一种糖基转移酶及其突变体在合成人参皂苷Rh2中的应用

摘要

本发明公开了一种糖基转移酶，可以催化原人参二醇糖基化合成稀有人参皂苷Rh2。对于该糖基转移酶进行了改造，得到了其催化效率优化的多个突变体。这些突变体用于体外酶法合成稀有人参皂苷Rh2的产率比野生型有明显提高。并且该糖基转移酶及其突变体可以用于微生物体内全合成稀有人参皂苷Rh2。

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种糖基转移酶及其突变体，尤其涉及一种 糖基转移酶及其突变体在转糖基化合成稀有人参皂苷Rh2中的应用。

背景技术

人参皂苷作为人参的主要药用活性物质，是一种三萜皂苷，属于固醇类化合物。 具有血管舒张、抗氧化、抗炎及抗肿瘤等功效。人参皂苷的结构因糖基侧链不同，显 示出的性质和功能也有较大差异。其中研究最多且与肿瘤细胞凋亡相关的有Rh2与 Rg3，它们具有较高的抗肿瘤活性，且对正常细胞无毒副作用，这类化合物的相关产 品已在临床广泛使用。因此，获得大量、高纯度的人参皂苷成为现代药学的研究热点。

目前，人参皂苷主要从栽培人参中提取，国内对从药用人参原料中提取人参总皂 苷及单体皂苷进行了大量的研究，人参皂苷的提取方法有：水提取法，有机溶剂提取 法，蒸馏法，超声浸渍法及超临界CO₂萃取法等。由于人参生长周期长，且提取人参 皂苷的工艺流程复杂，因此生产成本较高。此外人参皂苷Rh2属于稀有人参皂苷，在 人参中的含量极低，提取产量受限，主要是通过对提取的总皂苷进行酶法转化，提高 其中高药用活性的稀有人参皂苷的含量，再经过一系列分离纯化过程获得Rh2单体 皂苷，但是仍然受限于人参药材载体及其中的皂苷含量。生产工艺复杂，产量低， 成本较高，难以实现大规模生产稀有人参皂苷的要求。

近年来，合成生物学渗透到了天然产物开发的各个环节中，尤其为天然产物的制 造开辟了一条新的有效途径。例如，Keasling实验室利用酵母在体内合成青蒿素前体 青蒿酸，通过对代谢途径不断改造与优化使青蒿酸的产量实现了若干数量级的提高， 最终青蒿酸达到25g/L的产量(Nature,2006,440:940-943；Nature,2013,496:528-532)； Gregory研究组利用大肠杆菌首次合成了紫杉醇的前体紫杉二烯(Science,2010, 330:70-74)。在微生物中重建药用次生代谢物的生物合成途径制备高附加值产品显示 出良好的应用前景。此外，张学礼研究组在酿酒酵母中构建了人参二醇型皂苷苷元的 生物合成途径，通过代谢工程及发酵工程优化，原人参二醇的产量达到1g/L以上 (Metabolic Engineering,2013,20:146-156)，这为体外酶法合成或微生物体内全合成稀 有人参皂苷奠定了基础。然而与人参皂苷合成相关的糖基转移酶基因报道较少，糖基 转移酶是生物界广泛存在的多基因家族蛋白，只在少数植物中被克隆，通过酶活性方 法进行鉴定的则更少，其中参与三萜皂苷的糖基转移酶仅在蒺藜苜蓿、王不留行等植 物中进行了研究。近期，周志华课题组鉴定了人参中催化原人参二醇合成人参皂苷CK 的糖基转移酶基因(Cell Research,2014:1-4)。目前仍然没有与稀有人参皂苷Rh2合成 相关的糖基转移酶基因的报道。

糖基转移酶基因的缺乏使得稀有人参皂苷Rh2的异源合成难以实现，因此糖基转 移酶基因的挖掘显得尤为重要。随着测序技术的不断进步，基因数据库资源不断膨胀， 这为功能酶基因的筛选奠定了良好的基础。

因此，从丰富的基因库中筛选潜在的可催化原人参二醇糖基化合成稀有人参皂苷 Rh2的功能基因是获得相关糖基转移酶基因的有效途径之一。

通过以原人参二醇为底物在体外酶法转化合成或微生物体内全合成的方法，可提 高人参皂苷Rh2的产量。然而这两种方法都需要获得可催化原人参二醇合成稀有人参 皂苷Rh2的糖基转移酶基因，至今仍没有此功能基因的报道。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是开发一种有效的糖基 转移酶，用于体外酶法转化及微生物体内全合成法合成稀有人参皂苷Rh2。

为实现上述目的，本发明提供了一种糖基转移酶及其突变体，并利用改良的糖基 转移酶实现了人参皂苷Rh2的体外酶法和微生物体内全合成。

本发明人借助基于化合物、化学反应的检索工具Rxnfinder，结合PIR、NCBI 等数据库资源，基于底物相似性及催化反应类型等原则，筛选了一些可能催化原 人参二醇3位羟基糖基化反应的糖基转移酶基因。将筛选的基因在大肠杆菌表达 系统中进行功能表达，获得重组蛋白的粗酶液。经实验证明，其中来源于酿酒酵 母Saccharomyces cerevisiae S288c的UGT51糖基转移酶可催化原人参二醇的糖基 化反应。获得的糖基化产物单一，优化后对底物原人参二醇的转化率为61％。

第一方面，本发明提供了一种转糖基合成稀有人参皂苷Rh2的糖基转移酶及其编 码的基因，该基因为来源于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c的糖基转移酶 基因UGT51，将该糖基转移酶命名为UGT51蛋白。所述蛋白的基因序列为SEQ  NO:1，氨基酸序列为SEQ NO:2；所述蛋白去除N末端膜结合区后获得的蛋白的 基因序列为SEQ NO:3，氨基酸序列为SEQ NO:4。

进一步地，上述糖基转移酶也可以是经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸 且与SEQ NO:2或SEQ NO:4所示蛋白具有相同功能的衍生蛋白。

第二方面，本发明提供了UGT51糖基转移酶的突变体，所述突变体是通过用 另一种氨基酸残基取代野生型UGT51糖基转移酶的一个或多个位置上的氨基酸残 基而获得的糖基转移酶突变体；优选的取代位置为由SEQ NO:2表示的UGT51糖 基转移酶氨基酸序列的第801、802、804、812、815、816、849、888、892位或 它们的相应位置，突变体催化原人参二醇糖基化合成人参皂苷Rh2的活性比野生 型显著提高。

进一步地，所述的糖基转移酶突变体是通过用另一种氨基酸残基取代与野生 型UGT51糖基转移酶表现出至少90％同源性的氨基酸序列的糖基转移酶的一个或 多个位置上的氨基酸残基而获得的糖基转移酶突变体；优选的取代位置为由SEQ  NO:2表示的UGT51糖基转移酶氨基酸序列的第801、802、804、812、815、816、 849、888、892位或它们的相应位置，突变体催化原人参二醇糖基化合成人参皂苷 Rh2的活性比野生型显著提高。

更进一步地，用于取代原有氨基酸残基的所述另一种氨基酸残基优选为丙氨 酸(氨基酸缩写名称为A)或缬氨酸(氨基酸缩写名称为V)。

在该糖基转移酶的突变点对应的编码的核苷酸编码，应理解为本发明所述的 “另一种氨基酸残基”所编码的核苷酸编码。

具体地，本发明还提供了一些优选的糖基转移酶突变体及其编码的基因，它 们的出发糖基转移酶的基因序列为序列表中的SEQ NO:1，出发氨基酸序列为序列 表中的SEQ NO:2。它们分别是第801位丝氨酸被丙氨酸取代的突变体，第802位 亮氨酸被丙氨酸取代的突变体，第804位缬氨酸被丙氨酸取代的突变体，第812 位赖氨酸被丙氨酸取代的突变体，第815位精氨酸被丙氨酸取代的突变体，第816 位谷氨酸被丙氨酸取代的突变体，第849位丝氨酸被丙氨酸取代的突变体，第849 位丝氨酸被缬氨酸取代的突变体，第888位赖氨酸被丙氨酸取代的突变体，第892 位天冬酰胺被丙氨酸取代的突变体。在序列表中的SEQ NO:4表示的氨基酸序列的 对应位置取代的突变体也包含在内。

第三方面，本发明还进一步提供了包含编码上述糖基转移酶或其突变体基因 的重组载体，以及包含所述重组载体的转化体(例如本发明所述的微生物)。

本发明所述的重组载体，应理解为现有技术中任意的基因的重组载体，例如 各种质粒，即将糖基转移酶突变体的突变基因导入能使该糖基转移酶突变体稳定 表达的DNA载体质粒。

而所述的重组载体的转化体，即指重组载体的宿主细胞，例如，本发明实施 例4所述的微生物E.coli BL21的宿主细胞；当然，现有技术常用的宿主细胞的微 生物包括革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌，放线菌 如链霉菌，酵母如酿酒酵母，真菌如曲霉菌，它们的细胞均是常用的重组载体的 宿主细胞。

第四方面，本发明提供了一种使用糖基转移酶转糖基化体外合成人参皂苷Rh2 的方法，该方法以原人参二醇和糖基供体UDPG为原料，在糖基转移酶的催化作 用下，原人参二醇的3位羟基发生糖基化反应，生成稀有人参皂苷Rh2。

优选地，所述糖基转移酶为UGT51糖基转移酶或去除N末端膜结合区后获得 的糖基转移酶，或上述第二方面所提供的糖基转移酶突变体。在相同条件下， UGT51糖基转移酶突变体催化原人参二醇糖基化合成人参皂苷Rh2的效率比野生 型提高35％-50％。

优选地，所述糖基供体与原人参二醇的比例为1:1～10:1(w/w)。

优选地，所述糖基供体的浓度为0.5～10g/L，所述原人参二醇的浓度为0.01～1g/L。

作为本发明的进一步改进，所述的原人参二醇溶解在非水相中。

优选地，所述非水相为亲水性有机溶剂，所述亲水性有机溶剂选自甲醇、二甲基 亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙二醇二甲醚(DME)中的任意一种。

优选地，所述原人参二醇溶解在所述亲水性有机溶剂中后，加入反应体系中的亲 水性有机溶剂的最终浓度为5％～20％(v/v)。

第五方面，本发明还提供了一种应用UGT51基因及其突变基因在微生物体内合 成人参皂苷Rh2的方法。该方法以可生产原人参二醇的工程菌为基础，导入糖基 转移酶编码基因UGT51或其突变基因的表达盒，得到重组菌。发酵培养获得目标 产物人参皂苷Rh2。

所述糖基转移酶编码基因UGT51的表达盒进一步具体包括启动子PGK1、糖 基转移酶编码基因UGT51和终止子ADH1。

所述糖基转移酶编码基因UGT51突变基因的表达盒进一步具体包括启动子 PGK1、糖基转移酶编码基因UGT51突变基因和终止子ADH1。

所述微生物，例如，本发明实施例5所述的酿酒酵母细胞；当然，现有技术 常用微生物生产菌株包括革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性细菌如大 肠杆菌，放线菌如链霉菌，酵母如酿酒酵母，真菌如曲霉菌，它们的细胞均是常 用的生产菌株。

通过以上技术方案的实现，本发明达到了如下技术效果：

1、利用本发明所述的糖基转移酶蛋白在体外酶法合成人参皂苷Rh2，对底物原 人参二醇的转化率可达61％；其突变体在相同条件下，催化原人参二醇糖基化合成 人参皂苷Rh2的效率比野生型提高35％-50％；

2、利用本发明所述的糖基转移酶蛋白及其突变体成功地实现了在微生物体内全合 成人参皂苷Rh2。

3、本发明获得的UGT51糖基转移酶及其突变体可以用于体外酶法转化合成 及微生物体内全合成制备稀有人参皂苷Rh2，是区别于现有生产技术的一种新的生 产方法，生产过程简化、消耗低、产出高。

以下将结合附图对本发明的构思、具体实施方式及产生的技术效果作进一步说明， 以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是UGT51糖基转移酶体外催化原人参二醇转糖基反应的TLC图；

图2是原人参二醇糖基化产物的质谱(MS)谱图；

图3是原人参二醇糖基化产物的核磁共振¹H-NMR谱图；

图4是原人参二醇糖基化产物的核磁共振¹³C-NMR谱图；

图5是原人参二醇的HPLC谱图；

图6是原人参二醇及其糖基化产物的HPLC谱图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施 例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。

本发明所述的生物材料的来源的一般性说明：

1、引物合成：本发明中所使用的引物均由南京金斯瑞公司合成制备。

2、实验中所使用的Q5 High-Fidelity DNA聚合酶及T4 DNA连接酶等购自于 NewEngland Biolabs公司；PrimeSTAR HS高保真酶购自TakaRa公司；限制性内切酶 均购自于Fermentas公司；使用的DNA胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒均购自于 Axygen公司。

实施例1 转糖基化原人参二醇合成人参皂苷Rh2的糖基转移酶的筛选

借助基于化合物、化学反应的检索工具Rxnfinder，结合PIR、NCBI等数据库资 源，基于底物相似性及催化反应类型等原则，筛选了一些可能催化原人参二醇糖基化 的糖基转移酶基因，分别是来源于酿酒酵母的UGT51，来源于抗生链霉菌的OleD以 及来源于马铃薯的SGT2。其中来源于酿酒酵母的UGT51克隆获得，来源于抗生链霉 菌的OleD及来源于马铃薯的SGT2全基因合成获得。OleD、SGT2基因ORF全长以 NdeI、XhoI酶切位点克隆至pET28a(+)质粒。

使用真菌基因组提取试剂盒提取酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c的基因 组，使用引物UGT51-F和UGT51-R进行PCR扩增。扩增体系为：Q5 Reaction Buffer(5×) 10μL、dNTP(2.5mM)4μL、基因组模板0.5μL、引物(10μM)各2.5μL、Q5 High-Fidelity DNA聚合酶0.5μL、补充双蒸水至50μL。扩增条件为98℃预变性30秒；98℃变性 10秒、55℃退火10秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸2分钟。

UGT51-F：ATGCCCATCACTCAAATCATAT

UGT51-R：TTAAATCATCGTCCACCCTTC

将PCR扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体(北京全式金生物技术有限公司) 上。克隆体系为：PCR产物1μL、pEASY-Blunt载体1μL，混匀后室温反应10分钟， 热休克转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，过夜 培养后筛选阳性克隆，测序验证。测序结果表明在pEASY-Blunt载体上插入了正确的 目的基因UGT51(3597bp)，核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1，氨基酸序列为序列 表中SEQ ID NO:2。

设计表达引物时去除蛋白N末端膜结合区(1-721个氨基酸)，引物如下：

UGT51-F2:CAAGCATATGTTAATGATTGATGAGAATCCGC(带NdeI酶切位点)

UGT51-R2:CTAGCTCGAGTTAAATCATCGTCCACCCTTCA(带XhoI酶切位点)

使用Q5 High-Fidelity DNA聚合酶进行PCR扩增。扩增体系为：Q5 Reaction  Buffer(5×)10μL、dNTP(2.5mM)4μL、基因组模板0.5μL、引物(10μM)各2.5μL、Q5 High-Fidelity DNA聚合酶0.5μL、补充双蒸水至50μL。扩增条件为98℃预变性30秒； 98℃变性10秒、55℃退火10秒、72℃延伸1分钟(30个循环)；72℃延伸2分钟。

PCR产物和pET28a(+)质粒分别进行限制性内切酶NdeI、XhoI双酶切反应后，用 DNA胶回收试剂盒回收酶切产物，在T4 DNA连接酶的作用下进行连接反应，连接产 物热休克转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布到LB琼脂平板(含有50μg/mL卡 那霉素)，过夜培养后筛选阳性克隆，测序验证。测序结果表明在pET28a(+)载体上正 确地插入了目的基因片段。核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3，氨基酸序列为序列 表中SEQ ID NO:4。

筛选基因的重组表达质粒热休克转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，进行基因表 达。培养重组菌至OD为0.6-0.8时，添加0.4mM IPTG，在低温16℃诱导表达16h。4 ℃，6000rpm离心收集细胞，将细胞重悬于破碎缓冲液中，破碎缓冲液组成：含5mM DTT的Tris-HCl缓冲液(50mM，pH7.5)。1L的培养细胞最终重悬于100mL的破碎 缓冲液中。超声破碎后，4℃,14000rpm离心，收集上清即获得粗酶液。

诱导表达获得的重组蛋白粗酶液直接用于体外活性检测，如下配制反应溶液，总 体积为100μL：2mM鸟苷二磷酸葡萄糖(UDPG)、1mM原人参二醇、10mM氯化镁 (MgCl₂)、20mM Tris-HCl pH7.5，加入70％(v/v)粗酶液。30℃，180rpm反应12小时。 添加同体积的正丁醇终止反应，取上层有机相进行TLC分析。TLC展开剂为氯仿：甲 醇＝85:15，显色剂为：2.5％(w/v)四水合钼酸铵，1％(w/v)硫酸铈铵，10％(v/v)硫酸的水 溶液。在110℃加热5分钟显色。其中只有来源于酿酒酵母的UGT51蛋白可以催化原 人参二醇底物生成一个新的化合物，结果如图1所示，其中空白对照的反应体系中未 添加UDPG糖基供体。

进一步对反应体系进行LC-MS分析，仪器为HPLC 1290-MS 6230(Agilent)。使 用Agilent公司的C18柱(型号：XDB-C18，4.6×150mm，5μm)，流动相使用梯度洗 脱：0-20min，45-100％乙腈；20-25min，100％乙腈；25-28min，45％乙腈。柱温40℃， 流速：0.4 mL/min。化合物使用正离子模式离子化，离子化方式为电喷雾(ESI)。产 物的质谱图如图2所示，根据分子量判断，该化合物为原人参二醇的单糖基化产物， 产物HR-MS：m/z 623.4517[M+H]⁺，元素组成为C₃₆H₆₂O₈，M+H计算值为623.4517。

实施例2 糖基化产物的分离纯化及结构鉴定

按实施例1中的比例配制100mL的反应液。在30℃条件下，反应48小时。加入 同体积正丁醇终止反应。取上层有机相旋转蒸发干燥，用硅胶柱纯化，洗脱剂为氯仿: 甲醇＝85:15，每5mL等份收集，收集的样品进行TLC分析(条件同前所述)，获得原 人参二醇糖基化产物部分，纯度<90％。

进一步利用Sep-Pak tC18柱(Waters)对上述收集部分进行纯化，水(A)和乙腈 (B)作为洗脱剂，采用梯度洗脱(20％B、40％B、50％B、60％B、65％B、70％B、 75％B、80％B、85％B、90％B、100％B)，在70％及75％乙腈洗脱时，获得原人参二 醇糖基化产物部分，纯度达到98％。于40℃旋转蒸发或冷冻干燥得白色粉末，产物进 行核磁共振波谱结构分析及验证。产物的H谱及C谱的结果(图3、图4)与文献报 道的人参皂苷Rh2的图谱一致，证实反应产物为人参皂苷Rh2。

实施例3 UGT糖基转移酶野生型体外酶法转化合成人参皂苷Rh2

方案一

按照实施例1得到UGT51糖基转移酶粗酶液。

以二甲基亚砜(DMSO)、原人参二醇、尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)、Tris-HCl 缓冲配制反应溶液，反应溶液中有机溶剂DMSO的比例为10％(v/v)，原人参二醇 0.5g/L，Tris-HCl缓冲的摩尔浓度为50mmol/L，pH为7.5，UDPG与原人参二醇之比 为10:1(w/w)。按70％(v/v)比例添加UGT51糖基转移酶粗酶液于反应液中，30℃， 180rpm，反应48小时。

添加同体积正丁醇终止反应，萃取的有机相真空干燥后加甲醇溶解，进行HPLC 检测分析与定量，结果如图5和图6所示，图5为原人参二醇的HPLC谱图(反应 体系中未添加UDPG糖基供体)，图6为反应体系的分析结果。使用Agilent公司的 C18柱(型号：XDB-C18，4.6×150mm，5μm)，流动相使用梯度洗脱：0-14min，45-100％ 乙腈；14-18min，100％乙腈；18-20min，45％乙腈。柱温40℃，流速：1 mL/min，检 测波长203nm。

HPLC鉴定获知原人参二醇糖基化反应的转化率为61％。

方案二

按照实施例1得到UGT51糖基转移酶粗酶液。

以二甲基亚砜(DMSO)、原人参二醇、尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)、Tris-HCl 缓冲配制反应溶液，反应溶液中有机溶剂DMSO的比例为5％(v/v)，原人参二醇0.5g/L， Tris-HCl缓冲的摩尔浓度为50mmol/L，pH为7.5，UDPG与原人参二醇之比为5:1(w/w)。 按70％(v/v)比例添加UGT51糖基转移酶粗酶液于反应液中，30℃，180rpm，反应48 小时。

添加同体积正丁醇终止反应，萃取的有机相真空干燥后加甲醇溶解，进行HPLC 检测分析与定量。检测方法同方案一，HPLC鉴定获知原人参二醇糖基化反应的转化 率为53％。

方案三

按照实施例1得到UGT51糖基转移酶粗酶液。

以二甲基亚砜(DMSO)、原人参二醇、尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)、Tris-HCl 缓冲配制反应溶液，反应溶液中有机溶剂DMSO的比例为20％(v/v)，原人参二醇1g/L， Tris-HCl缓冲的摩尔浓度为50mmol/L，pH为7.5，UDPG与原人参二醇之比为1:1(w/w)。 按70％(v/v)比例添加UGT51糖基转移酶粗酶液于反应液中，30℃，180rpm，反应48 小时。

添加同体积正丁醇终止反应，萃取的有机相真空干燥后加甲醇溶解，进行HPLC 检测分析与定量。检测方法同方案一，HPLC鉴定获知原人参二醇糖基化反应的转化 率为36％。

方案四

按照实施例1得到UGT51糖基转移酶粗酶液。

以二甲基甲酰胺(DMF)、原人参二醇、尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)、Tris-HCl 缓冲配制反应溶液，反应溶液中有机溶剂DMF的比例为5％(v/v)，原人参二醇0.5g/L， Tris-HCl缓冲的摩尔浓度为50mmol/L，pH为7.5，UDPG与原人参二醇之比为 10:1(w/w)。按70％(v/v)比例添加UGT51糖基转移酶粗酶液于反应液中，30℃，180rpm， 反应48小时。

添加同体积正丁醇终止反应，萃取的有机相真空干燥后加甲醇溶解，进行HPLC 检测分析与定量。检测方法同方案一，HPLC鉴定获知原人参二醇糖基化反应的转化 率为32％。

方案五

按照实施例1得到UGT51糖基转移酶粗酶液。

以甲醇、原人参二醇、尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)、Tris-HCl缓冲配制反应溶液， 反应溶液中有机溶剂甲醇的比例为5％(v/v)，原人参二醇0.5g/L，Tris-HCl缓冲的摩尔 浓度为50mmol/L，pH为7.5，UDPG与原人参二醇之比为10:1(w/w)。按70％(v/v)比 例添加UGT51糖基转移酶粗酶液于反应液中，30℃，180rpm，反应48小时。

添加同体积正丁醇终止反应，萃取的有机相真空干燥后加甲醇溶解，进行HPLC 检测分析与定量。检测方法同方案一，HPLC鉴定获知原人参二醇糖基化反应的转化 率为45％。

方案六

按照实施例1得到UGT51糖基转移酶粗酶液。

以乙二醇二甲醚(DME)、原人参二醇、尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)、Tris-HCl 缓冲配制反应溶液，反应溶液中有机溶剂DME的比例为5％(v/v)，原人参二醇0.5g/L， Tris-HCl缓冲的摩尔浓度为50mmol/L，pH为7.5，UDPG与原人参二醇之比为 10:1(w/w)。按70％(v/v)比例添加UGT51糖基转移酶粗酶液于反应液中，30℃，180rpm， 反应48小时。

添加同体积正丁醇终止反应，萃取的有机相真空干燥后加甲醇溶解，进行HPLC 检测分析与定量。检测方法同方案一，HPLC鉴定获知原人参二醇糖基化反应的转化 率为48％。

实施例4 UGT糖基转移酶突变体的构建及其体外酶法合成稀有人参皂苷Rh2

以重组质粒pET28-UGT51为模板，以带有突变位点的一对互补的寡核苷酸为引 物，用PrimeSTAR HS高保真酶(TakaRa公司)进行全质粒PCR扩增，获得具有特 定突变位点的重组质粒。引物序列如下：

对应于SEQ NO:2中第801位丝氨酸被丙氨酸取代的突变体：

S801A_F:CCAGTGGAGTTGATGGCGTTGATGGTGGAAAATG

S801A_R:CATTTTCCACCATCAACGCCATCAACTCCACTGG；

对应于SEQ NO:2中第802位亮氨酸被丙氨酸取代的突变体：

L802A_F:GTGGAGTTGATGTCCGCGATGGTGGAAAATGAAT

L802A_R:ATTCATTTTCCACCATCGCGGACATCAACTCCAC；

对应于SEQ NO:2中第804位缬氨酸被丙氨酸取代的突变体：

V804A_F:TTGATGTCCTTGATGGCGGAAAATGAATCAATGA

V804A_R:TCATTGATTCATTTTCCGCCATCAAGGACATCAA；

对应于SEQ NO:2中第812位赖氨酸被丙氨酸取代的突变体：

K812A_F:ATGAATCAATGAATGTTGCGATGCTGAGAGAAGCT

K812A_R:GCTTCTCTCAGCATCGCAACATTCATTGATTCATT；

对应于SEQ NO:2中第815位精氨酸被丙氨酸取代的突变体：

R815A_F:GAATGTTAAAATGCTGGCGGAAGCTTCGAGCAAA

R815A_R:TTTGCTCGAAGCTTCCGCCAGCATTTTAACATTC；

对应于SEQ NO:2中第816位谷氨酸被丙氨酸取代的突变体：

E816A_F:GTTAAAATGCTGAGAGCGGCTTCGAGCAAATTT

E816A_R:AAATTTGCTCGAAGCCGCTCTCAGCATTTTAAC；

对应于SEQ NO:2中第849位丝氨酸被丙氨酸取代的突变体：

S849A_F：CTGATTGAATCACCCGCGGCTATGGTTGGTATTC

S849A_R：AATACCAACCATAGCCGCGGGTGATTCAATCAGA

对应于SEQ NO:2中第849位丝氨酸被缬氨酸取代的突变体：

S849V_F：CTGATTGAATCACCCGTTGCTATGGTTGGTATTC

S849V_R：AATACCAACCATAGCAACGGGTGATTCAATCAGA

对应于SEQ NO:2中第888位赖氨酸被丙氨酸取代的突变体；

K888A_F:ATTGTACCAGATCAAGCGAGGGGCGGTAACTA

K888A_R:TAGTTACCGCCCCTCGCTTGATCTGGTACAAT

对应于SEQ NO:2中第892位天冬酰胺被丙氨酸取代的突变体：

N892A_F:AAAAAAGGGGCGGTGCGTATAACTACCTGACA

N892A_R:TGTCAGGTAGTTATACGCACCGCCCCTTTTTT

扩增体系为：PrimeSTAR Buffer(5×)10μL、dNTP(2.5mM)4μL、重组质粒模板 20ng、引物(10μM)各2μL、PrimeSTAR HS高保真酶0.5μL、补充双蒸水至50μL。扩 增条件为98℃预变性1分钟；98℃变性10秒、68℃退火及延伸7分钟(30个循环)。 胶回收PCR产物，用DpnI酶(Fermentas公司)在37℃条件下消化胶回收产物2h，降解 初始模板。消化产物转化至E.coli BL21，涂布到含有50μg/mL卡那霉素LB琼脂平板 上，37℃过夜培养，筛选阳性克隆，测序验证。得到UGT糖基转移酶突变体的重组菌。

按照实施例1的方法得到UGT51糖基转移酶突变体的粗酶液。

以二甲基亚砜(DMSO)、原人参二醇、尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)、Tris-HCl 缓冲配制反应溶液，反应溶液中有机溶剂DMSO的比例为10％(v/v)，原人参二醇 0.5g/L，Tris-HCl缓冲的摩尔浓度为50mmol/L，pH为7.5，UDPG与原人参二醇之比 为10:1(w/w)。按70％(v/v)比例添加UGT51糖基转移酶突变体粗酶液于反应液中，30 ℃，180rpm，反应48小时。

添加同体积正丁醇终止反应，萃取的有机相真空干燥后加甲醇溶解，进行HPLC 检测分析与定量。检测方法同实施例3，HPLC鉴定获知原人参二醇糖基化反应的转化 率分别为S801A：86％，L802A：92％，V804A：88％，K812A：90％，R815A：88％， E816A：88％，S849A：83％，S849V：85％，K888A：86％，N892A：84％。

重组蛋白在N末端携带有6-His标签，诱导表达获得的粗酶液用镍柱一步纯化， 使用200mM咪唑溶液洗脱，过夜透析去除咪唑，即获得纯酶。以Tween80、原人参二 醇、尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)、Tris-HCl缓冲配制反应溶液，反应溶液中Tween80 的比例为1％(v/v)，原人参二醇0.5mM，Tris-HCl缓冲的摩尔浓度为50mmol/L，pH为 7.5，UDPG 5mM。按终浓度为0.3mg/mL添加UGT51糖基转移酶及其突变体的纯酶 于反应液中，30℃，反应15min。添加同体积正丁醇终止反应，萃取的有机相真空干 燥后加甲醇溶解，HPLC分析与定量测定酶活力。UGT51糖基转移酶及其突变体的相 对酶活力如表1所示。

酶 相对活力 Wild-type 1 S801A 4.1 L802A 12.3 V804A 6.9 K812A 8.4

R815A 6.1 E816A 6.5 S849A 2.9 S849V 4.3 K888A 5.8 N892A 3.9

实施例5 利用UGT51基因或其突变基因在微生物体内合成稀有人参皂苷Rh2

以公开专利(公开号：CN102925376A)为例，参照专利获得工程菌ZD-PPD-010。 ZD-PPD-010工程菌于YPD培养基(培养基组成：1％(w/v)酵母膏、2％(w/v)蛋白胨、 2％(w/v)葡萄糖)中过夜培养，OD约0.6-0.8，取1mL分装于1.5mL离心管中，4℃、 8000g离心1分钟，弃上清，细胞用无菌水洗涤1次，加入1mL处理液(10mM LiAc、 10mM DTT、0.6M山梨醇、10mM Tris-HCl pH7.5)重悬细胞，25℃放置20分钟，离 心收集细胞，加入1mL 1M山梨醇(无菌)重悬，离心，弃上清，加入80μL 1M山梨 醇(无菌)重悬，即得ZD-PPD-010感受态细胞。

以酿酒酵母基因组DNA为模板，用表1中引物，扩增启动子PGK1(753bp)及 UGT51全长ORF基因(3597bp)。扩增体系为：Q5 Reaction Buffer(5×)10μL、 dNTP(2.5mM)4μL、DNA模板20ng、引物(10μM)各2.5μL、Q5 High-Fidelity DNA聚 合酶0.5μL、补充双蒸水至50μL。扩增条件为98℃预变性30秒；98℃变性10秒、52 ℃退火10秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸2分钟。

表1 引物序列

PmeI酶切PGK1扩增产物及UGT51扩增产物，切胶回收两个目的片段，各取50ng 加入连接体系：T4 Ligation Buffer(10×)2μL、T4 DNA Ligase 1μL、补充双蒸水至20μL， 16℃过夜反应得到连接产物。取1μL连接产物作为模板加入PCR反应体系：Q5 Reaction Buffer(5×)10μL、dNTP(2.5mM)4μL、连接产物模板1μL、引物BamHI-PGK1-F和 NotI-UGT51-R(10μM)各2.5μL、Q5 High-Fidelity DNA聚合酶0.5μL、补充双蒸水至 50μL。扩增条件为98℃预变性30秒；98℃变性10秒、52℃退火10秒、72℃延伸2.5 分钟(30个循环)；72℃延伸2分钟。得到目的片段P_PGK1-UGT51，其中P_PGK1的核苷 酸序列为序列表中的SEQ ID NO:5，UGT51基因的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID  NO:1。

BamHI、NotI酶切目的片段P_PGK1-UGT51与pESC-HIS载体(Invitrogen公司)。 切胶回收两个片段，取P_PGK1-UGT51酶切产物(200ng)、pESC-HIS载体酶切产物 (100ng)加入连接体系：T4 Ligation Buffer(10×)2μL、T4 DNA Ligase 1μL、补充双蒸 水至20μL，16℃过夜反应得到连接产物。连接产物转化ZD-PPD-010感受态细胞，在 筛选培养基中培养，得到转化子。筛选培养基为：0.8％酵母选择培养基SD-Leu-Ura-His， 2％葡萄糖；筛选培养的条件为：30℃，培养36小时。用引物BamHI-PGK1-F(引物 表1)、NotI-UGT51-R(引物表1)进行PCR鉴定，得到正确的阳性克隆，命名为重 组菌1。

以重组质粒pESC-P_PGK1-UGT51为模板，以带有突变位点的一对互补的寡核苷酸 为引物(参见实施例4)，用PrimeSTAR HS高保真酶(TakaRa公司)进行全质粒PCR 扩增，获得具有特定突变位点的重组质粒。

扩增体系为：PrimeSTAR Buffer(5×)10μL、dNTP(2.5mM)4μL、重组质粒模板 20ng、引物(10μM)各2μL、PrimeSTAR HS高保真酶0.5μL、补充双蒸水至50μL。扩 增条件为98℃预变性1分钟；98℃变性10秒、68℃退火及延伸8分钟(30个循环)。 胶回收PCR产物，用DpnI酶(Fermentas公司)在37℃条件下消化胶回收产物2h，降解 初始模板。消化产物转化至E.coli DH5α，涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素LB琼脂 平板上，37℃过夜培养，筛选阳性克隆，测序验证。提取重组质粒，转化ZD-PPD-010 感受态细胞，在筛选培养基中培养，得到转化子。筛选培养基为：0.8％酵母选择培养 基SD-Leu-Ura-His，2％葡萄糖；筛选培养的条件为：30℃，培养36小时。用引物 BamHI-PGK1-F(引物表1)、NotI-UGT51-R(引物表1)进行PCR鉴定，得到正确的 阳性克隆，分别命名为重组菌2-11。

重组菌1-11于YPD液体培养基中制备发酵种子液。30℃，220rpm条件下培养16 小时。离心收集菌体，转移至含有100mLYPD液体培养基的500mL三角瓶中，调OD 至0.5，30℃，220rpm条件下振荡培养6天。

发酵液8000g离心收集菌体，超声破碎，10000g离心收集上清液，用正丁醇萃取， 取有机相，真空干燥后用甲醇溶解，进行LC-MS分析，方法同实施例1。结果显示重 组菌1-11发酵液提取物中均含有目标产物人参皂苷Rh2。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无 需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中 技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可 以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。