一种文多林的提取及纯化方法

摘要

本发明公开了一种文多林的提取及纯化方法，步骤包括：将长春花全株盐津、冷冻干燥、粉碎；将粉末加入水中，调节pH后进行萃取，萃取物再调节pH进行萃取，得文多林粗品；所得粗品在混合溶剂中重结晶，得文多林纯品。本发明步骤简洁、耗用时间少，产品溶出迅速，采用pH梯度分离的方法，不需过柱，直接得到纯度高的文多林粗品，再经过一次结晶即可得到99%以上的高纯度文多林，不仅简化了纯化过程，更为快速地实现了文多林的分离和纯化，且最终得到的产品收率高、纯度高，更为满足市场需求。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从长春花中提取并分离纯化文多林的方法，属于药物提取技术领域。

背景技术

长春花是夹竹桃科长春花属一种重要的药用植物，原产南亚、非洲东部及美洲热带。长春花全草入药可止痛、消炎、安眠、通便及利尿，全株具有毒性，误食后会造成白血球减少、血小板减少、肌肉无力、四肢麻痹等症状。长春花尤其根部中含有很多吲哚类生物碱，具有很好的药用价值。文多林（Vindoline，又名文多灵）是长春花生物碱中的一种，动物实验表明其具有降血糖、利尿、降血脂作用，对某些人病原菌有抑制作用，是合成临床上广泛应用的抗肿瘤药物酒石酸长春瑞滨、硫酸长春碱、长春新碱的重要起始原料之一，具有广泛的应用。

目前，主要采用先从长春花地上部分茎、叶、花中提取出长春花总生物碱，然后再通过层析柱纯化结晶分离出文多林的方式提取文多林，这种方法以长春花地上部分为原料，文多林含量少，提取步骤繁琐、耗费时间长、文多林得量少，不适于工业化生产。

发明内容

本发明提供了一种文多林的提取及纯化方法，该方法对文多林的提取和分离纯化都进行了改进，简化了工艺，所得文多林提取率高、纯度高。

本发明以新鲜的长春花全株为起始原料，增大了文多林的含量，通过提取、pH萃取分离纯化可以得到纯度78%左右的文多林粗品，再通过特殊重结晶溶剂的选择即可得到纯度99.0 %以上的高纯度的文多林产品，不使用色谱分离柱，简化了工艺流程，降低了成本，具体技术方案如下：

一种文多林的提取及纯化方法，包括以下步骤：

（1）取新鲜的长春花全株，用氯化钠水溶液超声浸泡，然后取出直接放入流速为5-8m/s的-15～-25℃的冷空气中冷冻干燥，冷冻干燥后将长春花全株粉碎；

（2）将步骤（1）的长春花加入水中，调节pH为1.3-1.6，超声浸泡2-3h，过滤取滤液，将滤液调整pH为8-9，然后以喷雾的形式从萃取罐顶部喷入，同时将萃取剂以喷雾的形式从萃取罐的下部喷入，喷入完毕萃取收集有机相；所述萃取剂为正溴丙烷和乙醇的混合物；

（3）将有机相减压除去溶剂，剩余物用无水乙醇完全溶解，加入硫酸的乙醇溶液调节pH至3.8-4.1，静置、分离，取滤液；

（4）将步骤（3）的滤液减压蒸干，剩余物用柠檬酸水溶液溶解，所得溶液pH为1.5-2.5，然后用二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液萃取，有机相减压蒸干，得文多林粗品；

（5）将文多林粗品加入甲醇、乙醚、石油醚和乙酸乙酯的混合液中重结晶，所得晶体即为文多林纯品。

上述步骤（1）中，长春花为新鲜的带根的全株长春花，长春花全株与氯化钠水溶液的质量比为1：8-9。

上述步骤（1）中，氯化钠水溶液的浓度为2-10wt%，优选为5wt%。

上述步骤（1）中，用氯化钠水溶液超声浸泡15min。

上述步骤（1）中，冷冻干燥30-50min。

上述步骤（2）中，长春花全株粉末加入其质量3-5倍的水中。

上述步骤（2）中，正溴丙烷和乙醇的体积比为10:0.5-2.8，优选10：1.3。 

上述步骤（2）中，滤液与萃取剂的体积比为4.5:1～5.5:1，优选4.8:1。

上述步骤（2）中，滤液喷入萃取罐的速度为150-200ml/s，滤液和萃取剂同一时间喷完。

上述步骤（3）中，剩余物用其质量1-3倍的无水乙醇溶解。

上述步骤（3）中，硫酸的乙醇溶液是以硫酸为溶质、以乙醇为溶剂形成的溶液。

上述步骤（4）中，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为10:1-5，优选10：2.5。

上述步骤（4）中，二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液与步骤（4）中滤液减压蒸干所得剩余物的质量比为3-6:1，优选5:1。

 上述步骤（5）中，甲醇、乙醚、石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:2.5-3.5：0.3-0.8:0.2-0.6，优选为1：3：0.5：0.5。

上述步骤（5）中，文多林粗品与甲醇、乙醚、石油醚和乙酸乙酯总体积的比值为1g：2.5-5ml，优选1g：3ml。

上述步骤（5）中，重结晶过程为：将文多林粗品加入甲醇、乙醚、石油醚和乙酸乙酯的混合液中，常温超声至有晶体生成后，在-18℃低温静置24h，析晶，所得晶体在-18℃抽滤，-20℃冻干，得文多林纯品。

本发明方法中，采用新鲜的长春花全株（包括根部）进行提取的全新提取工艺，大大提高了文多林的收率。在起始阶段，先通过盐浸-冷冻干燥对长春花全株进行预处理，可以除掉长春花部分溶于水的色素杂质，而且可以使长春花全株尤其根部变脆，便于粉碎，利于下步产品的溶出。然后在不同的pH条件下进行提取和萃取分离纯化，萃取剂和提取液以喷雾的形式接触、大大提高了萃取效率，并且通过对萃取剂的调配，提高了文多林的含量及得率。

本发明将粗品放入甲醇、乙醚、石油醚和乙酸乙酯的混合液中进行结晶，结晶前先进行超声处理，以使晶粒形貌更为均匀，一次结晶后即可得到纯度可达99%以上的文多林产品，无需多次过柱，重复结晶，大大提高了产品的收率。

本发明步骤简洁、耗用时间少，产品溶出迅速，采用pH梯度分离的方法，不需过柱，直接得到纯度高的文多林粗品，再经过一次结晶即可得到99%以上的高纯度文多林，不仅简化了纯化过程，更为快速地实现了文多林的分离和纯化，且最终得到的产品收率高、纯度高，更为满足市场需求。

附图说明

图1为实施例1所得纯化产品的红外谱图。

图2为市售文多林对照品的红外谱图。

图3为实施例1所得纯化产品的高效液相谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明中，文多林的含量测定方法为：高效液相色谱法，高效液相色谱的条件如下：

  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH至4.2)-0.2wt%癸烷磺酸钠的甲醇溶液（体积比33：67）为流动相，检测波长为267nm，柱温40℃。 

流速：1.0ml/min。

下述实施例中，得率的计算方法为：得率=所得文多林粗品或文多林纯品的质量/长春花的总质量。

实施例1

以新鲜的全株长春花（包括根）为原料，按照下述方法提取分离文多林：

1、文多林粗品的提取制备：

（1）取100kg全株长春花，加入850kg5wt%的氯化钠水溶液中，超声浸泡15min，然后将长春花取出直接放入流速为6.5m/s的-20℃的冷空气中冷冻干燥40min，冷冻干燥后将长春花粉碎。

（2）将步骤（1）处理后的全株长春花粉末加入300kg的水中，用磷酸调节pH为1.5，超声浸泡3h，过滤取滤液，滤液用氨水调整pH为8-9，调整好pH后，将滤液加高压，以喷雾的形式从萃取罐顶部喷入，速度为180 ml/s，同时将萃取剂也加高压，以喷雾的形式从萃取罐的底部喷入，滤液与萃取剂的体积比为4.8：1，滤液和萃取剂同时喷入萃取罐，同时喷完，喷入完毕后静置5-10min，收集有机相；所述萃取剂为体积比为 10:1.3的正溴丙烷和乙醇的混合物。

（3）将有机相减压蒸馏，得固体250.2g，将固体加入乙醇700ml溶解，然后加入质量浓度为5%的硫酸乙醇溶液调节pH为3.8-4.1，静置，至沉淀析出完全，离心过滤，取滤液，将滤液干燥，得固体225.1g；

（4）将所得固体用柠檬酸水溶液溶解完全，并通过调整柠檬酸水溶液的浓度使溶液pH至2.0，再用体积比为10:2.5的二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液萃取（二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液与该固体的质量比为5:1）收集有机相，减压抽干得文多林粗品55.3g。经计算，文多林的得率为0.553‰，经HPLC检测，粗品中文多林含量为81.2%。

2、文多林的精制：

将55.3g文多林粗品加入165.9ml体积比为1：3：0.5：0.5的甲醇、乙醚、石油醚和乙酸乙酯的混合液中，常温超声5min，待有晶体生成后，在-18℃低温静置24h，析晶，所得晶体在-18℃低温抽滤，-20℃冻干，得高纯度文多林39.5g。

图1为本实施例精制所得的文多林的红外谱图，图2为市售文多林对照品的红外谱图，通过对比可以看出本发明所得产品与文多林对照品图谱一致，说明本发明提取纯化产品为文多林。

图3为高纯度文多林的高效液相色谱图，图谱分析结果如下表，从表中可以看出，文多林纯度为99.7%。

HPLC分析结果

 名称保留时间峰面积面积百分含量峰高1 4.167398820.2917502文多林6.4771376557299.711187122

实施例2

1、文多林粗品的提取制备：

按照实施例1的方法提取文多林粗品，不同的是：步骤（2）中滤液与萃取剂的体积比为5.5：1，所述萃取剂为体积比为 10:0.5的正溴丙烷和乙醇的混合物；步骤（4）中，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为10: 5。所得文多林粗品的质量为50.5g，得率为0.505‰，HPLC检测纯度为75.5%。

2、文多林的精制：

  将50.5g文多林粗品加入151.5ml体积比为1：3：0.5：0.5的甲醇、乙醚、石油醚和乙酸乙酯的混合液中，常温超声5min，待有晶体生成后，在-18℃低温静置24h，析晶，所得晶体在-18℃低温抽滤，-20℃冻干，得高纯度文多林33.5g，经HPLC检测其纯度为99.5%。

实施例3

按照实施例1的方法提取精制文多林，不同的是：精制文多林时，甲醇、乙醚、石油醚和乙酸乙酯的体积比为1：3.5：0.3：0.6。所得高纯度文多林37.1g，经HPLC检测其纯度为99.5%。

实施例4

以新鲜的全株长春花（包括根）为原料，按照下述方法提取分离文多林：

1、文多林粗品的提取制备：

（1）取100kg全株长春花，加入800kg10wt%的氯化钠水溶液中，超声浸泡15min，然后将长春花取出直接放入流速为8m/s的-20℃的冷空气中冷冻干燥40min，冷冻干燥后将长春花粉碎。

（2）将步骤（1）处理后的全株长春花粉末加入400kg的水中，用磷酸调节pH为1.5，超声浸泡3h，过滤取滤液，滤液用氨水调整pH为8-9，调整好pH后，将滤液加高压，以喷雾的形式从萃取罐顶部喷入，速度为150 ml/s，同时将萃取剂也加高压，以喷雾的形式从萃取罐的底部喷入，滤液与萃取剂的体积比为4.5：1，滤液和萃取剂同时喷入萃取罐，同时喷完，喷入完毕后静置5-10min，收集有机相；所述萃取剂为体积比为 10:2.8的正溴丙烷和乙醇的混合物。

（3）将有机相减压蒸馏，得固体239.2g，将固体用700ml的乙醇溶解，然后加入质量浓度为5%的硫酸的乙醇溶液调节pH为3.8-4.1，静置，至沉淀析出完全，离心过滤，取滤液，将滤液干燥，得固体218.5g；

（4）将所得固体用柠檬酸水溶液溶解完全，并通过调整柠檬酸水溶液的浓度使溶液pH至1.5，再用体积比为10:5的二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液萃取（二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液与该固体的质量比为3:1），收集有机相，减压抽干得文多林粗品45.2g。经计算，文多林的得率为0.452‰，经HPLC检测，粗品中文多林含量为73.5%。

2、文多林的精制：

  将45.2g文多林粗品加入113ml体积比为1：2.5：0.8：0.2的甲醇、乙醚、石油醚和乙酸乙酯的混合液中，常温超声5min，待有晶体生成后，在-18℃低温静置24h，析晶，所得晶体在-18℃低温抽滤，-20℃冻干，得高纯度文多林25.2g，经HPLC检测其纯度为99.2%。

实施例5

以新鲜的全株长春花（包括根）为原料，按照下述方法提取分离文多林：

1、文多林粗品的提取制备：

（1）取100kg全株长春花，加入900kg2wt%的氯化钠水溶液中，超声浸泡15min，然后将长春花取出直接放入流速为5m/s的-20℃的冷空气中冷冻干燥40min，冷冻干燥后将长春花粉碎。

（2）将步骤（1）处理后的全株长春花粉末加入500kg的水中，用磷酸调节pH为1.5，超声浸泡3h，过滤取滤液，滤液用氨水调整pH为8-9，调整好pH后，将滤液加高压，以喷雾的形式从萃取罐顶部喷入，速度为200 ml/s，同时将萃取剂也加高压，以喷雾的形式从萃取罐的底部喷入，滤液与萃取剂的体积比为5.5：1，滤液和萃取剂同时喷入萃取罐，同时喷完，喷入完毕后静置5-10min，收集有机相；所述萃取剂为体积比为 10:0.5的正溴丙烷和乙醇的混合物。

（3）将有机相减压蒸馏，得固体237.2g，将固体用其1质量倍的乙醇溶解，然后加入质量浓度为5%的硫酸的乙醇溶液调节pH为3.8-4.1，静置，至沉淀析出完全，离心过滤，取滤液，将滤液干燥，得固体216.3g；

（4）将所得固体用柠檬酸水溶液溶解完全，并通过调整柠檬酸水溶液的浓度使溶液pH至2.5，再用体积比为10:1的二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液萃取（二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液与该固体的质量比为6:1），收集有机相，减压抽干得文多林粗品43.2g。经计算，文多林的得率为0.432‰，经HPLC检测，粗品中文多林含量为73.3%。

2、文多林的精制：

将43.2g文多林粗品加入216ml体积比为1：3.5：0.3：0.6的甲醇、乙醚、石油醚和乙酸乙酯的混合液中，常温超声5min，待有晶体生成后，在-18℃低温静置24h，析晶，所得晶体在-18℃低温抽滤，-20℃冻干，得高纯度文多林24.6g，经HPLC检测其纯度为99.2%。

实施例6

按照实施例1的方法提取文多林粗品，不同的是：步骤（3）中，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为10: 2。所得文多林粗品的质量为52.5g，得率为0.525‰，HPLC检测纯度为78.6%。

实施例7

按照实施例1的方法提取文多林粗品，不同的是：步骤（2）中，滤液以160 ml/s的速度喷入萃取罐中，滤液与萃取剂的体积比为4.5：1。所得文多林粗品的质量为52.9g，得率为0.529‰，HPLC检测纯度为79.6%。

对比例1

按照实施例1的方法提取、精制文多林，不同的是：将55.3g文多林粗品加入165.9ml体积比为1：0.5：0.5的甲醇、石油醚和乙酸乙酯的混合液中。最终所得高纯度文多林30.8g，经HPLC检测其纯度为99.0%。

对比例2

按照实施例1的方法提取文多林粗品，不同的是：步骤（2）中所用萃取剂为单一的正溴丙烷，步骤（3）中萃取含文多林的柠檬酸水溶液所用的有机溶剂为单一的二氯甲烷。最终所得文多林粗品45.7g，得率为0.457‰，经HPLC检测纯度为69.8%。