中国林蛙皮肤胶原蛋白的提取纯化及性质研究

摘要

胶原(Collagen)是由三条肽链组成的螺旋形、纤维状蛋白质，富含于动物的骨、结缔组织和皮肤中，组成胶原分子的肽链被称为胶原蛋白。中国林蛙是重要的特种经济动物，提取林蛙卵油后留下大量的蛙皮废弃物中富含胶原蛋白。研究表明，胶原蛋白具有合成高分子不可比拟的生物相容性、生物降解性和低抗原性，因此应用领域广泛。主要用于生物医学材料、食品、营养保健品、化妆品等。本文为了充分利用中国林蛙资源，对蛙皮胶原蛋白进行了提取纯化和性质研究。
　　通过测定，得到林蛙皮肤中胶原蛋白含量不少于26％，是一种很好的胶原蛋白提取原料。
　　为提高测定数据的准确性，对消解测定方法进行了修正，建立了适用于中国林蛙皮肤胶原蛋白含量的计算公式，添加了校正因子λ=1.23。并最终得到适合于中国林蛙皮胶原蛋白含量测定的计算公式:M0=（C×稀释倍数×总体积/换算系数）×λ。
　　本试验采用酸酶结合提取，破坏一部分肽键，使得胶原变成可以被醋酸溶解的可溶性胶原蛋白，从而达到提取的目的。对酸酶结合提取条件进行了优化，优化后的提取条件为:m（胃蛋白酶）∶m（原料）=1∶50，提取温度37℃，保温时间72h，提取缓冲液50ml0.5mol/L冰醋酸，提取两次，最终的提取率可达到81.66％，正交试验方差分析表明，酶解温度是影响提取率的重要因素，对结果的影响最为显著。
　　对提取得到的胶原蛋白溶液进行纯化。经过超滤浓缩、盐析沉淀、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等纯化步骤后，胶原蛋白溶液浓度达到34.5g/L，纯化倍数为2.326倍，纯度达到96.1％，胶原蛋白总质量1.04g，回收率为39.8％。
　　真空冷冻干燥得到胶原蛋白产品，外观呈松散的絮状，白色略带黄，密度极低，约为0.002g/cm3，极易吸水，吸水后有粘滞感，易粘手，聚成片状。
　　经测定中国林蛙皮肤胶原蛋白的含水量为16.44％。等电点为5.8。在273.5nm处有一个较明显的紫外吸收峰。经SDS-PAGE电泳测定，得到两条较明显的条带，分子量分别为107KD和89KD左右，说明本试验得到了胶原分子解链后的两个α组分蛋白。
　　本文首次以中国林蛙皮肤为原料进行胶原蛋白的提纯和性质研究，为深度开发林蛙资源、节约成本做出了有意义的探索。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．1．1 胶原的定义及存在

1．1．2 胶原与明胶以及胶原蛋白的区别

1．1．3 人体内胶原蛋白的含量及种类

1．2 胶原及胶原蛋白的研究进展

1．2．1 胶原及胶原蛋白的制备方法

1．2．2 胶原蛋白产品商业化

1．2．3 胶原及胶原蛋白的检测和性质分析

1．3 胶原蛋白的应用

1．3．1 胶原蛋白在美容化妆品中的应用

1．3．2 胶原蛋白在保健品食品领域的应用

1．3．3 胶原及胶原蛋白在生物医学领域的应用

1．3．4 胶原用于研究用途

1．3．5 胶原蛋白的其它用途

1．4 利用中国林蛙皮肤提取胶原蛋白

1．5 本论文的研究方向与基本原理

2 含量测定及测定方法的改进

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 药品与试剂

2．1．3 仪器

2．2 方法

2．2．1 蛙皮原料胶原蛋白含量的测定

2．2．2 消解方法加标回收率的测定

2．2．3 胶原蛋白含量测定方法的改进

2．3 结果与分析

2．3．1 蛙皮原科胶原蛋白含量的测定

2．3．2 消解方法的加标回收率

2．3．3 胶原蛋白含量测定方法的改进

2．4 本章小结

3 中国林蛙皮肤胶原蛋白提取条件的优化

3．1 材料

3．1．1 试验材料

3．1．2 药品与试剂

3．1．3 仪器

3．2 方法

3．2．1 提取缓冲液的确定

3．2．2 酸酶对比提取试验

3．2．3 蛋白酶种类对胶原蛋白提取率的影响

3．2．4 酶提取的最佳工艺条件试验

3．2．5 正交实验确定酶法提取胶原蛋白最佳条件

3．3 结果与分析

3．3．1 提取缓冲液的确定

3．3．2 酸酶对比提取试验

3．3．3 提取胶原蛋白用酶种类的确定

3．3．4 酶提取的最佳工艺条件试验

3．3．5 酶法提取胶原蛋白最佳条件正交实验结果

3．4 本章小结

4 胶原蛋白的纯化与性质分析

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 药品与试剂

4．1．3 仪器

4．2 方法

4．2．1 纯化

4．2．2 成品的制备与部分性质测定

4．3 结果与分析

4．3．1 纯化结果与分析

4．3．2 成品的制备与部分性质测定

4．4 本章小结

结论

参考文献

攻渎学位期间发表的学术论文

致谢

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