一种来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂及其基因和其重组蛋白的应用

摘要

本发明涉及一种来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂及其基因和其重组蛋白的应用，属于生物医学领域。该胰凝乳蛋白酶抑制剂的蛋白质具有氨基酸序列SEQ ID No.1，编码的单环刺螠胰凝乳蛋白酶抑制剂UCI01是单链多肽，含67个氨基酸残基，分子量约为7516Da，等电点为4.38，不含二硫键，没有明显的信号肽区域。该基因具有序列表SEQ ID No.2中的碱基序列，cDNA序列全长度为697bp，其中含有80bp的5`非翻译区，413bp的3`非翻译区和polyA尾巴，开放编码框为201bp。利用原核表达技术对该基因进行重组表达，获得的重组蛋白具有胰凝乳蛋白酶抑制剂的活性，其IC50为53nM。该重组蛋白具有较好的pH稳定性和一定的温度稳定性，对金黄色葡萄球菌具有抑菌效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂及其基因和其重组蛋 白的应用，属于生物医学领域。

背景技术

生物体中的蛋白酶系是维系生命的关键物质之一，但蛋白酶的不正常表达或 释放也会导致机体产生严重的病变。有机体调节这些酶活的主要途径之一便是积 累一定的特异性蛋白酶抑制剂，胰凝乳蛋白酶抑制剂就是其中一种。

胰凝乳蛋白酶抑制剂(Chymotrypsin Inhibitor,CI)广泛存在于微生物、豆科 植物、禾本科植物、节肢动物和哺乳动物等的体内，主要作用是停止、阻止或降 低胰凝乳蛋白酶活性。胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)又叫糜蛋白酶，是一种典型 的丝氨酸蛋白酶，在生物体的多种组织和器官中发挥着非常重要的作用，也是一 些病原生物或肿瘤细胞的重要病原因子。

根据结构、分子量等的不同，丝氨酸蛋白酶抑制剂分为不同类型，其中马铃 薯蛋白酶抑制剂I(PI-1)家族是其中一亚种。马铃薯蛋白酶抑制剂I家族的来源 不局限于马铃薯，在其他生物体(如：大麦、番茄)、动物(如：水蛭)中也有发 现。这类蛋白质一般具有抑制胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶的活性，结构上，这类 蛋白酶的分子量较小(60～90个氨基酸残基)，结构中不含二硫键。

单环刺螠(Urechis uniconctus)俗称海肠，是我国北方沿海特有的一种海洋螠虫 类动物，是无管螠目在我国沿海分布的唯一种类。主要分布于我国渤海、黄海、 俄罗斯、朝鲜半岛、日本北海道等地，山东胶州地区是我国海肠的最大产地。其 个体粗大，肉嫩味美，体壁蛋白质含量高达22.84％，且富含多种人体必需氨基酸， 具有极高的食用价值，又称“裸体海参”。同时，单环刺螠栖息于沿海沙岸潮间带 下区及潮下带浅水区“U型”隧道内，能够在其他动物不能生存的富硫环境中生存， 在作为提取海洋药用活性物质、保健品的原料方面也具有极大潜力。

发明内容

本发明的目的是基于上述理论和现有技术基础，提供一种利用重组表达技术 制备的、来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂及其基因和其重组蛋白的应用。

本发明的技术方案是：

一种来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂，该胰凝乳蛋白酶抑制剂的蛋白 质具有氨基酸序列SEQ ID No.1：

MATKEQWPELVGKSGEEAKAAIIAERPELEKVEICNELSPMTMDYRTDR VRIFVNNDGNVVNPPQTG。

所述的来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂，编码的单环刺螠胰凝乳蛋白 酶抑制剂UCI01是单链多肽，含67个氨基酸残基，分子量约为7516Da，等电点 为4.38，不含二硫键，没有明显的信号肽区域。

一种来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因，该基因具有序列表SEQ ID No.2中的碱基序列。

所述的来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因，该基因cDNA序列全长 度为697bp，其中含有80bp的5`非翻译区，413bp的3`非翻译区和polyA尾巴， 开放编码框为201bp。

一种来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因重组蛋白的应用，该胰凝乳 蛋白酶抑制剂基因的重组表达工程菌株EUCI01，实现所述基因的可溶性表达。

所述的来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因重组蛋白的应用， EUCI01表达的重组蛋白，具有较强的胰凝乳蛋白酶抑制剂活性，其IC50为53nM。

所述的来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因重组蛋白的应用，胰凝乳 蛋白酶抑制剂活性，重组蛋白对pH稳定，同时具有温度稳定性。

所述的来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因重组蛋白的应用，EUCI01 表达的重组蛋白，能够对金黄色葡萄球菌产生抑制。

本发明的优点及有益效果在于：

1、本发明克隆得到一个单环刺螠胰凝乳蛋白酶抑制剂的cDNA序列，并利 用重组方法纯化制备了具有胰凝乳蛋白酶抑制活性的蛋白质。从而，为后续应用 奠定了基础。

2、本发明利用原核表达技术对该基因进行重组表达，获得的重组蛋白具有胰 凝乳蛋白酶抑制剂的活性，其IC50为53nM。该重组蛋白具有较好的pH稳定性 和一定的温度稳定性，对金黄色葡萄球菌具有抑菌效果。

附图说明

图1：重组蛋白的SDS-PAGE分析图。其中，1蛋白marker；2未诱导的EUCI01； 3诱导后的EUC01；4纯化后的UCI01。

图2：UCI01对蛋白酶的抑制效果分析。其中，Trypsin为胰蛋白酶， Chymotrypsin为胰凝乳蛋白酶，横坐标Inhibition Concentration代表UCI01的浓度， 纵坐标Residual enzyme activity代表蛋白酶的活性。

图3：温度、pH对UCI01活性的影响。其中，a图为pH对UCI01活性的影 响；b为温度对UCI01活性的影响，纵坐标Residual enzyme activity代表所测试蛋 白酶的活性。

具体实施方式

以下为本发明内容的具体实施方式，但本发明的内容并不限于此，具体发明 内容包括：

1、单环刺螠胰凝乳蛋白酶抑制剂UCI01基因

本发明利用海水养殖病原菌刺激后的单环刺螠组织构建cDNA文库，通过大 量的测序，获得一个类似蛋白酶抑制剂的基因片段，通过RACE技术获得其全长 基因。将本发明的单环刺螠胰凝乳蛋白酶抑制剂编码基因经NCBI基因数据库进 行搜寻比对，没有发现存在任何相同基因或基因片段或基因表达产物的报道。通 过对其可能的编码产物的比对分析发现，其与一种水蛭(Helobdella robusta)、紫 海胆(Strongylocentrotus purpuratus)以及一些细菌中的推测可能具有蛋白酶抑制 剂功能的蛋白质的相似性为42～59％。通过蛋白质结果分析发现其可能属于马铃 薯蛋白酶抑制剂I家族，命名为UCI01。

单环刺螠胰凝乳蛋白酶抑制剂UCI01的cDNA序列具有80bp 5`非翻译区， 413bp 3`非翻译区和polyA尾巴，201bp的开放编码框，该基因具有序列表SEQ ID  No.2中的碱基序列。

编码的单环刺螠胰凝乳蛋白酶抑制剂UCI01是单链多肽，含67个氨基酸残 基，分子量约为7516Da，等电点为4.38，不含二硫键，该胰凝乳蛋白酶抑制剂的 蛋白质具有氨基酸序列SEQ ID No.1。

2、UCI01的重组表达菌株

本发明根据获得的UCI01基因设计引物，PCR扩增后亚克隆至原核表达质粒 pET25(a)中，转化至相应的宿主菌中，成功构建基因工程菌株EUCI01。

根据pET系统的使用说明，通过优化诱导条件，进行重组蛋白的诱导表达。 将诱导后的EUC01冰浴后超声破碎，基于表达载体所带的6个组氨酸标签，利 用Ni亲和层析柱进行重组蛋白的纯化。经SDS-PAGE分析，纯化后的重组UCI01 只有一条带，大小约为7.6kDa，与预期大小一致。经考马斯亮蓝R-250比色法测 定的重组蛋白浓度为4mg/ml。

3、重组UCI01的应用

UCI01的蛋白酶抑制剂活性测定采用比色法，利用牛胰凝乳蛋白酶和人胰蛋 白酶，其中胰凝乳蛋白酶底物为Nsuccinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(Sigma, USA)，胰蛋白酶的底物采用BAPNA((Sigma,USA)。经测试，UCI01显示了较 弱的胰蛋白酶抑制能力。但UCI01具有较强的胰凝乳蛋白酶的抑制活性，其IC50 为53nM。随后发现pH对UCI01的活性没有太大影响，同时UCI01具有一定的 温度稳定性，80℃下保存3.5h仍可保持约20％的活性。

下面通过附图和实施例对本发明进一步详细说明。

实施例1：单环刺螠胰凝乳蛋白酶抑制剂基因UCI01的获取

(1)组织总RNA提取：取市售单环刺螠在实验室条件下暂养2天，选择无 任何病症的健康个体，用约1×10⁶个过夜培养至对数生长期的海水致病菌副溶血 弧菌(Vibrio parahaemdyticus)CGMCC 2164注射入单环刺螠体腔中。2h后，麻醉 处死单环刺螠，取单环刺螠的呼吸肠、体腔壁、体腔血液细胞等组织，称重，取 200～300mg组织，加入8～10m1总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，TAKARA)， 于20m1玻璃匀浆器中匀浆。加入等体积苯酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10～ 15min，4～6℃于10000～12000rpm离心10～15min，弃除沉淀。上清加入等体积 的异丙醇，室温放置10～15min，4～6℃于10000～12000rpm离心10～15min， 沉淀用75wt％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为总RNA。

(2)mRNA的纯化：采用美国PROMEGA公司的mRNA  Isolation Systems试剂盒进行mRNA分离纯化。具体操作为：取总RNA 300～500μg 溶于300～500μl的DEPC水中，放入65℃水浴8～10min，加入3～5μl的Oligo(dT) 探针和13～15μl的20×SSC溶液(柠檬酸钠缓冲液)，混匀，放置室温冷却，称 为A液；将磁珠(SA-PMP)轻弹混匀，至磁力架吸附时间30～40s，弃上清，加 0.5×SSC(柠檬酸钠缓冲液)0.3～0.5m1，至磁力架吸附时间30～40s，最后加0.1～ 0.2ml的0.5×SSC悬浮，称之为B液；将A液加入B液中，室温放置10～15min， 至磁力架吸附30s，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1～0.2ml 的DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30s，将上清移至新的试管，再加入0.15m1的 DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30s，移上清至上述试管，加入1/10体积 3M(mol/L)乙酸钠和等体积的异丙醇，室温放置30～60min，4℃，12000rpm离心 10～15分钟，弃上清，沉淀溶解于10～20μl的DEPC水中。

(3)单环刺螠cDNA文库的构建：采用CLONTECH公司Creator^TM SMART^TM  cDNA Library Construction Kit。具体如下：

a、cDNA第一链合成(mRNA反转录)：在DEPC处理的离心管中加入1μl单 环刺螠mRNA、1μl的SMART IV寡聚核苷酸、1μl的CDS III/3’PCR引物，加2μl 的DEPC处理的水使总体积达到5μl。混匀离心管中的试剂并短暂离心，72℃保 温2分钟。将离心管在冰上孵育2分钟，在离心管中加入2.0μl的试剂盒中的第 一链缓冲液、1.0μl的20mM(mmol/L)二硫苏糖醇、1.0μl的10mM dNTP混合 物、1.0μl的PowerScript反转录酶。混合离心管中试剂并短暂离心，在42℃保温 1小时。将离心管置于冰上中止第一链的合成，从离心管取2μl所合成的cDNA 第一链备用。

b、第二链的扩增：采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法：将2μl的cDNA 第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl的10×Advantage 2 PCR缓冲液、 2μl的50×dNTP混合物、2μl的5’PCR引物、2μl的CDS III/3’PCR引物以及2μl 的大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。95℃预变性20秒钟，95℃、5秒，68℃、6 分钟，循环20次，将合成的cDNA双链置于-20℃保存。

c、基因片段的筛选：将构建好的cDNA文库连接到Vertor (TAKARA)，转化DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆，使用Applied Biosystems DNA  sequencer,model ABI PRISM 377进行核苷酸测序。

d、完整cDNA序列的获取：对测序获得的UCI01基因的部分片段两端设计 引物，利用RACE技术获取基因的完整cDNA序列。获得UCI01的cDNA序列 具有80bp 5`非翻译区，413bp 3`非翻译区和polyA尾巴，201bp的开放编码框。 其DNA序列为SEQ ID No.2：

5`-GCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAGGGGACTCTCTGTCCAGCAGCAC ACGGCGGTGATCAGACTTCGTACAGATATCAAAATGGCAACCAAGGAACAATGGCCCGAGTTGGTTGGCAAGAGTGGCGAGGAAGCCAAGGCTGCTATCATTGCAGAAAGACCTGAGTTGGAAAAGGTTGAAATCTGCAACGAGTTGAGTCCGATGACCATGGACTACCGCACCGACAGAGTTCGCATTTTTGTCAACAATGACGGCAATGTTGTGAACCCTCCCCAGACCGGTTAGATGTACATCTACAT GTAGAATGCTGGAGATGGATTGATTGGAAGTGTCATGTTACTTTAAGAACT GCAATCTATCTGTGAATGGTGCTGCAAGCGACAAGAAAGTGGTCAATGTTA TCTGTTACGTATGTGAACAATGCTGTGAGCCAGTAATTATTGTGTACTGTCA TCTGGATATGTTACCATTCCAACATGTTAACTCAAGTTTGGACCCAATTTTT TTCAAAATTTCTGGGGGACCCTATCTTCCAACAATTTGATATGGCTGCGTTT CTTATATTTCGATGGAAGTCATCATTTGTCCAAACAAATTTTGATTGTGTCA GATAAGTTGACGTATGCATTTCTATATGTTGGTAATAACAAAGTAAACTTATA TAAAACTGATTTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3`

e、通过对基因编码产物分析发现，编码的单环刺螠胰凝乳蛋白酶抑制剂 UCI01是单链多肽，含67个氨基酸残基，分子量约为7516 Da，等电点为4.38， 不含二硫键。其氨基酸序列为SEQ ID No.1：

MATKEQWPELVGKSGEEAKAAIIAERPELEKVEICNELSPMTMDYRTDR VRIFVNNDGNVVNPPQTG

实施例2：UCI01的重组表达菌株的构建

根据获得的cDNA序列，设计引物进行UCI01基因的克隆。引物序列为：

正向引物5`-CATATGGCAACCAAGGAACAATGGC-3`(NdeI)；

反向引物5`-CTCGAGACCGGTCTGGGGAGGGT-3`(XhoI)。

PCR反应在如下条件下进行：94℃、2分钟，94℃、30秒钟，68℃、30秒钟 和72℃、40秒钟，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目 的片段的回收。将回收的DNA片段经NdeI和XhoI双酶切后，与采用相同双酶 切处理的pET25(a)连接后转化入BL21(DE3)菌中，构建重组表达菌株EUCI01。

实施例3：UCI01的诱导表达及纯化

(1)诱导表达：按照常规大肠杆菌的培养条件(LB培养基，37℃过夜培养)， 将EUCI01培养至对数生长前期，分别添加终浓度为0.1～10mmol/L的异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，18～37℃、100～350rpm诱导表达4～12h， 将菌液转移到5ml离心管中，4～6℃，6000～8000r/min离心2～5min，将沉淀用 2～5ml预冷的Lysis butter冲洗1～2次，再次离心后，沉淀用5ml预冷的Lysis butter 重悬，置于0～4℃超声波破碎(工作时间3～5s，间歇时间6～8s，功率350～400W， 150～300个循环)。将破碎后的溶液转移到新的5ml离线管中，4～6℃，12000～ 15000r/min离心20～30min，分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE分析目的蛋白的 表达情况。结果发现，当添加0.01～0.2mmol/L的IPTG做诱导剂，18～25℃、100～ 200rpm诱导4～8h时，目的蛋白实现了可溶性表达。

(2)蛋白纯化制备：将培养至对数期的EUCI01加入0.01mmol/L的IPTG， 于18℃诱导8h后，超声破碎取上清。将上清加之预先用Lysis Buffer平衡好的 Ni-NTA柱子上，用5～6倍柱体积的Wash Buffer洗掉杂蛋白，用2～3倍柱体积 的Elution Buffer将融合蛋白洗脱。将洗脱后的溶液用PBS缓冲液过夜透析，用最 小分子量为5kDa的蛋白分子截留离心柱于4～6℃，6000～8000rpm离心20～ 30min，获得重组蛋白溶液。

(3)蛋白浓度及纯度测定：利用考马斯亮蓝R250法测定重组蛋白的浓度为 4mg/ml。利用SDS-PAGE分析发现重组蛋白只有一条目的条带，大小约为7.6kDa， 与预期一致(图1)。

实施例4：蛋白活性测定

(1)对蛋白酶的抑制能力测试：本实施例反应的缓冲液为0.2mmol/L的 Tris-HCl缓冲液，0.02mmol/L的CaCl₂水溶液，pH＝8.0。取300μl浓度为5.0mg/ml 的牛胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶(BBI)，加入等体积的含有不同UCI01浓度(0， 160，320，480，640，800，1000μg)的样品，37℃水浴保温30min，加入500μl、 1.5mg/ml的胰蛋白酶底物BAPNA(Sigma,USA)或胰凝乳蛋白酶底物 Nsuccinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(Sigma,USA)。37℃保温5min，加入600μl、 浓度30wt％的乙酸终止反应。10000～12000rpm，离心3～5min，取上清测定405nm 处吸光值。结果显示UCI01对胰凝乳蛋白酶的活性影响不大，当UCI01的浓度增 加至最高浓度时，对胰蛋白酶活性仅产生20％的抑制，但能显著抑制胰凝乳蛋白 酶的活性，其IC50为53nM(图2)。

(2)pH对UCI01的影响：配制不同pH(4、5、6、7、8、9)的反应缓冲 液，按照实施例4中步骤2的方法，测定在pH变化对UCI01的胰凝乳蛋白酶抑 制能力的影响。结果如图3a所示，pH对UCI01的活性影响不明显，说明UCI01 具有较宽的pH适应能力。

(3)温度对UCI01的影响：将UCI01溶液置于不同温度(-20、4、10、20、 30、40、50、70℃)中保存3.5～4h，随后利用实施例4步骤2的方法，测定不同 保温条件下UCI01活性的变化。如图3b所示，温度对UCI01的活性影响较大。 随着保存温度的上升活性逐渐降低。但在70℃保存4h后仍具有20％的活性。

(4)UCI01抑菌能力测定：采用滤纸片体外抑菌法测试UCI01的抑菌能力。 将实验室保存的试验菌株按照推荐的培养条件过夜培养至对数生长期，取10⁷个 试验菌株均匀涂布于相应的固体培养基平板上，将含有一定浓度UCI01的无菌滤 纸片小心贴附于培养基表面，37℃正置培养18～24小时，观察抑菌圈形成。结果 显示UCI01对被测试的革兰氏阴性菌如肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)、大 肠杆菌(Escherichia coil)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、甲副伤寒 杆菌(B paratyphoid coil)没有明显的抑菌效果；对白色念球菌(Monilia albican) 有较弱的抑菌作用(抑菌圈直径<3mm)；对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌 (staphylococcus aeruginosa)ATCC25923抑菌效果较好(抑菌圈>10mm)。