一种茶藨子木层孔菌多糖及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种茶藨子木层孔菌多糖及其制备方法和应用，属于多糖领域。本发明制备的茶藨子木层孔菌多糖，结构新颖，是首次分离得到；其结构含有可重复的单元结构，该可重复单元结构由3个(1→3)-β-D-葡萄糖构成主链，在主链的其中一个(1→3)-β-D-葡萄糖的C6位有一个分枝，分枝由3个(1→6)-β-D-葡萄糖串联而成。本发明还公开了一种茶藨子木层孔菌多糖的制备方法，该方法简单、适用，提取的多糖纯度高达93%以上，制备的多糖可用于制备治疗阿尔茨海默病等神经退行性疾病的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及多糖领域，具体涉及一种茶藨子木层孔菌多糖及其制备方法和应用。

背景技术

阿尔茨海默病，是一种在老年期发生的以进行性痴呆为主要特征的神经元退行性疾病。随着世界人口日趋老龄化，阿尔茨海默病发病率越来越高，已成为继心血管疾病、癌症和中风之后的第四大杀手，严重危害着老年人的身体健康和生活质量。目前用于治疗阿尔茨海默病的药物大概有10余种，主要是拟胆碱药物和改善脑代谢的益智药，其中乙酰胆碱酶抑制剂（拟胆碱药）是目前治疗阿尔茨海默病的一线药物，如他克林（Tacrine）、多奈派齐（Donepezil）、利斯的明（Rivastigmine）、加兰他敏（Galanthamine）和石杉碱甲等。临床上应用的这些药物只能缓解早期病人的认知障碍，提供适度的症状改善作用，无法阻止病情的进展。到目前为止，仍缺乏对因治疗和控制疾病进程的有效药物。

神经生长因子(nerve growth factor, NGF), 作为神经营养因子家族中最重要的成员，对退化的多巴胺能神经元细胞及促进纹状体多巴胺系统神经元细胞的再生有潜在的保护作用，有望治愈阿尔茨海默病。然而，NGF作为蛋白类物质，存在化学性质不稳定、体内半衰期短、药代动力学特性欠佳等缺点，且不易通过血脑屏障，并且价格昂贵，限制了其临床的应用。因此，积极寻找具有神经营养的“NGF”样的其他化合物用于阿尔茨海默病的治疗具有重要的意义。

茶藨子木层孔菌多糖是从药用真菌茶藨子木层孔菌(Phellinus ribis)中分离获得的具有神经营养活性的均一多糖组分，研究表明其在10 μg/ml-150μg/ml范围内能够显著促进NGF介导的PC12神经突的生长，可望开发成阿尔茨海默病等神经退行性疾病治疗的候选药物。关于茶藨子木层孔菌多糖神经营养作用的研究在本发明完成之前没有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有药用价值的茶藨子木层孔菌多糖及其制备方法和应用。本发明的茶藨子木层孔菌多糖，结构新颖，是首次分离得到，命名为PRG；其制备方法简单、适用，提取的多糖纯度高达93%以上。该产品可用于制备治疗阿尔茨海默病等神经退行性疾病的药物。

本发明采用以下技术方案：

一种茶藨子木层孔菌多糖，其特征在于，其单糖组成为β-D-葡萄糖，其结构中有可重复单元结构；所述可重复单元结构由3个(1→3)-β-D-葡萄糖构成主链，在主链的其中一个(1→3)-β-D-葡萄糖的C6位有一个分枝，分枝由3个(1→6)-β-D-葡萄糖串联而成，其重复单元结构式如下：

                                                 。

所述的茶藨子木层孔菌多糖中末端葡萄糖、(1→3)-β-D-葡萄糖、(1→6)-β-D-葡萄糖和(1→3，6)-β-D-葡萄糖的组分摩尔比约为1:2:2:1；

所述的茶藨子木层孔菌多糖，重均分子量为5.16×10³Da，比旋光度+32.1° (c 0.1, H₂O)。

一种茶藨子木层孔菌多糖的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

（1）水提：取茶藨子木层孔菌子实体粗粉，加20倍-40倍重量的蒸馏水，90℃-100℃提取4次，每次4h-6h，滤过，合并滤液，浓缩，加乙醇至含醇量80%，静置24h，离心，得茶藨子木层孔菌总多糖粗品；

（2）去蛋白：将步骤（1）所得的总多糖粗品溶于蒸馏水中，用蛋白酶酶解，灭活并离心除去变性蛋白酶，离心所得上清液加入有机溶剂，振荡，离心，除去下层有机相和中间蛋白层，重复有机溶剂处理的步骤直至无白色沉淀产生，得到去蛋白后的多糖水提液；

（3）分级醇沉：将步骤（2）中的水提液浓缩，加乙醇至含醇量50%，离心，弃去沉淀物，上清液继续加乙醇至含醇量80%，静置，离心，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥，得茶藨子木层孔菌分级多糖粗品；

（4）柱层析：将步骤（3）得到的茶藨子木层孔菌分级多糖粗品溶解后经DEAE-纤维素柱层析，苯酚-硫酸法检测多糖，收集第二洗脱峰的洗脱液后将其再经凝胶柱层析，苯酚-硫酸法检测多糖，收集主峰的洗脱液，洗脱液经浓缩、透析和冻干后得到本发明的茶藨子木层孔菌多糖。

上述步骤（1）中，所述离心速度为3000rpm-4000rpm，时间为15min-30min；

上述步骤（1）中，加入茶藨子木层孔菌30倍重量的蒸馏水，提取温度为95℃，提取时间为每次6h，离心速度为3000rpm，离心时间为20min。

上述步骤（2）中，所述蛋白酶为胰蛋白酶；所述有机溶剂为氯仿和正丁醇，所述氯仿和正丁醇的体积比为5：1。

上述步骤（3）中，所述乙醇为无水乙醇；离心速度为3000rpm，离心时间为20min。

上述步骤（4）中，所述DEAE-纤维素柱层析的条件为：分步洗脱，洗脱液依次为蒸馏水、0.05mol/L NaCl溶液、0.1mol/L NaCl溶液和0.2mol/L NaCl溶液，流速为2ml/min。

上述步骤（4）中，所述的凝胶为Superdex 30，凝胶过滤层析条件为：洗脱液为0.05mol/L NaCl溶液，流速为0.5ml/min。

所述的茶藨子木层孔菌多糖可以应用于治疗神经退行性疾病的药物中。

本发明具有如下优点：

本发明茶藨子木层孔菌多糖（PRG），是首次从茶藨子木层孔菌中分离获得，为一新的结构新颖的葡聚糖。PRG由末端葡萄糖、1→3连接的葡萄糖、1→6连接的葡萄糖和1→3，6连接的葡萄糖组成，组分摩尔比为1:2:2:1。IR证明PRG是糖类，为β-构型。该多糖重均分子量5.16×10³Da，比旋光度+32.1° (c 0.1, H₂O)。    

PRG能够促进NGF介导的PC12神经突的生长，具有较强的神经营养活性，为首次研究发现，可用于制备神经退行性疾病治疗的药物。此活性多糖在本发明之前未见报道。

附图说明

图1为PRG的HPSEC-MALLS色谱图。

图2为PRG在200nm-400nm紫外扫描图谱。

图3为标准单糖糖腈乙酸酯衍生后后的气相色谱图。

图4为PRG水解产物糖腈乙酸酯衍生后的气相色谱图。

图5为PRG的红外光谱。

图6为PRG的核磁共振谱图 (a) ¹H NMR, (b) ¹C NMR, (c) DEPT。

图7为PC12细胞形态学观察。

图8为PRG促进PC12细胞神经突生长的定量分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。

实施例1

茶藨子木层孔菌多糖的制备，它包括以下步骤：

（1）水提取：将茶藨子木层孔菌子实体粉碎成粗粉，加入30倍量蒸馏水（g/ml），混合均匀后于恒温水浴锅中95℃提取4次，每次6h，纱布滤过，合并水提液，浓缩，加入4倍水提液体积的无水乙醇，静置24h，3000rpm离心20min，得茶藨子木层孔菌总多糖粗品。

（2）去蛋白：将步骤（1）所得的茶藨子木层孔菌总多糖粗品溶于蒸馏水中，得到茶藨子木层孔菌粗多糖水溶液， 加入粗多糖重量1%的蛋白酶，45 °C水浴8 h，然后升温至90°C维持10 min灭活酶，冷却至室温，5000rpm离心30min除去变性蛋白和酶，在离心所得上清液加入四分之一上清液体积的Sevag试剂（氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为5:1），剧烈振荡15min，离心除去下层有机相和中间蛋白层，重复用Sevag试剂处理步骤直至无白色沉淀产生，得到去蛋白后的多糖水提液。

（3）分级醇沉：将步骤（2）得到的水提液浓缩，加入1倍体积的无水乙醇至含醇量50%，搅拌混匀，静止24h，3000rpm离心20min，弃去沉淀物，上清液继续加无水乙醇至含醇量80%，静置24h，3000rpm离心20min，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥，得茶藨子木层孔菌分级多糖粗品。

（4）柱层析：将步骤（3）得到的茶藨子木层孔菌分级多糖粗品用蒸馏水溶解得到20mg/ml的水溶液；首先用蒸馏水平衡DEAE-纤维素离子交换层析柱（4.5cm×30cm），将茶藨子木层孔菌分级多糖粗品水溶液经DEAE-纤维素离子交换柱层析，上样量5ml，流速2ml/min，洗脱液依次为蒸馏水、0.05mol/L NaCl溶液、 0.1mol/L NaCl溶液 和0.2mol/L NaCl溶液，分步洗脱，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集第二洗脱峰的洗脱液；

将收集到的第二洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析（Superdex 30）进一步纯化，层析柱的规格是1.8cm×80cm，上样量2ml，洗脱液为0.05mol/L NaCl溶液，流速为0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集含多糖的主峰的洗脱液，经浓缩，孔径为2000Da的透析袋透析后冻干得到白色疏松絮状均一的茶藨子木层孔菌多糖，命名为PRG。

实施例2

PRG纯度检测和分子量测定

将实施例1制得的茶藨子木层孔菌多糖PRG，采用高效液相色谱联用多角度激光散射测定纯度和分子量。色谱柱为G3000 PWXL 和 G4000 PWXL 两个TSK凝胶柱连用，配备示差折光和多角度激光散射检测器，流动相为0.2M NaNO₃。样品用0.2M NaNO₃配制成1mg/ml的浓度，0.22μm滤膜滤过，进样200 μl，流速为0.6 ml/min。记录色谱峰如图1，显示为对称的单一峰，说明PRG均一性良好，测得其重均分子量为5.16×10³Da。

实施例3

PRG组分检测

将实施例1制得的茶藨子木层孔菌多糖PRG，用苯酚-硫酸法检测总糖含量为98.1%，用考马斯亮蓝法（Bradford法）检测不含蛋白，用间羟苯酚法检测不含糖醛酸。1mg/ml水溶液进行200nm-400nm紫外扫描，结果见图2，在260nm和280nm处，没有明显吸收峰，说明该样品中不含核酸和蛋白。

实施例4

PRG单糖组成

称取实施例1制得的茶藨子木层孔菌多糖PRG 10 mg，加入2 mol/L的三氟乙酸6ml，充N₂后封口，110°C水解3小时，转出，60°C减压浓缩至干。加入甲醇少许，蒸干，重复3~5次，以完全蒸出TFA。水解产物真空干燥12h，加入5mg的盐酸羟胺、0.3ml吡啶及4mg肌醇（内标）， 90°C搅拌反应30min。取出后冷至室温，加入0.8ml的醋酸酐，90°C下继续反应30min进行乙酰化，反应产物直接进行气相色谱分析。另取标准单糖木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按上法制备衍生物，进行气相色谱分析。

气相分析色谱分析条件为进样口：split-splitless, 温度250°C；层析柱：DB-5石英毛细管柱，0.25m×0.25mm×30m，流量1mL/min；升温程序：120°C保持3min，至250°C每分钟升温8°C，250°C保持10min；质谱：EI源，电离电压70eV；检测器：FID检测器，温度220°C，载气He；进样量：0.5l，分流比30:1，扫描范围20~600aum。

结果如图3和图4，通过与标准单糖对照，PRG单糖组成为葡萄糖，说明茶藨子木层孔菌多糖PRG为葡聚糖。

实施例5

PRG红外光谱检测

取干燥的PRG1.0mg，以KBr压片，在4000 cm^-1-400cm^-1的范围内进行红外光谱扫描，记录红外光谱图。

如图5，在1730cm^-1左右没有糖醛酸的特征吸收峰，在810cm^-1和870cm^-1处也没有甘露糖的特征吸收峰，表明不含糖醛酸和甘露糖。1200~1000cm^-1处强的吸收峰提示PRG的单糖为吡喃环类型。在3396.31cm^-1处出现一个较强的宽峰，为羟基（-OH）的伸缩振动；在2892.41cm^-1处出现的吸收峰较弱，为C-H的伸缩振动。1612.98cm^-1处的吸收峰是由于样品中的水引起的；在896.72cm^-1处可以观察到的吸收峰表明PRG中的糖苷键为β-构型。

实施例6

PRG核磁共振检测

取PRG30mg， 50°C真空干燥24h，溶于0.5ml D₂O中，在Bruker Avance 600 MHz spectrometer上测定其¹H NMR和¹³C NMR谱，以DSS为内标（δ_H 0.00ppm，δ_C 21.74ppm ），测定温度为40°C。

¹H NMR如图6(a)。在4.5~5.5ppm异头区域内有四个峰，分别在δ4.39、δ4.40、δ4.60和δ4.65处，提示可能有四种糖苷键的连接方式；其化学位移值均小于4.9，说明PRG中糖苷键的构型均为β型。3.2~4.2ppm处的H信号为糖环上H-2~H-6质子，化学位移值接近，重叠严重。

PRG的¹³C NMR见图6(b)。在160～180ppm处未见羰基碳信号，表明该多糖不含糖醛酸和糖蛋白，δ<20ppm处未见碳信号，说明PRG中不含甲基糖。95~100ppm的低场区出现四个信号峰，为异头碳，其化学位移分别是δ102.44，δ102.72，δ102.81和δ102.88，与¹H NMR谱中的四个异头氢信号峰相对应，说明组成PRG的基本重复单元中确实含有四种糖苷键的连接方式，化学位移值大于102ppm进一步证明单糖残基构型为β型。四个异头碳及异头质子的信号峰分别是1→6、1→3、1→3，6和末端葡萄糖的信号峰。化学位移在60~90ppm区域的信号为糖环上C-2~C-6信号，其中较低场的δ83.90、δ84.54信号是1→3，1→3，6连接的葡萄糖残基中的C-3，由于成苷而移向低场，未成苷的C-3位于75~78ppm化学位移处；较高场的δ60.61、δ62.44为未取代的C-6，分别是末端葡萄糖残基和1→3连接的葡萄糖残基信号，根据苷化位移规则，取代了的C-6信号将移向低场，位于70.00ppm附近，此信号可以从DEPT谱[图6(c)]中得以辨认，其中68.62ppm处的倒置峰(CH2)即是1→6连接和1→3，6连接的葡萄糖残基中的C-6信号。具体结构单元如结构式所示。

实施例7

PRG神经营养活性测定

本发明检测了实施例1制得的茶藨子木层孔菌多糖PRG的神经营养活性。

采用PC12细胞测定神经突生长促进作用。取对数生长期的PC12细胞，用含10%马血清和5%胎牛血清的DMEM悬浮细胞，计数，以每孔8×10³个细胞接种于24孔培养板中，每孔体积400μl，在37℃，5%CO₂培养箱培养24 h后，用含2%马血清和1%胎牛血清的DMEM替换原来培养基，然后加入1 ng/ml NGF和不同浓度的样品溶液，每一浓度设置3个复孔。继续培养4天后，4% 多聚甲醛固定，亚甲蓝染色，显微镜下观察。

形态学观察结果如图7，在1ng/ml的NGF存在下，PRG可以促进神经轴突的生长。进行定量分析，结果见图8，在10 μg/ml、50 μg/ml、150 μg/ml浓度时，PC12细胞神经轴突的平均长度分别为40.9μm、54.3μm和58.4μm，与对照组（平均长度为32.7μm）比较具有显著性差异。说明茶藨子木层孔菌多糖PRG具有显著的神经营养活性，可以开发为治疗神经退行性疾病如阿尔默茨病的候选药物。