℃保存。 

将得到的PCR扩增产物在荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，然后在KlusterCaller^TM软件读取分型后的数据，仅显示蓝色图像则说明待测小麦1B染色体132.6cM位置的基因的第56bp处SNP位点为A，基因型为A:A(将PCR扩增产物送去测序，序列为序列表中序列4，且第56bp处碱基为A)；仅显示红色图像则说明SNP位点碱基为G，基因型为G:G(将PCR扩增产物送去测序，序列为序列表中序列4，且第56bp处碱基为G)；显示红色和蓝色图像则说明SNP位点碱基为G/A，基因型为G:A(将PCR扩增产物送去测序，序列为序列表中序列4，且第56bp处碱基为A/G)。 

对各个品种的小麦PCR扩增产物进行两两比较， 

若A小麦的PCR扩增产物仅为显示红色(其1B染色体132.6cM位置的基因第56位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体，基因型为G：G)，B小麦的PCR扩增产物为仅显示蓝色或显示红色和蓝色(其1B染色体132.6cM位置的基因第56位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体，基因型为A：A或其1B染色体132.6cM位置的基因第56位脱氧核糖核苷酸为G/A杂合体，基因型为G：A)，则A小麦的耐低磷能力高于B小麦。 

上述各个小麦的基因型及其小麦耐低磷能力见表2所示。 

表2为22个品种的SNP位点的基因型和耐低磷能力结果 

耐低磷能力 

以上结果表明，京冬17、烟农19、中麦895、中麦875、济麦22、济麦23、济麦24、山农715、石麦15、石麦19、石优20、衡观35、周麦16、周麦18、洛旱2号、小偃101和Wheatear在SNP位点基因型为G:G，表现为耐低磷能力较强，而科遗5214、良星99、郑麦0943、周麦22和矮抗58在SNP位点基因型为A:A，表现为耐低磷能力较弱。 

将上述基因型判断小麦耐低磷能力与上述1计算小麦耐低磷能力结果一致，说明 本发明的方法正确。 

上述结果表明，上述SNP位点能够快速、有效地鉴别小麦品种苗期是否具有较高的耐低磷能力。