一种飞秒激光双光子荧光生物显微成像系统及其成像方法

摘要

一种飞秒激光双光子荧光生物显微成像系统及其成像方法，本发明涉及飞秒激光双光子荧光生物显微成像系统及其成像方法。本发明的目的是为了解决目前双光子荧光显微镜成本昂贵、成像速度无法满足需求。外界环境的影响容易导致飞秒激光器失锁，而激光器失锁后无法激励样品产生双光子荧光信号。双光子荧光显微成像是对样品特定成分进行成像，不能对样品进行完整成像。一种飞秒激光双光子荧光生物显微成像系统，其特征在于：所述系统包括：可调谐飞秒激光源Tsunami(1)、生物显微镜(2)、光谱仪(3)、光电倍增管(4)、光电二极管(5)、数据采集卡(6)、电动平移台(7)、电动平移台控制器(8)、计算机(9)和分束片(10)；所述生物显微镜(2)包括反射镜M1(11)、反射镜M2(12)、二向色镜(13)、发射滤波片(14)、物镜(15)和聚光器(16)。本发明应用于荧光显微成像领域。

说明书

技术领域

本发明涉及飞秒激光双光子荧光生物显微成像系统及其成像方法。

背景技术

荧光是某些物质受一定波长的光激发后在极短时间内发射出波长大于激发波长的一 种发光现象。十九世纪中期，英国科学家G.Stokes利用紫外光照射萤石矿物第一次观察 到了荧光现象，但是直到二十世纪三十年代，奥地利科学家M.Haitinger等人才将荧光标 记技术引入到生命科学领域，他们使用荧光染料对细菌病毒等特定成分进行标记，推动了 荧光显微镜的发展。

荧光显微镜的基本工作原理就是利用光照射有荧光物质标记的样品，产生的荧光信号 通过滤波片与激励信号分开后被探测器采集，染料标记区域就会被分辨出来。由于普通荧 光显微镜使用的汞灯光源发射的主要是短波长的紫外光，使得成像的分辨率大大提高。但 是当我们观察较厚样品时，样品的不同层次深度上均有被标记的结构，而且相互堆叠起来， 普通荧光显微镜的光源会同时激发样品在焦点附近的较大一片区域，导致焦点上下的散射 光也会被收集，降低了分辨率。除此之外，荧光显微镜受到衍射极限的限制，其分辨率很 难达到1μm以下。

20世纪80年代后期，作为目前世界上非常先进的生物学荧光成像技术，共聚焦荧光 显微成像技术在生物材料的荧光显微成像领域得到了广泛应用。相比于传统的荧光显微 镜，它的技术有以下改进：首先，采用方向性和单色性良好的激光作为光源消除了色差的 影响；其次，共聚焦技术中小孔的存在挡住了焦点以外的杂散光，提高了信噪比；最后， 逐点逐行扫描只会激发焦平面内极小区域的荧光，避免了标本上相邻点的衍射光和散射光 的干扰，大大提高了图像的清晰度和精密度。

共聚焦荧光显微成像技术如图1所示，装置包括激光光源(1)、样品(2)、探测器 (3)、物镜(4)、焦点(5)、二向色镜(6)和共焦小孔(7)，以光学系统的共焦成 像为基础，激光光源(1)、样品(2)和探测器(3)处于彼此共轭的位置。光源经物镜 (4)在样品(2)内聚焦成衍射极限的光点，样品发射的荧光被物镜(4)汇聚到达共焦 小孔(7)内，被靠近共焦小孔(7)的探测器(3)接收。激光通过对样品进行的扫描而 对物体进行成像。然而共焦小孔(5)不仅挡住了焦点(5)以外产生的荧光，还挡住了焦 点(5)产生的被生物组织散射的荧光，导致荧光的收集效率下降。

双光子荧光显微成像技术如图2所示，装置包括激光光源(1)、样品(2)、探测器 (3)、物镜(4)、焦点(5)和二向色镜(6)，与共聚焦荧光显微成像技术不同的是， 双光子荧光显微成像技术利用近红外的飞秒激光作为光源而非利用紫外光源。而且双光子 吸收的非线性本质使得双光子荧光显微成像技术无需共焦小孔的加入，与传统的单光子激 光共聚焦显微镜相比，双光子荧光显微成像技术具有以下几个优点：①荧光收集率高：双 光子显微成像无需共焦小孔的加入，因此荧光收集效率大大提高；②光损伤小：双光子荧 光显微镜的激励源使用可见光或者近红外光，它们对生物活体组织的光损伤小，因此可以 对样品进行长时间的科学研究；③空间分辨率和对比度高：由于在双光子显微成像中，荧 光只有在焦平面很小的区域内产生，焦点外无荧光产生，背景荧光影响小；④光漂白区很 小：焦点外不发生漂白现象。⑤成像深度大：可见光或近红外光比紫外光的穿透性强，一 般情况下，共聚焦荧光显微成像技术的成像深度只能达到50μm左右，而双光子显微成像 技术的成像深度可达1600μm；⑥对探测光路的要求低：对于双光子显微成像而言，发射 荧光的波长值与激发光相差很大，因此对探测收集系统的要求比单光子共焦显微镜低；⑦ 适合多标记复合成像：由于很多染料荧光探针的双光子激发光谱比较宽，多种探针可以同 时被单一波长的激发光激发，进而得到同一样品的不同信息。

虽然商业化的双光子荧光显微镜已经问世，但是其成本昂贵、成像速度无法满足需求。 外界环境的影响很容易导致飞秒激光器失锁，而激光器失锁后无法激励样品产生双光子荧 光信号。双光子荧光显微成像是对样品特定成分进行成像，不能对样品进行完整成像。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前双光子荧光显微镜成本昂贵、成像速度无法满足需求。 外界环境的影响容易导致飞秒激光器失锁，而激光器失锁后无法激励样品产生双光子荧光 信号。双光子荧光显微成像是对样品特定成分进行成像，不能对样品进行完整成像。而提 出了一种飞秒激光双光子荧光生物显微成像系统及其成像方法。

上述的发明目的是通过以下技术方案实现的：

一种飞秒激光双光子荧光生物显微成像系统，其特征在于：所述系统包括：可调谐飞 秒激光源Tsunami(1)、生物显微镜(2)、光谱仪(3)、光电倍增管(4)、光电二极管(5)、 数据采集卡(6)、电动平移台(7)、电动平移台控制器(8)、计算机(9)和分束片(10)； 所述生物显微镜(2)包括反射镜M1(11)、反射镜M2(12)、二向色镜(13)、发射滤 波片(14)、物镜(15)和聚光器(16)；

所述可调谐飞秒激光源Tsunami(1)产生的激光经过分束片(10)对激光进行分束， 分别进入生物显微镜(2)和光谱仪(3)，光谱仪(3)用于监控可调谐飞秒激光源Tsunami (1)的工作状态，激光进入生物显微镜(2)经反射镜M1(11)反射进入二向色镜(13)， 通过物镜(15)打到电动平移台(7)上的样品，然后一部分激光穿过样品，经聚光器(16) 聚焦，反射镜M2(12)反射，进入光电二极管(5)采集透射信号，把透射信号转换为 电信号；另一部分激光返回物镜(15)，通过二向色镜(13)，经发射虑波片(14)滤除杂 波，进入光电倍增管(4)采集荧光信号，把荧光信号转换为电信号；光电倍增管(4)和 光电二极管(5)的数据传入数据采集卡(6)，数据采集卡(6)的数据传入计算机(9)， 计算机(9)通过电动平移台控制器(8)控制电动平移台(7)移动，电动平移台(7)位 于聚光器(16)和物镜(15)间，由两个表面平坦且相互正交垂直的X轴平移台和Y轴 平移台组成；计算机控制电动平移台以完成成像。

一种权利要求1所述飞秒激光双光子荧光生物显微成像系统的成像方法，其特征在 于：一种飞秒激光双光子荧光生物显微成像系统的成像方法包括如下步骤：

步骤一、将可调谐飞秒激光源Tsunami发出的激光进行分束：一束激光通过多模光纤 与光谱仪连接，从而监控可调谐飞秒激光源Tsunami的工作状态；另一束激光与生物显微 镜连接，用来激励样品；

步骤二、光束经过生物显微镜的物镜后，光束分为前向透射光和后向出射光；

步骤三、前向透射光经过聚光器的收集后进入光电二极管，光电二极管输出的信号由 数据采集卡进行采集；

步骤四、后向出射光被物镜收集后，通过二向色镜将激光与荧光分开，经发射滤波片 后，进入光电倍增管进行探测采集荧光，光电倍增管输出的信号由数据采集卡进行采集；

步骤五、将数据采集卡采集的信息传输到计算机进行双光子荧光显微成像；

步骤六、计算机控制电动平移台以完成成像。

发明效果

采用本发明的双光子荧光显微成像系统的成像方法，可以充分利用已有的仪器设备， 而且许多实验器材均为自行组装制作而成，而非购买昂贵的商业化产品，因此自行搭建的 双光子荧光显微成像系统的成本相对低廉，而且还可以根据自己需求搭建系统。例如，加 入多个二向色镜实现了多通道复合成像，还可以通过选择不同的扫描振镜获得不同的成像 速度。

一般情况下，我们很容易通过输出光谱的信息判断激光器的工作状态。图4为激光器 在锁模和失锁状态下的输出脉冲的光谱信息，从中可以看出，失锁时输出为一个尖峰信号， 与锁模状态下的光谱形状相差较大。因此在实验过程中利用光谱仪监测激光器的输出光谱 信息就可以判断激光器的锁模状态。

同时，本发明采用透射成像的原理进行显微成像，透射显微成像就是利用样品的不同 位置对通过物镜的光的透过率不同而进行的显微成像。通常入射光被聚焦到样品上从而使 得入射光强最大，然后光通过物镜并被目镜收集，眼睛透过目镜便可以看到样品被放大的 透射像。透射成像可以对样品进行完整成像，因此，透射显微成像不仅可以检验双光子荧 光显微成像的正确性，还对双光子荧光显微成像信息进行了补充。

在进行双光子荧光显微成像时，实验采用UPLSAPO40X2万能平场复消色差物镜， 其放大倍数为×40，数值孔径为0.95，滤波片为带通滤波片BP580-70k和红外截止滤波片， 将扫描间隔设置为10μm，扫描范围为1×1mm2，得到像素为100×100图像，如图5，激 光进入显微镜前功率为45mW，从图中可以明显看出Rhodamine B染料的痕迹。

对于透射显微成像技术，由于光电二极管的增益较大，而数据采集卡的输入范围是 +-5v，激光进入显微镜前功率为40μW，其它参数与双光子荧光显微成像设置一致，成像 大小1×1mm2，像素为100×100，如图6双光子荧光显微成像和透射成像位置相对应，证 明了本发明搭建的双光子荧光显微成像系统的正确性；如图7和图8所示，双光子荧光显 微成像和透射成像位置相对应，证明了本发明搭建的双光子荧光生物显微成像系统的正确 性。

附图说明

图1是共聚焦显微成像技术原理图；

图2是双光子荧光显微成像技术原理图；

图3是本发明成像系统装置示意图；

图4是可调谐飞秒激光源Tsunami在失锁和锁模状态下的输出光谱，失锁状态用细线 表示，锁模状态用粗线表示；

图5是本发明实施例一Rhodamine B样品的双光子荧光显微成像；

图6是本发明实施例一Rhodamine B样品的透射成像；

图7是本发明实施例二双光子荧光显微成像；

图8是本发明实施例二透射成像。

具体实施方式

具体实施方式一：结合图3说明本实施方式，一种飞秒激光双光子荧光生物显微成像 系统，其特征在于：所述系统包括：可调谐飞秒激光源Tsunami(1)、生物显微镜(2)、 光谱仪(3)、光电倍增管(4)、光电二极管(5)、数据采集卡(6)、电动平移台(7)、电 动平移台控制器(8)、计算机(9)和分束片(10)；所述生物显微镜(2)包括反射镜 M1(11)、反射镜M2(12)、二向色镜(13)、发射滤波片(14)、物镜(15)和聚光器(16)；

所述可调谐飞秒激光源Tsunami(1)产生的激光经过分束片(10)对激光进行分束， 分别进入生物显微镜(2)和光谱仪(3)，光谱仪(3)用于监控可调谐飞秒激光源Tsunami (1)的工作状态，激光进入生物显微镜(2)经反射镜M1(11)反射进入二向色镜(13)， 通过物镜(15)打到电动平移台(7)上的样品，然后一部分激光穿过样品，经聚光器(16) 聚焦，反射镜M2(12)反射，进入光电二极管(5)采集透射信号，把透射信号转换为 电信号；另一部分激光返回物镜(15)，通过二向色镜(13)，经发射虑波片(14)滤除杂 波，进入光电倍增管(4)采集荧光信号，把荧光信号转换为电信号；光电倍增管(4)和 光电二极管(5)的数据传入数据采集卡(6)，数据采集卡(6)的数据传入计算机(9)， 计算机(9)通过电动平移台控制器(8)控制电动平移台(7)移动，电动平移台(7)位 于聚光器(16)和物镜(15)间，由两个表面平坦且相互正交垂直的X轴平移台和Y轴 平移台组成；计算机控制电动平移台以完成成像。

所述可调谐飞秒激光源Tsunami为美国光谱物理公司(Spectra-Physics)所生产的掺 钛蓝宝石固体激光器系统Tsunami，为中心波长800nm，重频82MHz，脉宽约50fs的超 短脉冲锁模激光；

所述二向色镜用于反射激光，透射荧光；由美国Chroma公司生产，型号为680dcspxr；

所述发射滤波片由红外截止滤波和带通滤波片构成；带通滤波片是兆九光电公司的 产品BP580/70K和BP450/100k。红外截止滤波片为Chroma公司的NC212066-ET670sp 型产品；

所述光谱仪是美国海洋光学公司(Ocean Optics)的HR400光纤光谱仪；

所述光电倍增管是日本滨松公司(Hamamatsu)生产的R3896型；

所述光电二极管为PIN型光电二极管；

所述数据采集卡为研华公司生产的PCI-1714型数据采集卡。

所述电动平移台为英国prior公司的H117P2IX型电动平移台。

所述电动平移台控制器用于电动平移台的手动和外部驱动控制；为H31XYZE型控制 器。用于H117P2IX型电动平移台的手动和外部驱动控制。

所述计算机利用电动平移台控制器控制电动平移台移动；同时接收数据采集卡传来的 数据，进行成像。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述发射滤波片(14)由 带通滤波片和红外截止滤波片构成，带通滤波片位于靠近二向色镜(13)的一侧，红外截 止滤波片位于靠近光电倍增管(4)的一侧。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述可调谐飞秒激光 源Tsunami产生的激光是中心波长为800nm、重频为82MHz、脉宽为50fs的超短脉冲锁 模激光。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一、二或三不同的是：所述可调谐飞秒 激光源Tsunami(1)水平射出，分束片(10)轴向竖直放置，与可调谐飞秒激光源Tsunami (1)同轴设置，表面与光线成45°；反射镜M1(11)、反射镜M2(12)、电动平移台(7)、 物镜(15)和聚光器(16)同轴设置，与可调谐飞秒激光源Tsunami(1)水平射出和分 束片(10)垂直设置，反射镜M1(11)、反射镜M2(12)轴向与地面成45°放置，表面 与光线成45°；二向色镜(13)轴向与地面成45°放置，表面与光线成45°；物镜(15) 和聚光器(16)同轴竖直放置；电动平移台(7)与地面成水平放置；发射滤波片(14) 轴向竖直放置，表面与光线成90°；光线水平射入光电倍增管(4)、光电二极管(5)。

具体实施方式五：一种权利要求1所述飞秒激光双光子荧光生物显微成像系统的成像 方法，其特征在于：一种飞秒激光双光子荧光生物显微成像系统的成像方法包括如下步骤：

步骤一、将可调谐飞秒激光源Tsunami发出的激光进行分束：一束激光通过多模光纤 与光谱仪连接，从而监控可调谐飞秒激光源Tsunami的工作状态；另一束激光与生物显微 镜连接，用来激励样品；

步骤二、光束经过生物显微镜的物镜后，光束分为前向透射光和后向出射光；

步骤三、前向透射光经过聚光器的收集后进入光电二极管，光电二极管输出的信号由 数据采集卡进行采集；

步骤四、后向出射光被物镜收集后，通过二向色镜将激光与荧光分开，经发射滤波片 后，进入光电倍增管进行探测采集荧光，光电倍增管输出的信号由数据采集卡进行采集；

步骤五、将数据采集卡采集的信息传输到计算机进行双光子荧光显微成像；

步骤六、计算机控制电动平移台以完成成像。

所述生物显微镜为奥林巴斯研究级倒置显微镜IX71。

光电二极管是一种PIN硅光电二极管，由于可调谐飞秒激光器输出激光的中心波长 在800nm，而DET10A在800nm有很好的响应灵敏度，因此DET10A可以用于对透射光 进行探测。

二向色镜将入射激光透射至物镜，同时确保产生的荧光信号能够通过反射到达探测 器，因此二向色镜的透过率对双光子荧光的收集效率影响很大；该二向色镜对小于700nm 波长的光透过率极低，但是对高于720nm波长的光透过率高于90％，可以使大部分激光 透过到达待测样品。使用的二向色镜为美国Semrock公司生产的FF705-Di01-25x36型产 品；

发射滤波片由带通滤波片和红外截止滤波片构成，带通滤波片用于对Rhodamine B 和DAPI染料的研究，红外截止滤波片可以滤除400nm-660nm外的杂散光。光电倍增管 (Photomultiplier Tube，PMT)是一种基于光电子发射效应、二次电子发射和电子光学理论 把微弱入射光转换成电子同时获得倍增效果的重要真空发射器件，使用的光电探测仪器是 由日本滨松公司生产的R3896型光电倍增管，其具有较高的量子效率和阳极灵敏度。

数据采集卡是研华公司生产的PCI-1714型数据采集卡，它是一款基于32位PCI总线 架构的高性能数据采集卡，采样速度可达30MHz/秒，到主机内存的A/D采样具有连续不 间断、高速和流式数据的特点；将包含前向后向出射光的信息送入计算机，进行处理后得 到成像信息；

计算机通过电动平移台控制器对电动平移台进行外部驱动操作，电动平移台通过控制 电动平移台沿X、Y轴的平移，改变激光照射电动平移台上样品的位置以完成图像采集。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是：所述步骤一中将实验样品 放于显微镜的电动平移台上，光束经过显微镜的物镜照射在电动平移台上，从而完成对样 品的激励操作。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例一：

采用本发明构建的实验系统对Rhodamine B样品进行双光子荧光显微成像。 Rhodamine B样品制备步骤如下：首先，称取4mg的Rhodamine B粉末置于试管中；其 次，用移液器移取5ml的蒸馏水至装有粉末样品的试管中；最后，用磁力搅拌机搅拌均 匀，得Rhodamine B溶液。将Rhodamine B溶液随意滴在载玻片上，等待风干后，制备 成待测样品，利用已搭建好的显微成像系统进行双光子荧光显微成像和透射成像研究。在 进行双光子荧光显微成像时，实验采用UPLSAPO40X2万能平场复消色差物镜，其放大 倍数为×40，数值孔径为0.95，滤波片为带通滤波片BP580-70k和红外截止滤波片，将扫 描间隔设置为10μm，扫描范围为1×1mm2，得到像素为100×100图像，其结果如图5所 示。为了避免漂白现象，激光进入显微镜前功率为45mW，从图中可以明显看出Rhodamine B染料的痕迹。

对于透射显微成像技术，由于光电二极管的增益较大，而数据采集卡的输入范围是 +-5v，激光进入显微镜前功率为40μW，其它参数与双光子荧光显微成像设置一致，成像 大小1×1mm2，像素为100×100，其成像结果如图6所示，由对比可知，双光子荧光显微 成像和透射成像位置相对应，证明了本发明搭建的双光子荧光生物显微成像系统的正确 性。

实施例二：

Rhodamine B也常常用于细胞和生物组织的染色，实验中我们对染有Rhodamine B的 Hela细胞进行双光子荧光显微成像，其样品制备过程如下：

(a)制备Rhodamine B储存液：将0.5mg Rhodamine B溶解到1mL PBS缓冲液中，充 分搅匀后，制备成Rhodamine B储存液。并置于4℃的温度下保存；

(b)染色：将DAPI储存液稀释1000倍后加入培养基中，与Hela细胞在37℃共同孵 育过夜；

(c)漂洗：用PBS缓冲液对细胞进行漂洗，至少漂洗6次从而将未结合的Rhodamine B洗掉；

(d)制备细胞悬液：用酶消化后离心得到细胞，将其加入培养基制成细胞悬液；

(e)封片：取少量细胞悬液于载玻片上，盖上盖玻片后封片。

在对染有Rhodamine B染料的细胞进行成像时，采用UPLSAPO40X2万能平场复消 色差物镜，其放大倍数为×40，数值孔径为0.95，飞秒激光中心波长800nm，带宽50nm， 入射到显微镜之前的激光功率为60mw，利用BP580-70K型带通滤波片。其成像结果如 图7和图8所示。由对比可知，双光子荧光显微成像和透射成像位置相对应，证明了本发 明搭建的双光子荧光生物显微成像系统的正确性。