一种牛血清白蛋白分子表面印迹聚合物微球的制备方法

摘要

本发明提供一种牛血清白蛋白分子表面印迹聚合物微球的制备方法，步骤如下：1.将甲基丙烯酰氯加入含有交联聚乙烯醇微球的丙酮溶液中，形成改性微球；2.在中性水溶液中，凭借强烈的静电相互作用，将丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵与牛血清白蛋白分子结合，形成主-客体复合物；3.使甲基丙烯酸酯改性微球、主-客体复合物、交联剂N,N′-亚甲基双丙烯酰胺、引发剂发生交联共聚合反应，实现牛血清白蛋白分子的表面印迹；4.将印迹微球用氯化钠反复冲洗后，再用蒸馏水冲洗，得到表面留有大量模板分子印迹空穴的牛血清白蛋白分子表面印迹微球；本发明以模板蛋白-功能单体之间的静电相互作用为基础，实施蛋白质的印迹；本发明为发展蛋白质分子印迹技术提供了新的分子设计思路，在蛋白质分离与纯化领域将具有积极的参考价值。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质工程和功能高分子技术领域，涉及一种具有识别选择生物大分子特性的分子表面印迹聚合物微球的制备，具体是一种牛血清白蛋白分子表面印迹聚合物微球的制备方法。

背景技术

分子印迹聚合物（MIPs）是被精心裁制的（Well-tailored）一类功能聚合物材料，其内部分布有大量模板分子的印迹空穴，这些空穴在尺寸大小、空间结构、结合位点等方面与模板分子高度地相互匹配，使得分子印迹聚合物可在分子水平上对模板分子进行特异性识别，具有类似于抗体-抗原之间识别与结合的专一性，因此被人们称为人工抗体（Artificial antibody）或人工接受器 （Artificial acceptor）。在蛋白质等生物大分子的识别、分离与纯化方面，分子印迹技术也具有潜在的、重要的应用前景，生物大分子分子印迹技术的发展，对于促进蛋白质组学、重组蛋白技术及免疫学等生命科学学科的发展都具有十分重要的科学意义。但是，由于蛋白质大分子结构复杂、体积庞大及构象敏感脆弱，目前关于蛋白质的印迹，无论在理论上还是实践上尚存在诸多困难，极大地限制了蛋白质分子印迹技术的发展。因此，蛋白质分子印迹是一个极具挑战性的研究领域。

目前在蛋白质印迹方面，明显存在几个问题：（1）传统的包埋印迹法不适合蛋白质的印迹。在高度交联的块状聚合物网络中，蛋白质大分子移动性差，导致低的印迹效率与差的结合性能，且印迹分子不易洗脱[Kryscio D R, Peppas N A. Critical review and perspective of macromolecularly imprinted polymers, Acta Biomaterialia, 2012, 8: 461–473]；（2）溶剂的选择受限制。在有机溶剂中，虽然模板蛋白分子与单体之间的氢键相互作用（至今，多数蛋白质分子印迹主要靠模板分子-功能单体之间的氢键相互作用）不受干扰，有利于印迹过程，但大多数蛋白质在有机溶剂中稳定性和溶解性都比较差[Bossi A, Bonini F, Turner A P F, Piletsky S A. Molecularly imprinted polymers for the recognition of proteins: The state of the art, Biosensors and Bioelectronics, 2007, 22: 1131–1137]；若以水为溶剂，虽然蛋白质溶于水，但模板蛋白-单体之间的氢键相互作用会遭受水分子的竞争与破坏，不利于印迹过程；（3）单体单一，选择范围小 [Verheyen E, Schillemans J P, Wijk M van, Demeniex M-A, Hennink W E, Nostrum C F van. Challenges for the effective molecular imprinting of proteins, Biomaterials, 2011, 32: 3008–3020]。如上所述，氢键相互作用仍是目前蛋白质印迹的主要作用力基础，故所使用的单体多局限于丙烯酰胺与丙烯酸类单体，印迹效果受到影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛血清白蛋白分子表面印迹聚合物微球的制备方法，选用阳离子单体丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵为功能单体，在充分研究水介质中主-客体之间的强静电相互作用的基础上，采用表面印迹方法，实施牛血清白蛋白分子的表面印迹，制备牛血清白蛋白分子表面印迹材料。

白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白，具有储运内源性代谢产物和外源性药物分子等重要生理功能，参与许多重要的生命过程。牛血清白蛋白的等电点为4.7，在中性水溶液中，白蛋白为负离子，每分子可以带有200个以上负电荷。 鉴于白蛋白的上述物理化学特性，通过科学的分子设计与策划，制定有效的制备策略与途径：（1）用表面印迹法代替包埋印迹法；（2）除氢键相互作用外，策划以模板蛋白-功能单体之间的静电相互作用为基础，在水介质中实施蛋白质的印迹。

本发明所采用的技术方案是：一种牛血清白蛋白分子表面印迹聚合物微球的制备方法，包括如下的步骤：

步骤一，将甲基丙烯酰氯和少量缚酸剂碳酸钠加入含有交联聚乙烯醇微球的丙酮溶液中，将大量可聚合双键引入微球表面，形成键合有大量甲基丙烯酸酯基团的改性微球；

步骤二，在中性水溶液中，将丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵与牛血清白蛋白结合混合搅拌形成主-客体复合物；

步骤三，将键合有大量甲基丙烯酸酯基团的改性微球加入至主-客体复合物中，再加入N,N′-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气排除空气后加入引发剂发生交联共聚合反应，实现牛血清白蛋白分子的表面印迹，形成牛血清白蛋白分子表面印迹微球；

步骤四，将牛血清白蛋白分子表面印迹微球用洗脱液反复冲洗后，再用蒸馏水冲洗，然后用真空烘箱干燥至恒重，得到表面留有大量模板分子印迹空穴的牛血清白蛋白分子表面印迹微球。

所述步骤一中含有交联聚乙烯醇微球的丙酮溶液中交联聚乙烯醇微球的含量为3~8%；加入的所述甲基丙烯酰氯的含量为丙酮溶液的3~10%，反应温度为25~50℃，反应时间为5~10h；

所述步骤二中丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵与牛血清白蛋白的摩尔比为100：1~500：1；

所述步骤三中加入的键合有大量甲基丙烯酸酯基团的改性微球的量为所述主-客体复合物的0.5~5%，所述N,N′-亚甲基双丙烯酰胺的加入量为主-客体混合物的0.1~0.5%，所述引发剂为过硫酸铵和亚硫酸氢钠，所述过硫酸铵的加入量为主-客体复合物的0.05~0.1%，所述亚硫酸氢钠的加入量为主-客体复合物的0.02~0.05%，反应温度为25~50℃，反应时间为10~15h。

所述步骤四中所述洗脱液为氯化钠溶液，所述氯化钠溶液的浓度为1~4mol/L。

本发明选择牛血清白蛋白为模型蛋白，探索研究蛋白质分子印迹新技术，其创新之处在于：（1）以模板蛋白-功能单体之间的静电相互作用为基础，在水介质中实施蛋白质的印迹，这样既扩展单体的选择范围，又能提高印迹效果，而且有效提高了蛋白质的移动性、溶解性和稳定性；（2）采用接枝聚合与印迹过程同步进行的方式在交联微球表面实现了单体的接枝聚合与蛋白质模板分子的分子表面印迹，这样既提高了蛋白质的印迹效率（吸附选择性）与结合性能（识别选择性），又使得印迹分子容易洗脱。

本发明的研究结果为发展蛋白质分子印迹技术提供了新的分子设计思路，在蛋白质分离与纯化领域将具有积极的参考价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的阐述：

一种牛血清白蛋白分子表面印迹聚合物微球的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，将3~8%的交联聚乙烯醇微球浸泡于丙酮溶液中使之充分溶胀，再加入3~10 %的甲基丙烯酰氯以及少量缚酸剂碳酸钠， 25~50℃恒温反应5~10h，制得表面键合有大量甲基丙烯酸酯基团的改性微球；

步骤二，在中性水溶液中，凭借强烈的静电相互作用，众多阳离子单体丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵自动地结合牛血清白蛋白大分子周围：即在中性的磷酸盐缓冲液中，加入0.5~5%的丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵，按照丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵与牛血清白蛋白的摩尔比为100：1~500：1加入牛血清白蛋白，搅拌使它们相互作用一段时间后，形成主-客体复合物；

步骤三，将所述主-客体复合物移入装有回流冷凝管、搅拌器与温度计的四口烧瓶中；加入0.5~5%的改性微球，浸泡一段时间，再加入0.1~0.5%的N,N′-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气30min，排除体系中的空气；将体系升温至25~50℃，在氮气保护并在搅拌条件下加入0.05~0.1%的过硫酸铵和0.02~0.05%的亚硫酸氢钠，使表面发生接枝交联共聚合反应，反应进行10~15h，实现牛血清白蛋白分子的表面印迹微球。

步骤四，将步骤三所得的牛血清白蛋白分子的表面印迹微球滤出，用1~4mol/L氯化钠溶液充分洗脱，直至在洗脱液中检测不到牛血清白蛋白分子为止，然后用蒸馏水反复洗涤，真空干燥即得表面留有大量模板分子印迹空穴牛血清白蛋白分子表面印迹微球。

实施例1

将2 g交联聚乙烯醇微球浸泡于40 mL的丙酮溶液中使之充分溶胀，再加入2 mL的甲基丙烯酰氯及少量缚酸剂碳酸钠，40℃恒温反应10 h，制得改性微球。

将3.1 g模板分子牛血清白蛋白溶解于95 mL pH=7.4 的 磷酸盐缓冲液中，加入5 mL单体丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵，使它们相互作用一段时间后，将溶液移入装有回流冷凝管、搅拌器与温度计的四口烧瓶中；加入1 g改性微球，浸泡12 h，再加入0.16 g交联剂N,N′-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气30min，排除体系中的空气；将体系升温至35℃，在氮气保护并在搅拌条件下加入0.058 g过硫酸铵和0.029 g亚硫酸氢钠，使表面接枝交联反应进行12 h；反应结束后，将微球滤出，用2mol/L氯化钠溶液充分洗脱，直至在洗脱液中检测不到牛血清白蛋白分子为止，然后用蒸馏水反复洗涤，真空干燥即得牛血清白蛋白分子表面印迹微球。

实施例2

将4 g 交联聚乙烯醇微球浸泡于50 mL的丙酮溶液中使之充分溶胀，再加入5 mL的甲基丙烯酰氯及少量缚酸剂碳酸钠，50℃恒温反应5 h，制得改性微球。

将1.8 g模板分子牛血清白蛋白溶解于95 mL pH=7.4 的 磷酸盐缓冲液中，加入5 mL单体丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵，使它们相互作用一段时间后，将溶液移入装有回流冷凝管、搅拌器与温度计的四口烧瓶中；加入3g改性微球，浸泡12 h，再加入0.1g交联剂N,N′-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气30min，排除体系中的空气；将体系升温至25℃，在氮气保护并在搅拌条件下加入0.072 g过硫酸铵和0.039 g亚硫酸氢钠，使表面接枝交联反应进行10 h；反应结束后，将微球滤出，用1mol/L氯化钠溶液充分洗脱，直至在洗脱液中检测不到牛血清白蛋白分子为止，然后用蒸馏水反复洗涤，真空干燥即得牛血清白蛋白分子表面印迹微球。

实施例3

将1 g 交联聚乙烯醇微球浸泡于50 mL的丙酮溶液中使之充分溶胀，再加入5 mL的甲基丙烯酰氯及少量缚酸剂碳酸钠，30℃恒温反应8 h，制得改性微球。

将5 g模板分子牛血清白蛋白溶解于95 mL pH=7.4 的磷酸盐缓冲液中，加入10 mL单体丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵，使它们相互作用一段时间后，将溶液移入装有回流冷凝管、搅拌器与温度计的四口烧瓶中；加入5g改性微球，浸泡12 h，再加入0.48g交联剂N,N′-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气30min，排除体系中的空气；将体系升温至50℃，在氮气保护并在搅拌条件下加入0.098g过硫酸铵和0.045 g亚硫酸氢钠，使表面接枝交联反应进行15 h；反应结束后，将微球滤出，用4mol/L氯化钠溶液充分洗脱，直至在洗脱液中检测不到牛血清白蛋白分子为止，然后用蒸馏水反复洗涤，真空干燥即得牛血清白蛋白分子表面印迹微球。

实施例4

选择吸附性能的研究

将20 mL浓度不同的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液分别置于若干个50 mL的具塞锥形瓶中，加入准确称取的按照实施例1-3制备的质量为0.03g的印迹微球，于25℃恒温振荡10h，离心分离，测得上清液中牛血清白蛋白的饱和结合量为108mg/g，依同样的方法测得按照实施例1-3制备牛血清白蛋白分子表面印迹微球对溶菌酶的饱和结合量为0.03mg/g、牛血红蛋白的饱和结合量为0.67mg/g，说明牛血清白蛋白分子表面印迹微球对溶菌酶和牛血红蛋白没有吸附性，而对牛血清白蛋白分子具有很高的吸附选择性。

实施例5

识别选择性能的研究

用pH=7.4磷酸盐缓冲溶液配制浓度均为16.0 μmmol/L 牛血清白蛋白和牛血红蛋白的二元混合液，取20 mL混合溶液于具塞锥形瓶中，加入准确称量的按照实施示例1-3制备的质量为0.03g的牛血清白蛋白分子表面印迹微球，在25 ℃恒温振荡器中振荡10 h使结合达到平衡，离心分离，印迹微球对牛血清白蛋白的选择性系数为60.22，对牛血红蛋白的选择性系数为1.485，表明牛血清白蛋白分子表面印迹微球对牛血清白蛋白具有特异的识别选择性。