一种与临床原因不明的NOA辅助诊断相关的低频SNV标志物及其应用

摘要

本发明属于基因工程及生殖医学领域，公开了一种与临床原因不明的NOA辅助诊断相关的低频SNV标志物及其应用。该标志物为rs2294228、rs2180233、rs41360247、rs895497、rs6806528、rs3130785、rs117524265、rs9369640、rs34902660、rs2298090、rs13194053、rs11965377、rs3893259、rs9261588、rs1264429、rs2523480、rs2524276、rs2255221等32个低频SNV的组合。该标志物可用于制备临床原因不明的非梗阻性无精子症辅助诊断试剂盒。

说明书

发明领域

本发明属于基因工程及生殖医学领域，涉及一种与临床原因不明的NOA辅助诊断 相关的低频SNV标志物及其应用。

背景技术

生育是一个复杂的过程，不能由单独的个体完成，而是取决于男女双方，只有在双 方各种条件均适宜的情况下，才能顺利完成。WHO的统计数据显示，不孕不育已经成 为人类生殖健康领域最为常见的疾病之一，大约每七对夫妇中就有一对存在着各种程度 的生育障碍，其中有近一半是由于男性问题所致，由此被称为男性不育。男性不育给个 人、家庭造成了沉重的精神及经济负担，成为家庭及社会的不稳定因素之一。

在所有导致男性不育病因中，无精子症最为常见，流行病学数据表明，成年男性无 精子症患病率将近1％。无精子症是指患者三次正常排精后，精液中没有精子。它可分 为梗阻性和非梗阻性无精子症。梗阻性无精子症【obstructive azoospermia(OA)】是因输 精管道梗阻而导致精液中没有精子，非梗阻性无精子症【non-obstructive  azoospermia(NOA)】是由于男性睾丸生精障碍所致，后者的精子数量和形态均较差，所 有的睾丸精子活动能力都很低，或者没有活动能力，其危害程度远大于OA。引起NOA 的原因很多，包括遗传学疾病(如Klinefelter综合征)、先天性睾丸异常、睾丸本身病 变(如睾丸外伤，炎症，扭转及睾丸血管病变)、内分泌疾病(如垂体功能亢进或低下、 垂体肿瘤、肾上腺功能亢进或低下、甲亢或甲减等)、严重全身性疾病和营养不良，以 及放射性损伤及药物等。值得注意的是，相当数量的NOA临床原因不明，其早期诊断 和治疗就显得更为困难。在我国，约有25％的男性不育患者是NOA，因此，NOA，尤 其是临床原因不明的NOA，不仅是我国成年男性生殖健康面临的最主要威胁之一，也 是男性不育治疗的一个严峻问题。

目前，NOA的初步诊断方法主要为病史询问、体格检查、精液参数、精浆生化、 血性激素检测、B超以及染色体检测等。世界卫生组织在男性不育的诊断检查及处理 手册指明：无精子症是指精子密度等于0，即使将精液离心后检查亦不能发现精子。 临床上通常3次离心镜检精液仍未见到精子，同时，排除不射精和逆行射精后方可确 诊为无精子症病人。常规的精子密度分析目前主要依靠精子密度判别(人工计数或利 用计算机辅助系统分析，即CASA)，尚无其他有效手段，但其自身存在一定的缺陷， 如个体精液质量波动较大，尤其易受到禁欲天数、温度、采集精液方法等因素的影响， 从而造成精子密度测量不准确，对相应疾病的早期诊断效果也远不能满足需要。而明 确诊断常需进行睾丸穿刺活检，这给寻求生育帮助的人群带来极大的痛苦。尽管目前 国内外研究者正努力探索新的NOA诊断生物标志物，对现有评估手段进行有效的补 充，但一直难以突破传统生物标志物发展在男性生殖实际应用中的瓶颈，即有创穿刺 活检、精液质量分析结果波动、以及早期诊断困难等。此外，由于病因不明，缺乏有 效的治疗手段，大多数NOA病人只能选择ICSI或AID等辅助生育手段，不仅无法 满足心理上的需求，还有可能出现后代的遗传缺陷。

研究表明，遗传因素约占男性不育因素的15％-30％，是男性不育的主要病因，单核 苷酸变异(single nucleotide variant,SNV)在其中起重要作用。SNV是指在基因组水平 上由单个核苷酸的变异—A,T,C或G的改变而引起的DNA序列的改变，造成包括人类 在内的物种之间染色体基因组的多样性，是人类可遗传变异中最常见的一种。SNV的存 在被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应 性。SNV包括常见遗传变异(common variants)和低频遗传变异(rare variants)，前者最小 等位基因频率≥5％，为低外显率突变，而后者的最小等位基因频率＜5％，为高度外显率 突变。研究发现，人类基因组中低频遗传变异的数目远超过常见遗传变异，并且，低频 遗传变异能解释常见复杂疾病中相当大一部分的遗传贡献。因此低频高外显性遗传标 志物可能是导致个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。利用疾病易感 的低频SNV谱诊断疾病的发生，灵敏、准确和快速，具有广阔的应用前景。近年来， 利用低频高外显性遗传标志物诊断疾病的发生发展已经成为临床和科研工作者的研究 热点，在肿瘤和心血管疾病等常见重大疾病的应用价值已初见端倪。

然而，目前还没有将低频高外显性遗传标志物应用于临床原因不明的NOA诊断的 报道，若能筛选出临床原因不明的NOA易感的低频SNV作为生物标志物，并研制相应 的诊断试剂盒，对我国临床原因不明的NOA的诊断现状必将是一次有力的推动，也为 其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与临床原因不明的NOA辅助诊断相 关的低频高外显性遗传标志物及其应用

本发明的第二个目的是提供上述低频高外显性遗传标志物的特异性扩增引物。

本发明的第三个目的是提供上述低频高外显性遗传标志物的特异性延伸引物。

本发明的第四个目的是提供上述低频高外显性遗传标志物及其特异性扩增引物和 特异性延伸引物在制备临床原因不明的NOA辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明的第五个目的是提供临床原因不明的NOA辅助诊断试剂盒。

发明人通过分离和研究临床原因不明的NOA患者及其年龄匹配的健康男性对照外 周血DNA中的低频高外显性遗传标志物，寻找一组与临床原因不明的NOA高度相关 的特异性和敏感性的遗传标志物，并研制出可便于临床应用的原因不明的NOA辅助诊 断试剂盒，为临床原因不明的NOA的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗 价值的新型小分子药物提供数据支持。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种与临床原因不明的非梗阻性无精子症辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志 物，其特征在于该标志物为rs2294228、rs2180233、rs41360247、rs895497、rs6806528、 rs3130785、rs117524265、rs9369640、rs34902660、rs2298090、rs13194053、rs11965377、 rs3893259、rs9261588、rs1264429、rs2523480、rs2524276、rs2255221、rs3135374、rs3892710、 rs9471969、rs76491994、rs113857788、rs61756355、rs180810179、rs10830430、rs34719836、 rs187646949、rs151176313、rs28599881、rs149543099和rs199747280的组合。

所述的低频高外显性遗传标志物的特异性扩增引物，这些引物为：

rs2294228的扩增引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；rs2180233的扩增引物 序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5；rs41360247的扩增引物序列为SEQ ID No:7和SEQ  ID No:8；rs895497的扩增引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；rs6806528的扩 增引物序列为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14；rs3130785的扩增引物序列为SEQ ID  No:16和SEQ ID No:17；rs117524265的扩增引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID  No:20；rs9369640的扩增引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23；rs34902660的扩 增引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；rs2298090的扩增引物序列为SEQ ID  No:28和SEQ ID No:29；rs13194053的扩增引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32； rs11965377的扩增引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；rs3893259的扩增引物序 列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38；rs9261588的扩增引物序列为SEQ ID No:40和SEQ  ID No:41；rs1264429的扩增引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；rs2523480的 扩增引物序列为SEQ ID No:46和SEQ ID No:47；rs2524276的扩增引物序列为SEQ ID  No:49和SEQ ID No:50；rs2255221的扩增引物序列为SEQ ID No:52和SEQ ID No:53； rs3135374的扩增引物序列为SEQ ID No:55和SEQ ID No:56；rs3892710的扩增引物序 列为SEQ ID No:58和SEQ ID No:59；rs9471969的扩增引物序列为SEQ ID No:61和SEQ  ID No:62；rs76491994的扩增引物序列为SEQ ID No:64和SEQ ID No:65；rs113857788 的扩增引物序列为SEQ ID No:67和SEQ ID No:68；rs61756355的扩增引物序列为SEQ  ID No:70和SEQ ID No:71；rs180810179的扩增引物序列为SEQ ID No:73和SEQ ID  No:74；rs10830430的扩增引物序列为SEQ ID No:76和SEQ ID No:77；rs34719836的扩 增引物序列为SEQ ID No:79和SEQ ID No:80；rs187646949的扩增引物序列为SEQ ID  No:82和SEQ ID No:83；rs151176313的扩增引物序列为SEQ ID No:85和SEQ ID No:86； rs28599881的扩增引物序列为SEQ ID No:88和SEQ ID No:89；rs149543099的扩增引物 序列为SEQ ID No:91和SEQ ID No:92；rs199747280的扩增引物序列为SEQ ID No:94 和SEQ ID No:95。

所述的低频高外显性遗传标志物的特异性延伸引物，这些引物为：

rs2294228的延伸引物序列为SEQ ID No:3；rs2180233的延伸引物序列为SEQ ID  No:6；rs41360247的延伸引物序列为SEQ ID No:9；rs895497的延伸引物序列为SEQ ID  No:12；rs6806528的延伸引物序列为SEQ ID No:15；rs3130785的延伸引物序列为SEQ ID  No:18；rs117524265的延伸引物序列为SEQ ID No:21；rs9369640的延伸引物序列为SEQ  ID No:24；rs34902660的延伸引物序列为SEQ ID No:27；rs2298090的延伸引物序列为 SEQ ID No:30；rs13194053的延伸引物序列为SEQ ID No:33；rs11965377的延伸引物序 列为SEQ ID No:36；rs3893259的延伸引物序列为SEQ ID No:39；rs9261588的延伸引 物序列为SEQ ID No:42；rs1264429的延伸引物序列为SEQ ID No:45；rs2523480的延 伸引物序列为SEQ ID No:48；rs2524276的延伸引物序列为SEQ ID No:51；rs2255221 的延伸引物序列为SEQ ID No:54；rs3135374的延伸引物序列为SEQ ID No:57；rs3892710 的延伸引物序列为SEQ ID No:60；rs9471969的延伸引物序列为SEQ ID No:63；

rs76491994的延伸引物序列为SEQ ID No:66；rs113857788的延伸引物序列为SEQ ID  No:69；rs61756355的延伸引物序列为SEQ ID No:72；rs180810179的延伸引物序列为 SEQ ID No:75；rs10830430的延伸引物序列为SEQ ID No:78；rs34719836的延伸引物序 列为SEQ ID No:81；rs187646949的延伸引物序列为SEQ ID No:84；rs151176313的延 伸引物序列为SEQ ID No:87；rs28599881的延伸引物序列为SEQ ID No:90；rs149543099 的延伸引物序列为SEQ ID No:93；rs199747280的延伸引物序列为SEQ ID No:96。

所述的低频高外显性遗传标志物在制备临床原因不明的NOA辅助诊断试剂盒中的 应用。

所述的低频高外显性遗传标志物的特异性扩增引物在制备临床原因不明的NOA辅 助诊断试剂盒中的应用。

所述的低频高外显性遗传标志物的特异性延伸引物在制备临床原因不明的NOA辅 助诊断试剂盒中的应用。

一种临床原因不明的NOA辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中 rs2294228、rs2180233、rs41360247、rs895497、rs6806528、rs3130785、rs117524265、 rs9369640、rs34902660、rs2298090、rs13194053、rs11965377、rs3893259、rs9261588、 rs1264429、rs2523480、rs2524276、rs2255221、rs3135374、rs3892710、rs9471969、 rs76491994、rs113857788、rs61756355、rs180810179、rs10830430、rs34719836、 rs187646949、rs151176313、rs28599881、rs149543099和rs199747280。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述低频高外显性遗传标志物的特异性扩增引 物和/或特异性延伸引物。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、 dNTP混合液、Mgcl₂溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。

具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库： 以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资 料。(2)基因型检测：选择临床原因不明的NOA病例、与临床原因不明的NOA病例年 龄匹配的健康男性对照，利用高密度低频高外显性遗传标志物芯片，在全外显子范围 内找出与临床原因不明的NOA相关的遗传标志物。(3)对筛选出的阳性关联遗传标志 物，进一步采用Sequenom MassARRAY基因分型平台进行检测，以验证将其应用于 诊断的可重复性。(4)临床原因不明的NOA辅助诊断试剂盒的研制：根据临床原因不 明的NOA病例和健康男性对照中基因型分布频率又显著差异的遗传标志物开发辅助诊 断试剂盒。

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学 资料、临床资料等，并采用了IlluminaHuman Exome Beadchip(Illumina Inc., San Diego,CA)芯片进行全外显子区扫描，初筛阳性位点采用Sequenom MassARRAY 时间飞行质谱生物芯片系统进行验证。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几部分：

1.研究样本的选择

(1)重复精液质量检测/睾丸穿刺活检，确诊为无精子症；

(2)一次射精精液经离心无精子，排除梗阻性病因；

(3)性功能正常；排除具体隐睾症病史、血液外伤史、睾丸炎、输精管梗阻、输精 管切除术、多染色体异常及Y染色体无精子症因子微缺失等具有已知病因的患者；

(4)与病例年龄匹配的健康男性对照。

本研究共采用5560例符合标准的样本进行研究。(960+1800+1400+1400)

2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/ul  DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

3.IlluminaHuman Exome Beadchip(Illumina Inc.,San Diego,CA)芯片检 测

(1)取受试者DNA样本；

(2)在IlluminaHuman Exome Beadchip(Illumina Inc.,San Diego,CA) 芯片上进行全外显子区扫描；

(3)检测并比较各基因型在临床原因不明的NOA病例与健康男性对照中的分布差

4.低频高外显率遗传标志物的Sequenom MassARRAY基因分型检测

(1)取受试者全基因组DNA样本；

(2)设计低频高外显率遗传标志物的特异性扩增引物和特异性延伸引物；

(3)进行PCR扩增反应及产物纯化；

(4)进行单碱基延伸反应及产物纯化；

(5)检测并比较临床原因不明的NOA病例与健康男性对照中不同基因分型的分布 差异。

5.诊断试剂盒制备方法

IlluminaHuman Exome Beadchip(Illumina Inc.,San Diego,CA)芯片进行 全外显子区扫描和低频高外显率遗传标志物Sequenom MassARRAY基因分型平台进 行验证后确认临床原因不明的NOA病例与健康男性对照中基因型分布频率有显著差异 的遗传标志物，作为临床原因不明的NOA诊断的指标。最后筛选出的与临床原因不明 的NOA发病有关的低频高外显率遗传标志物组成辅助诊断试剂盒(rs2294228、 rs2180233、rs41360247、rs895497、rs6806528、rs3130785、rs117524265、rs9369640、 rs34902660、rs2298090、rs13194053、rs11965377、rs3893259、rs9261588、rs1264429、 rs2523480、rs2524276、rs2255221、rs3135374、rs3892710、rs9471969、rs76491994、 rs113857788、rs61756355、rs180810179、rs10830430、rs34719836、rs187646949、 rs151176313、rs28599881、rs149543099和rs199747280)。诊断试剂可以包括这些低频 标志物的特异性扩增引物和/或特异性延伸引物，以及Taq酶、dNTP等试剂。

6.统计分析方法

运用χ²检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特 征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。 计算比值比(Odds Ratio,OR)以及它们的95％可信区间。定义那些OR小于1的标志物 为保护性位点；定义那些OR大于1的标志物为危险性位点。

为了进一步研究这32个低频高外显率遗传标志物构成的综合指征用于早期诊断的 效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个低频高外显率遗传标志物与临床原因不 明的NOA发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个低频标志物的三 种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个低频SNV 分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个低频高外显率遗传标志物的 情况给每个研究对象确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下；危险分值＝ (0.48×rs2294228的评分)+(1.62×rs2180233的评分)+(0.81×rs41360247的评分)+ (1.25×rs895497的评分)+(1.49×rs6806528的评分)+(0.57×rs3130785)+ (0.48×rs117524265的评分)+(0.63×rs9369640的评分)+(1.06×rs34902660的评分) +(1.37×rs2298090的评分)+(0.56×rs13194053的评分)+(0.69×rs11965377的评分) +(0.77×rs3893259的评分)+(0.78×rs9261588的评分)+(0.56×rs1264429的评分)+ (0.86×rs2523480的评分)+(1.26×rs2524276的评分)+(1.12×rs2255221的评分)+ (0.44×rs3135374的评分)+(0.68×rs3892710的评分)+(0.58×rs9471969的评分)+ (0.47×rs76491994的评分)+(2.17×rs113857788的评分)+(0.49×rs61756355的评分) +(2.09×rs180810179的评分)+(1.34×rs10830430的评分)+(0.78×rs34719836的评分) +(1.47×rs187646949的评分)+(1.03×rs151176313的评分)+(0.98×rs28599881的评 分)+(1.11×rs149543099的评分)+(1.25×rs199747280的评分)，获得的危险分值系 数以及界限值被直接应用于使用外显子芯片进行全外显子区扫描的2760例样本中。(以 rs2294228为例：0.48为rs2294228的回归系数(见表1)；rs2294228的评分，野生纯 合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，某个SNV的基因型由仪器检测结 果确定；某个样本的总评分是这些个SNV分别评分的总和，单个SNV的基因型只是 计算评分的一个中间过程，不需要知道具体基因型。)

统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平P 值设为0.05，所以统计学检验均为双侧检验。

以下是本发明进一步的说明：

在上述960例符合条件的临床原因不明的NOA病例及1800例健康男性对照中，两 组年龄均均衡可比。我们将这两组人群经IlluminaHuman Exome Beadchip (Illumina Inc.,San Diego,CA)芯片进行全外显子区扫描获得相关结果。

根据IlluminaHuman Exome Beadchip(Illumina Inc.,San Diego,CA)检 测，本发明人检测到在“临床原因不明的NOA病例”组和“健康男性对照”组中基因 型分布频率存在差异的遗传标志物包括：rs2294228、rs2180233、rs41360247、rs895497、 rs6806528、rs3130785、rs117524265、rs9369640、rs34902660、rs2298090、rs13194053、 rs11965377、rs3893259、rs9261588、rs1264429、rs2523480、rs2524276、rs2255221、 rs3135374、rs3892710、rs9471969、rs76491994、rs113857788、rs61756355、rs180810179、 rs10830430、rs34719836、rs187646949、rs151176313、rs28599881、rs149543099和 rs199747280。

根据上述检测结果，我们将这32个与临床原因不明的NOA发病相关的低频遗传标 志物在另外1400例临床原因不明的NOA病例及与其年龄匹配的1400例健康男性对照 中进行了单个低频遗传标志物的检测，结果与芯片检测一致。

单因素和多因素logistic回归分析结果均表明，这32个低频遗传标志物与临床原因 不明的NOA的发病存在着显著关联，28个低频遗传标志物为危险因素，4个为保护因 素，变异等位基因可增加或减少临床原因不明的NOA发病风险。

进一步分析这32个低频遗传标志物的组合用于临床原因不明的NOA诊断的效果， 发现其组合能够很好的区分病例与对照。

根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于临床原因不明的NOA辅助诊断的 试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述低频遗传标志物的特异性引物、特异性荧 光探针对和其他检测试剂。

具体而言，这32个低频遗传标志物的组合，或者这32个低频遗传标志物的特异性 引物及特异性荧光探针对的组合构成的相关诊断试剂盒有助于临床原因不明的NOA的 辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个 性化的防治方案提供支持。

本发明有益效果：

本发明提供的低频遗传标志物作为临床原因不明的NOA辅助诊断判断的标志物的 优越性在于：

(1)低频高外显性遗传标志物是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志 物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的灵敏度和特异度，该类生物标志物 的成功开发将为临床原因不明的NOA的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标 志物的研制提供借鉴。

(2)遗传标志物试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于临床原因不明的NOA 的辅助诊断，有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采 取更具个性化的防治方案提供支持。

(3)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用全外显子组芯片扫描以获得疾 病相关的低频高外显性遗传标志物谱，并在Sequenom MassARRAY基因分型平台上进 行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了低频高外显性遗传标志物的诊断试剂 盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

本发明通过控制年龄对疾病发展的影响因素，研究低频高外显性遗传标志物在临 床原因不明的NOA辅助诊断的应用前景，阐述低频高外显性遗传标志物对于临床原因 不明的NOA进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了临床原因不明的NOA 发病相关的低频高外显性遗传标志物谱；通过低频高外显性遗传标志物和诊断试剂盒 的研制和应用，可使得临床原因不明的NOA的诊断更加方便易行，为临床医生快速准 确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小 分子药物靶标提供帮助。

附图说明

图1：显示全外显子组关联研究病例组和对照组的ROC曲线。

显示临床原因不明的NOA病例组对健康男性对照组为参照的ROC曲线。

具体实施方法

实施例1样品的收集和样品资料的整理

发明人于2005年4月开始至2013年1月从南京医科大学生殖医学中心收集了大量 的NOA患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了5560例符合下列标准 的样本全外显子芯片扫描和单个遗传标志物Sequenom MassARRAY基因分型的实验样 品：

1、重复精液质量检测/睾丸穿刺活检，确诊为无精子症；

2、一次射精精液经离心无精子，排除梗阻性病因；

3、性功能正常；排除具体隐睾症病史、血液外伤史、睾丸炎、输精管梗阻、输精 管切除术、多染色体异常及Y染色体无精子症因子微缺失等具有已知病因的患者；

4、与病例年龄匹配的健康男性对照。

并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。

实施例2外周血DNA中低频SNV的全外显子区扫描

在上述符合条件的960例临床原因不明的NOA患者和1800例健康男性对照中，两 组年龄匹配。将这两组人群经IlluminaHuman Exome BeadChip(Illumina  Inc.，San Diego，CA)芯片检测获得相关结果。具体步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如 下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco 0694)20ml混合后，用 TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10 分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10 分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml  0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶 K，振荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟， 取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿∶异 戊醇＝24∶1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清 (分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无 水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真 空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值) 在1.6-2.0。

8、进行全外显子组扫描：在IlluminaHuman Exome Beadchip(Illumina Inc., San Diego,CA)芯片上进行全外显子区扫描。

9、数据分析与处理：在“临床原因不明的NOA病例”组和“健康男性对照”组中 发现的基因型分布频率有显著差异的低频高外显性遗传标志物在上文中已经罗列出，结 果见表1。

表1.病例组与对照组全外显子组关联分析结果

实施例3 Sequenom MassARRAY基因分型

将上述全外显子区扫描发现与临床原因不明的NOA发病相关的低频高外显性遗传 标志物在另外1400临床原因不明的NOA病例和1400健康男性对照中进行检测，具体 步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10 分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10 分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml  0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶 K，振荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟， 取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异 戊醇＝24:1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清 (分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无 水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真 空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值) 在1.6-2.0。

8、进行Sequenom MassARRAY基因分型：

1)使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件对全 外显子组扫描发现的32个阳性关联的低频高外显性遗传标志物设计PCR扩增引物及 单碱基延伸引物(表2)。反应体系包括4μl Sequenom MassARRAY基因分型PCR  master mix(Hotstar Taq 0.5U，每条扩增引物0.5pmol，0.1μl的25mM dNTPs、1.9 μl双蒸水)，加入1μl DNA。仪器使用的是Sequenom MassARRAY Nanodispenser， PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃20秒,56℃30秒，72℃1分钟，45个循环； 72℃3分钟；4℃保持。

2)在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱 性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。

3)在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系包括：2μl  EXTEND Mix(单碱基延伸反应液，包括其中各延伸反应引物混合物0.94μl，iPLEX 酶0.041μl,延伸混合物0.2μl)，7μl SAP处理后PCR产物。PCR反应条件：I.94℃ 30秒；II.94℃5秒；III.52℃5秒；IV.80℃5秒；V.重复III、IV 4个循环；VI. 重复II、III、IV、V39个循环；VII.72℃3分钟；VII.4℃保持

4)树脂纯化：

(1)将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；

(2)加16μl水到延伸产物的对应孔内；

(3)将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟,使树脂 与反应物充分接触；

(4)离心使树脂沉入孔底部。

5)芯片点样：启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的 延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上

6)质谱检测：将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted  laser desorption/ionization–time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱) 分析，检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果。

9、数据处理和分析：利用logistic回归模型中的additive模型比较每个低频遗传 标志物的三种基因型在病例组和对照组中分布频率的差异，结果与全外显子扫描类似 不再列出。

实施例4利用危险度评分方法进一步分析低频遗传标志物与临床原因不明的NOA 发病。

根据上述结果，本发明人通过对两组样品(“临床原因不明的NOA病例组”和“健 康男性对照组”)基因型分布频率的比较，选择阳性关联的低频遗传标志物，以全外显 子扫描样本中单个低频遗传标志物回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC 来评估预测的灵敏度和特异性，进而评估这些低频高外显性遗传标志物对临床原因不明 的NOA发病的判断能力。对这32个低频高外显性遗传标志物的联合分析发现，这32 个低频遗传标志物以70.8％的AUC将健康男性对照组和临床原因不明的NOA病例组 分开，最佳临界点的灵敏度为63.4％，特异度为67.9％(图1)。

因此，本发明人证明了采用rs2294228、rs2180233、rs41360247、rs895497、rs6806528、 rs3130785、rs117524265、rs9369640、rs34902660、rs2298090、rs13194053、rs11965377、 rs3893259、rs9261588、rs1264429、rs2523480、rs2524276、rs2255221、rs3135374、rs3892710、 rs9471969、rs76491994、rs113857788、rs61756355、rs180810179、rs10830430、rs34719836、 rs187646949、rs151176313、rs28599881、rs149543099和rs199747280的组合能够很好 地将健康男性对照和临床原因不明的NOA患者区分。

实施例5用于临床原因不明的NOA辅助诊断低频高外显性遗传标志物试剂盒的 制作。

低频高外显性遗传标志物试剂盒的制作和操作流程是基于IlluminaHuman Exome BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片检测和Sequenom  MassARRAY基因分型平台检测技术。试剂盒含有一批低频遗传标志物异性扩增引物(包 括下列引物：rs2294228的扩增引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；rs2180233的 扩增引物序列为SEQ ID No：4和SEQ ID No：5；rs41360247的扩增引物序列为SEQ ID  No：7和SEQ ID No：8；rs895497的扩增引物序列为SEQ ID No：10和SEQ ID No：11； rs6806528的扩增引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；rs3130785的扩增引物序 列为SEQ ID No：16和SEQ ID No：17；rs117524265的扩增引物序列为SEQ ID No：19和 SEQ ID No：20；rs9369640的扩增引物序列为SEQ ID No：22和SEQ ID No：23；rs34902660 的扩增引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；rs2298090的扩增引物序列为SEQ ID  No：28和SEQ ID No：29；rs13194053的扩增引物序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32； rs11965377的扩增引物序列为SEQ ID No：34和SEQ ID No：35；rs3893259的扩增引物序 列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；rs9261588的扩增引物序列为SEQ ID No：40和SEQ  ID No：41；rs1264429的扩增引物序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；rs2523480的 扩增引物序列为SEQ ID No：46和SEQ ID No：47；rs2524276的扩增引物序列为SEQ ID  No：49和SEQ ID No：50；rs2255221的扩增引物序列为SEQ ID No：52和SEQ ID No：53； rs3135374的扩增引物序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；rs3892710的扩增引物序 列为SEQ ID No:58和SEQ ID No:59；rs9471969的扩增引物序列为SEQ ID No:61和SEQ  ID No:62；rs76491994的扩增引物序列为SEQ ID No:64和SEQ ID No:65；rs113857788 的扩增引物序列为SEQ ID No:67和SEQ ID No:68；rs61756355的扩增引物序列为SEQ  ID No:70和SEQ ID No:71；rs180810179的扩增引物序列为SEQ ID No:73和SEQ ID  No:74；rs10830430的扩增引物序列为SEQ ID No:76和SEQ ID No:77；rs34719836的扩 增引物序列为SEQ ID No:79和SEQ ID No:80；rs187646949的扩增引物序列为SEQ ID  No:82和SEQ ID No:83；rs151176313的扩增引物序列为SEQ ID No:85和SEQ ID No:86； rs28599881的扩增引物序列为SEQ ID No:88和SEQ ID No:89；rs149543099的扩增引物 序列为SEQ ID No:91和SEQ ID No:92；rs199747280的扩增引物序列为SEQ ID No:94 和SEQ ID No:95)、和/或特异性延伸引物(包括下列引物：rs2294228的延伸引物序列 为SEQ ID No:3；rs2180233的延伸引物序列为SEQ ID No:6；rs41360247的延伸引物序 列为SEQ ID No:9；rs895497的延伸引物序列为SEQ ID No:12；rs6806528的延伸引物 序列为SEQ ID No:15；rs3130785的延伸引物序列为SEQ ID No:18；rs117524265的延 伸引物序列为SEQ ID No:21；rs9369640的延伸引物序列为SEQ ID No:24；rs34902660 的延伸引物序列为SEQ ID No:27；rs2298090的延伸引物序列为SEQ ID No:30；

rs13194053的延伸引物序列为SEQ ID No:33；rs11965377的延伸引物序列为SEQ ID  No:36；rs3893259的延伸引物序列为SEQ ID No:39；rs9261588的延伸引物序列为SEQ ID  No:42；rs1264429的延伸引物序列为SEQ ID No:45；rs2523480的延伸引物序列为SEQ ID  No:48；rs2524276的延伸引物序列为SEQ ID No:51；rs2255221的延伸引物序列为SEQ ID  No:54；rs3135374的延伸引物序列为SEQ ID No:57；rs3892710的延伸引物序列为SEQ ID  No:60；rs9471969的延伸引物序列为SEQ ID No:63；rs76491994的延伸引物序列为SEQ  ID No:66；rs113857788的延伸引物序列为SEQ ID No:69；rs61756355的延伸引物序列 为SEQ ID No:72；rs180810179的延伸引物序列为SEQ ID No:75；rs10830430的延伸引 物序列为SEQ ID No:78；rs34719836的延伸引物序列为SEQ ID No:81；rs187646949的 延伸引物序列为SEQ ID No:84；rs151176313的延伸引物序列为SEQ ID No:87；

rs28599881的延伸引物序列为SEQ ID No:90；rs149543099的延伸引物序列为SEQ ID  No:93；rs199747280的延伸引物序列为SEQ ID No:96)，还可以有相应PCR技术所需的 常用试剂，如：dNTPs，MgCl₂，双蒸水，Taq酶等，这些常见试剂都是本领域技术人员 熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂 盒的价值在于只需要外周血而不需要其他组织样本，通过最精简和特异的扩增引物及延 伸引物对检测低频高外显性遗传标志物，再通过低频遗传标志物谱辅助诊断临床原因不 明的NOA，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因 此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

表2.相关低频遗传标志物引物

F：Forward Primer，上游引物；R：Reverse Primer，下游引物；E：Extended Primer， 延伸引物。