一种无抗生素标记的裂殖壶菌及其遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种无抗生素标记的转基因裂殖壶菌，是利用Cre/ loxP 位点特异性重组系统，第一步将载体p18SCPGC质粒转入到宿主菌裂殖壶菌中，第二步将pSH65质粒转入到第一步的阳性克隆中，pSH65质粒在裂殖壶菌细胞内表达Cre重组酶，将 loxP 序列中间的抗性基因剔除而得到的。本发明解决了转基因裂殖壶菌中含有抗生素基因的问题，为采用基因工程方法改造裂殖壶菌，在工业生产中应用奠定基础。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术和生物工程技术领域，具体地说，是一种无抗生素标记的转基因裂殖壶菌及其制备方法。 

背景技术

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid，DHA)是一种n-3多不饱和脂肪酸，在婴幼儿神经系统的发育、保护视力、抗癌、抗炎及心血管病等方面有重要作用。裂殖壶菌(Aurantiochytrium，又称裂殖壶藻或裂壶藻)中DHA含量可达细胞干重的40％左右，而且其生长快速、易于培养，是一种理想的工业化DHA生产菌。进一步提高裂殖壶菌的DHA含量一直是人们追求的目标，培养条件和发酵条件的优化可以在一定程度上提高DHA产量，但是效果并不明显；而随着现代生物技术的迅速发展，基因工程方法为从根本上提高裂殖壶菌的DHA合成能力提供了可能。 

目前裂殖壶菌已成功实现了遗传转化，Lippmeier等(2009)利用基因枪法成功的将Zeocin抗性基因导入裂殖壶菌内。2011年YangaS等通过农杆菌介导转化实现了裂殖壶菌的转化。Cheng等(2011)通过电转化，以18srDNA为靶位点，将Zeocin抗性基因成功转入到裂殖壶菌的基因组中。李清(2013)等用电转化方法成功敲除了裂殖壶菌pks基因的部分序列。但是转化后的裂殖壶菌都带有抗生素标记基因，不利于裂殖壶菌的应用，为此发明一种剔除裂殖壶菌遗传转化中抗生素标记的方法具有重要意义。 

Cre/loxP位点特异性重组系统是Steinberg等首先在大肠杆菌噬菌体p1中发现的,由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre/loxP系统中，含有loxP位点的质粒首先被转入到宿主菌中，然后可以表达Cre重组酶的pSH65质粒被转入到宿主菌中，并特异性的识别loxP位点，根据loxP位点的方向对目的片段进行特异性的倒位、剔除或易位。Cre/loxP系统的优点在于可以将第一步转入宿主菌中的抗性标记特异性剔除，而第二步中的pSH65质粒会随着宿主菌的传代培养而丢失。本发明将Cre/loxP系统应用到裂殖壶菌遗传转化中，发明一种无抗生素标记的裂殖壶菌遗传转化方法。 

发明内容

本发明的目的是发明一种无抗生素标记的裂殖壶菌及其遗传转化方法，解决转基因裂 殖壶菌中含有抗生素基因的问题，为采用基因工程方法改造裂殖壶菌，在工业生产中应用奠定基础。 

本发明的一种无抗生素标记的转基因裂殖壶菌，其分类命名为Aurantiochytrium limacinumOUC_EG，保藏编号为CGMCCNo.9631，保藏单位名称是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2014年9月2日。 

本发明的无抗生素标记的转基因裂殖壶菌，是利用Cre/loxP位点特异性重组系统，第一步将载体p18SCPGC质粒转入到宿主菌裂殖壶菌中，第二步将pSH65质粒转入到第一步的阳性克隆中，pSH65质粒在裂殖壶菌细胞内表达Cre重组酶，将loxP序列中间的抗性基因剔除而得到的。 

其中所述载体p18SCPGC中含有18srDNA序列、氯霉素抗性基因Cm^r、绿色荧光蛋白报告基因EGFP以及loxP序列。其中所述载体pSH65质粒含有Cre重组酶，氨苄青霉素抗性基因Ampr和博莱霉素抗性基因Ble^r。。 

本发明的无抗生素标记的转基因裂殖壶菌的遗传转化方法，具体步骤包括： 

[1]裂殖壶菌感受态细胞的制备：将裂殖壶菌单菌落接种入裂殖壶菌液体培养基中，得到培养液1；按照1:5的体积比将培养液1转接于裂殖壶菌液体培养基中，得到培养液2；按照1:200的体积比将培养液2转接于裂殖壶菌液体培养基中，得到培养液3；将培养液3离心后，弃上清液，得到沉淀1；在沉淀1中加入1倍于培养液3体积预冷的无菌水重悬，离心，去上清，得到沉淀2；在沉淀2中加入1倍于培养液3体积预冷的山梨醇溶液重悬，离心，去上清，得到沉淀3；在沉淀3中加入1/10于培养液3体积预冷的山梨醇溶液重悬，置于冰上备用； 

[2]两步电转化：将体积比为1:4的载体DNA和预冷裂殖壶菌感受态细胞混合液转移至预冷的电击杯中，确保混合液位于电击杯底，置于冰上备用，所述第一步中的载体为p18SCPGC质粒，第二步中的载体为pSH65质粒；将已加入混合液的电击杯外壁擦干，置于电转化仪中，进行电击；电击结束后，在电击杯中加入10倍体积含山梨醇的裂殖壶菌液体培养基，混匀；吸取电击杯中的混合液，并转移到1.5ml的离心管中，在23℃的条件下，200rpm恢复培养1h；将菌液涂在含有抗生素的固体培养基上避光培养，所述第一步转化的抗生素为氯霉素Cm，第二步转化的抗生素为博莱霉素Zeocin； 

[3]第一步转化阳性克隆的筛选：将经过第一步转化的裂殖壶菌涂布在含Cm的固体培养基上避光培养，以氯霉素抗性基因Cm^r两侧序列为引物，对重组子进行PCR筛选，扩增得到的DNA片段经测序比对，与p18SCPGC载体的Cm^r片段一致的重组子为阳性克隆； 

[4]第二步转化阳性克隆的筛选：将经过第二步转化的裂殖壶菌涂布在含有Cm和Zeocin的固体培养基上避光培养，筛选候选菌株；将候选菌株在半乳糖诱导培养基中200rpm避光培养；培养液分别涂布在含有Cm和Zeocin抗性的固体培养基上，选取可以在Zeocin固体培养基上生长，但不能在Cm固体培养基上生长的菌株，将其在不含Zeocin的固体培养基上进行传代培养，直至Zeocin抗性消失，得到无抗生素标记的转基因裂殖壶菌。 

进一步的，所述步骤[1]中离心的温度为4℃，转速为8000g，离心时间为5min。 

进一步的，所述步骤[1]中得到所述培养液1的培养温度为23℃，转速为200rpm培养时间为12-16h；得到所述培养液2的培养温度为23℃，转速为200rpm培养时间为12-16h；得到所述培养液3的培养温度为23℃，转速为200rpm培养时间为5-6h。 

进一步的，所述山梨醇溶液的浓度为1mol/L。 

进一步的，所述步骤[2]中电转化仪的电脉冲设置为50μF，电压设置为1.8KV，电阻设置为200Ω。 

进一步的，所述步骤[2]-[4]中避光培养为在温度为23℃的培养箱中培养48h。 

与现有技术相比，本发明的优点在于：发明了一种无抗生素标记的裂殖壶菌，解决转基因裂殖壶菌中含有抗生素基因的问题，为采用基因工程方法改造裂殖壶菌，在工业生产中应用奠定基础。 

附图说明

图1为载体p18SCPGC的质粒图谱； 

图2为载体pSH65的质粒图谱； 

图3为转基因裂殖壶菌在抗生素培养基上的生长情况； 

图4为转基因裂殖壶菌的PCR检测结果； 

图5转基因裂殖壶菌的抗性检测结果； 

图6为转基因裂殖壶菌经酶切电泳图； 

图7为转基因裂殖壶菌的Southern杂交检测结果； 

图8为转基因裂殖壶菌的荧光光谱分析。 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。 

一种无抗生素标记的转基因裂殖壶菌，其分类命名为Aurantiochytriumlimacinum OUC_EG，保藏编号为CGMCCNo.9631，保藏单位名称是中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2014年9月2日。 

一种无抗生素标记的转基因裂殖壶菌的遗传转化方法，第一步将载体p18SCPGC质粒转入到宿主菌裂殖壶菌中，载体p18SCPGC质粒中的18SrDNA基因序列与裂殖壶菌基因组中18SrDNA序列发生同源重组，使含有loxP位点、氯霉素抗性基因及绿色荧光蛋白的片段整合到裂殖壶菌基因组中；第二步将pSH65质粒转入到上述阳性克隆中，pSH65质粒在裂殖壶菌细胞内表达Cre重组酶，将loxP序列中间的氯霉素抗性基因剔除。 

其中，第一步的载体p18SCPGC中含有18srDNA序列、氯霉素抗性基因Cm^r、EGFP报告基因以及loxP位点，其中18srDNA序列作为同源重组位点；氯霉素抗性基因用于筛选转基因菌株，它位于loxP序列中间，在转基因成功后将被切除；EGFP报告基因为增强绿色荧光蛋白基因，用于检测外源基因在裂殖壶菌中的表达情况，质粒图谱如图1。 

其中，第二步的载体pSH65质粒含有Cre重组酶，含有的抗性基因为Amp^r、Ble^r，质粒图谱见图2。 

具体步骤如下： 

[1]裂殖壶菌感受态细胞的制备： 

(1)将大小适中、状态良好的裂殖壶菌单菌落接种入100ml裂殖壶菌液体培养基，23℃，200rpm培养12-16h，得到培养液1。 

(2)按照1:5的体积比将培养液1转接于5ml裂殖壶菌液体培养基，23℃，200rpm培养12-16h，得到培养液2。 

(3)按照1:200的体积比将培养液2转接于100ml裂殖壶菌液体培养基中，23℃，200rpm培养5-6h，得到培养液3。 

(4)4℃条件下，将10ml培养液3离心5min，转速为8000g，弃上清，得到沉淀1。 

(5)将沉淀1用10ml预冷的无菌水(即1倍于培养液3的体积)重悬，在4℃，8000g条件下离心5min，去上清，得到沉淀2。 

(6)将沉淀2用10ml预冷的浓度为1mol/L的山梨醇溶液(即1倍于培养液3的体积)重悬，在4℃，8000g条件下离心5min，去上清，得到沉淀3。 

(8)将沉淀3用1ml预冷的浓度为1mol/L的山梨醇溶液(即1/10于培养液3的体积)重悬，置于冰上备用，其中所述预冷的无菌水及预冷的山梨醇溶液是指放入冰水混合物中预冷至大约零度左右。 

[2]两步电转化 

(1)将20μl载体DNA和80μl预冷裂殖壶菌感受态细胞混合液转移至预冷的电击杯中， 轻敲杯壁确保混合液位于电击杯底，置于冰上备用，所述第一步中的载体为p18SCPGC质粒，第二步中的载体为pSH65质粒。 

(2)将已加入混合液的电击杯外壁擦干，置于电转化仪中，进行电击，所述电转化仪的电脉冲设置为50μF，电压设置为1.8KV，电阻设置为200Ω。 

(3)电击结束后，在电击杯中加入1ml含1mol/L山梨醇的裂殖壶菌液体培养基，所述山梨醇溶液与裂殖壶菌液体培养基的体积比为1:10，轻轻混匀。 

(4)尽量吸取电击杯中的混合液，并转移到1.5ml的离心管中，在23℃的条件下，200rpm恢复培养1h。 

(5)取200μl菌液涂在含有抗生素的固体培养基上，23℃培养箱中避光培养48h，所述第一步转化的抗生素为氯霉素Cm；第二步转化的抗生素为博莱霉素Zeocin。 

[3]第一步转化阳性克隆的筛选 

将经过第一步转化的裂殖壶菌涂布在含Cm的固体培养基上，23℃培养箱中避光培养48h，以Cm^r两侧序列为引物，对重组子进行PCR筛选，扩增得到的DNA片段经测序比对，与p18SCPGC载体的Cm^r片段一致的重组子为阳性克隆，命名为OUC_CG。 

[4]第二步转化阳性克隆的筛选 

将经过第二步转化的裂殖壶菌涂布在含有Cm和Zeocin的固体培养基上，23℃培养箱中避光培养48h，筛选候选菌株。将候选菌株在半乳糖诱导培养基中23℃，200rpm避光培养48h。培养液分别涂布在含有Cm和Zeocin抗性的固体培养基上，依次编号，其中6号和21号菌落在Zeocin固体培养基上可以正常生长，但不能在Cm固体培养基上生长，初步表明6号和21号菌落中第一步转化进裂殖壶菌的氯霉素抗性基因Cm^r被成功剔除，命名为OUC_EG。转基因裂殖壶菌在抗生素培养基上的生长情况如图3所示，其中A为含有博莱霉素Zeocin的固体培养基，B为含有氯霉素Cm固体培养基。 

[5]转基因裂殖壶菌的聚合酶链式反应PCR检测 

以质粒p18SCPGC为阳性对照，以氯霉素抗性基因两侧序列为引物对候选菌落OUC_EG进行PCR鉴定。由图4可知，阳性对照扩增出氯霉素抗性基因Cm^r，条带大小介于500bp和750bp之间，OUC_EG没有扩增出片段。可以确定在Cre重组酶的诱导下，loxP位点中间的氯霉素抗性基因Cm^r已经成功切除。PCR结果见图4，图中1为阳性对照；2为OUC_EG。 

[6]转基因裂殖壶菌的抗性检测 

将OUC_EG在不含Zeocin的固体培养基上进行传代培养，直至Zeocin抗性消失。将OUC_EG分别在不含抗生素、含Zeocin和含Cm的培养基上培养，由图5可知，OUC_EG只能在不含抗生素的培养基上生长，不能在含Zeocin和含Cm的培养基上生长，表明转基 因裂殖壶菌的抗生素标记消失。 

[7]重组菌的Southern杂交检测 

分别提取裂殖壶菌、第一步转化阳性克隆OUC_CG及第二步转化阳性克隆OUC_EG的基因组DNA，经BamHI/EcoRI，XbaI/HindIII双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，再用虹吸的方式将琼脂糖凝胶中的DNA分子转移到硝酸纤维素膜上。以EGFP绿色荧光蛋白基因为探针进行SouthernBlotting，最后将新配制的显色溶液与硝酸纤维素膜在黑暗中温育2-18h。显色完成后，用蒸馏水清洗杂交膜，室温晾干。 

经BamHI/EcoRI，XbaI/HindIII酶切后呈弥散状，如图6，其中M：λ-14digestDNAMarker由上到下依次为19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925、421、74bp。图中1为裂殖壶菌；2为OUC_CG；3为OUC_EG。 

Southernblotting检测，结果经BamHI/EcoRI酶切后裂殖壶菌没有出现条带，裂殖壶菌OUC_CG和裂殖壶菌OUC_EG均出现一条条带；经XbaI/HindIII酶切后裂殖壶菌没有出现条带，裂殖壶菌OUC_CG和裂殖壶菌OUC_EG均出现两条条带，如图7，图中1为裂殖壶菌；2为OUC_CG；3为OUC_EG。Southernblotting结果表明，在转化过程中EGFP基因经18SrDNA同源重组位点已经整合到裂殖壶菌基因组中，而且氯霉素抗性标记的切除并未影响绿色荧光蛋白基因在裂殖壶菌基因组中的整合情况。 

[8]重组菌的荧光检测 

以PBS缓冲液和裂殖壶菌为对照，对用0.01mol/L的PBS溶液处理的第一次转化和第二次转化后的裂殖壶菌重组子(分别为OUC_CG和OUC_EG)进行荧光检测，扫描速度1200nm/min，狭缝宽度5.0nm，电压为950V，用488nm激发波长对处理样品进行荧光激发。 

裂殖壶菌重组子的绿色荧光蛋白激发峰为488nm，发射峰位于516nm处。第一次转化后的阳性菌株可以正常表达绿色荧光蛋白EGFP，说明第一次转化后绿色荧光蛋白基因成功整合到裂殖壶菌基因组中；第二次转化后在Cre重组酶的作用下，氯霉素抗性标记被切除后，仍能检测到绿色荧光蛋白的发射峰，表明氯霉素抗性标记的切除并未对绿色荧光蛋白的表达产生影响。荧光光谱分析如图8，图中PBS为PBS缓冲液对照、CK为未转基因裂殖壶菌对照、OUC_CG为一步转化的裂殖壶菌、OUC_EG为两次转化后的裂殖壶菌。 

因此，本发明利用基因工程方法改造裂殖壶菌，成功制备了一种无抗生素标记的转基因裂殖壶菌。 

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载 的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。