一种Bouchardatine和Bouchardatine衍生物及其制备方法和应用

摘要

一种Bouchardatine和Bouchardatine衍生物在制备抗肥胖症和减轻脂肪肝生成的药物中的应用；所述Bouchardatine和Bouchardatine衍生物结构式如式(I)所示：

说明书

技术领域

本发明涉及Bouchardatine技术领域，更具体地，涉及一种Bouchardatine和 Bouchardatine衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

肥胖症，作为一类新陈代谢类疾病，与多种其它的代谢类疾病的发生发展存 在密切联系，如2型糖尿病、动脉粥样硬化、高血压等。研究表明，肥胖症的形 成，是由于机体外源性能量摄入超过机体能量消耗，富余的能量以甘油三酯的形 式进行储存，介导机体代谢紊乱的过程。目前，世界卫生组织对肥胖的判定均是 基于身体质量指数(Body Mass Index，BMI)，即BMI≥30kg/m²时则定义为肥 胖。随着全球经济的发展，肥胖症及其并发症已成为严重影响人类健康的世界性 公共卫生问题。

据世界卫生健康组织统计，2011年全世界肥胖人口比率达30％，其中青少 年(18岁以下)人口数目达12亿，约占10％；2012年，青少年肥胖人口数则增 至15亿；2013年，该项数值则升至17亿。而在中国，近十年来我国肥胖人口 的增长速率等同于欧美等国家过去30年的增长速率。在世界肥胖人口数目逐渐 增多的情况下，针对肥胖症的有效治疗药物研发则相对滞后。目前世界范围内可 供选择的抗肥胖症药物很少。目前临床应用的主要有去甲肾上腺素再摄取抑制剂 盐酸芬特明/盐酸芬特明-托吡酯复方胶囊剂，脂酶抑制剂奥利司他，以及中枢神 经类药物盐酸劳卡色林等。上述药物在使用过程中，抗肥胖效果有限，副作用明 显，限制了抗肥胖药物的使用。因此，研究开发药效更好，安全性更高的抗肥胖 药物已成为目前研究热点之一。

研究表明，肥胖症的形成主要是由于脂肪的过度形成以及脂肪氧化消耗能力 减弱所致。脂肪的形成主要是两方面因素共同作用的结果：1)多能/单能干细胞 在特定生长因子的诱导下定向分化形成脂肪细胞；2)脂肪细胞内甘油三酯不断 累积，形成成熟的脂肪细胞。因此，抑制脂肪细胞分化或促进脂肪氧化消耗，从 而减少脂质累积，是发展抗肥胖症药物的基本策略。

天然产物Bouchardatine作为一类β-吲哚喹唑啉酮生物碱，其结构为喹唑啉 酮的2-位与吲哚的2-位相连构成。Bouchardatine从Bouchardatia neurococca分离 得到，现代研究表明，Bouchardatine具有抗癌、抗病毒、抗结核等多种生物活性， 但未见其在抗肥胖症及减轻脂肪肝中的应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种Bouchardatine和 Bouchardatine衍生物。

本发明还提供了上述Bouchardatine和Bouchardatine衍生物的制备方法以及 应用，本发明所述的Bouchardatine和Bouchardatine衍生物具有抗肥胖效果好、 毒性小、能够减少细胞内脂质累积、降低动物细胞甘油三酯水平等优点，在制备 预防和治疗与抗肥胖症及减轻脂肪肝相关疾病的药物上有广阔的应用空间。

发明人发现，天然产物Bouchardatine具有一定的抑制脂肪细胞分化和蓄积 的活性，是一个具有潜在发展前景的抗肥胖症药物先导结构。发明人在 Bouchardatine结构基础上进行了修饰和优化研究。主要是从5号位引入具有链状 结构特点的胺基，目的是提高目标化合物与作用靶点的相互作用能力和对相关通 路的化学干预效果，改善化合物的水溶性和生物利用度等成药性质。

本发明通过以下的技术方案实现上述技术目的：

本发明提供了一种Bouchardatine和Bouchardatine衍生物，所述Bouchardatine 和Bouchardatine衍生物结构式如式(I)所示：

其中：R为-(CH₂)_nR₁，n＝0、1、2或3；

所述R₁独立地选自：

(1)被1个或多个R₂取代的取代苯基；

(2)吗啡啉基或哌啶基；

(3)N,N-二甲基氨基或N,N-二乙基氨基；

R₂独立地选自：

(1)氟基；

(2)甲氧基；

(3)硝基。

所述R₁为N,N-二甲基,N,N-二乙基，吗啡啉基，哌啶基，对硝基苯基，对 甲氧基苯基等芳香类基团。

本发明所述Bouchardatine和Bouchardatine衍生物合成过程如下：

具体合成步骤如下：

S1：将邻氨基苯甲酰胺与原丙酸三乙酯反应得到化合物1

S2：将上一步所得化合物1溴化后得到化合物2

S3：将上一步所得化合物2与苯肼经取代、消除反应后先生成亚胺，然后 再生成化合物3

S4：将上一步所所得化合物3经PPA催化的Fischer反应得到含有吲哚环结 构特征的化合物4

S5：将上一步所得化合物4与DMSO-H₂O及乙酸铵反应，并在吲哚的3- 位引入甲酰基得到化合物5，即天然产物Bouchardatine

S6：将上一步所得化合物5中喹唑啉酮的羰基进行氯代，得到化合物6

S7：将上一步所得化合物6与不同的胺类化合物反应，得到Bouchardatine 衍生物。

优选地，所述S3步骤中化合物2与苯肼反应的摩尔比为1:3～5。

优选地，所述S5步骤中反应采用氮气保护进行。

优选地，所述S5步骤中乙酸铵与化合物4反应的摩尔比为2～6：1，所述 DMSO-H₂O溶液中DMSO与H₂O的体积比为10～20:1。

本发明还提供了一种Bouchardatine和Bouchardatine衍生物在制备抗肥胖症 和减轻脂肪肝生成的药物中的应用；

进一步地，本发明所述药物还包括和其药学上可接受的盐或载体。

更进一步地，所述药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。

细胞水平实验结果表明，本发明提供的Bouchardatine和Bouchardatine衍生 物不仅能够显著地减少3T3-L1小鼠脂肪细胞内甘油三酯含量，还能够减少油酸 钠诱导的人肝癌细胞株HepG-2细胞内甘油三酯累积。如化合物SYS-B3抑制脂 肪生成的活性为EC50＝0.78±0.13μM；而抑制人肝癌细胞株HepG-2细胞内甘油 三酯累积的活性为EC50＝14.44±0.52μM，表明所述Bouchardatine和 Bouchardatine衍生物通过抑制细胞内脂肪生成来减少脂肪形成，并可能通过抑制 外源性脂肪酸摄取而促进内源性脂肪动员来减少脂肪累积，达到治疗肥胖症和减 轻脂肪肝生成的效果。

通过对化合物SYS-B3降脂机制研究发现，化合物SYS-B3可以有效的抑制 脂肪分化相关调控因子的表达(如PPARγ,C/EBPα,SREBP-1c)以及调控脂肪生 成的相关代谢酶(ACC,FAS，SCD-1)。其次，我们还发现化合物SYS-B3能够 激活AMPK通路以及抑制未折叠蛋白响应通路(unfolded protein response,UPR)， 这些结果与其抗肥胖症的治疗作用效果相一致。

通过对本发明提供的Bouchardatine衍生物与天然产物Bouchardatine脂肪抑 制效果进行对比发现，本发明降脂活性得到显著提高，特别地，化合物SYS-B3 降脂活性比Bouchardatine天然产物降脂活性提高了约23倍。

动物实验结果表明，化合物SYS-B3急毒毒性的IC50大于80mg/kg，比有 效剂量窗口高100倍以上。而化合物SYS-B3在不影响小鼠摄食条件下，可有效 的减少白色脂肪组织重量，并可显著性的降低血浆中甘油三酯及游离脂肪酸含量， 这一实验结果与细胞水平的研究结果相符合。此外，化合物SYS-B3药学性质稳 定，膜通透性好，生物利用率较高，均表明SYS-B3具有良好的成药性。

本发明还提供了一种抗肥胖药物，该类药物具有减少脂肪积累、减轻肥胖、 缓解脂肪肝等功效。该类化合物可用于治疗肥胖症以及肥胖引起的糖尿病、心血 管疾病等相关疾病。该类药物含有本发明提供的Bouchardatine和Bouchardatine 衍生物以及药学上可接受的辅助剂。该药物可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊 剂、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服，经皮，静脉或肌肉注射。

药理学和动物水平实验证明，本发明所提供的Bouchardatine和Bouchardatine 衍生物，具有抗肥胖症和减轻脂肪肝生成能力，尤其是经过结构改造的 Bouchardatine衍生物的成药性相比较Bouchardatine得到显著改善，具有开发成 为抗肥胖症新药的前景。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明提供的Bouchardatine和Bouchardatine衍生物能够显著减少3T3-L1 脂肪细胞内的脂质累积，并且能够减少油酸钠诱导的人肝癌细胞内脂质的积累， 具有降低动物细胞甘油三酯水平和抗肥胖症及减轻脂肪肝生成的效果，并且安全 性高，成药性好。

附图说明

图1：本发明提供的Bouchardatine和Bouchardatine衍生物对3T3-L1脂肪细 胞脂肪累积的影响(化合物浓度均为1μM)；

图2：本发明提供的Bouchardatine衍生物SYS-B3与Bouchardatine天然产 物以浓度梯度依赖性的方式减少3T3-L1细胞的脂质累积对比图；

图3：本发明提供的Bouchardatine和Bouchardatine衍生物对3T3-L1细胞分 化及基础对照组BM和DMSO分化对照组处理的细胞形态对比图；(细胞形态为 第6天，显微镜40倍视野下观察)

图4：本发明提供的Bouchardatine和Bouchardatine衍生物对油酸钠诱导人 肝癌细胞HepG-2脂质累积的影响(化合物浓度均为1μM)。

图5：本发明提供的Bouchardatine和Bouchardatine衍生物对油酸钠诱导人 肝癌细胞HepG-2脂质累积的影响(化合物浓度均为1μM)，经油红O染色，显 微镜4倍镜拍照所得图片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明Bouchardatine和Bouchardatine衍生物及其制 备方法和应用进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备 和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

实施例1：化合物1的合成

50mL单口瓶中投入1.36g邻氨基苯甲酰胺，加入原丙酸三乙酯10mL，将温 度调至155℃反应19h，薄层色谱法监测反应完全。将反应液冷却至室温，析出 少量白色固体，再放置冰箱析出大量固体，过滤，乙醇洗涤，将母液旋干后，再 用乙醇溶解其中杂质，再过滤，合并滤饼，烘干共得到1.51g白色针状固体1。

产率89.5％；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ11.39(s，1H),8.31(d,J＝7.9Hz, 1H),7.83-7.67(m,2H),7.48(t,J＝7.4Hz,1H),2.85(q,J＝7.5Hz,2H),1.46(t,J＝ 7.6Hz,3H)；ESI-MS m/z:175.2[M+H]⁺.

实施例2：化合物2的合成

将1.5g化合物1加入到90mL乙酸中，再加入705mg乙酸钠，加热到60℃， 搅拌一会，直至反应液澄清。取0.5mL溴素溶解到10mL乙酸中，用恒压滴液漏 斗滴入到反应液中，反应液由棕色变为白色浑浊，反应10个小时左右，将反应 液倒入水中，析出大量白色固体，抽滤，大量水洗。红外灯下烘干，得1.93g白 色固体2。

产率88.7％；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.49(s，1H),8.12(d，J＝8.0Hz,1H)， 7.86(t，J＝7.8Hz,1H)，7.70(t，J＝8Hz,1H)，7.56(d,J＝8.0Hz,1H)，5.10(m，1H)， 2.01(d，J＝8.0Hz,3H)；ESI-MS m/z:255.0[M+H]⁺，253.0[M-H]^-.

实施例3：化合物3的合成

将14.87g化合物2加入到450mL乙醇中，再加入20.2mL苯肼，加热回流， 反应过夜，第二天发现有大量淡黄色固体悬浊。停止反应，冷却静置，过滤，用 少量乙醇洗涤，再用乙醇重结晶，烘干得到12.4g淡黄色棉状轻薄的固体3。

产率76％；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.50(s,1H),9.88(s,1H),8.13(d,J ＝7.9Hz,1H),7.81(t,J＝7.6Hz,1H),7.68(d,J＝8.1Hz,1H),7.60(d,J＝7.8Hz, 2H),7.49(t,J＝7.5Hz,1H),7.28(t,J＝7.9Hz,2H),6.89(t,J＝7.3Hz,1H),2.35(s, 3H)；ESI-MS m/z:279.2[M+H]⁺，277.2[M-H]^-.

实施例4：化合物4的合成

500mL的三颈瓶中加入200mL的PPA，油浴加热到180℃，开启机械搅拌。 将12.4g化合物3加入到PPA中。反应2h，反应液逐渐变成红褐色。停止反应， 冷却静置，倒入大量冰水中，用KOH调pH至中性，析出大量黄绿色固体，过 滤，红外灯下烘干，得9.5g黄绿色固体4。

产率82.1％；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.71(s,1H),8.13(d,J＝7.8Hz, 1H),7.80(t,J＝7.5Hz,1H),7.70(d,J＝8.0Hz,1H),7.63(d,J＝7.9Hz,1H),7.58 (s,1H),7.53(d,J＝8.2Hz,1H),7.45(t,J＝7.5Hz,1H),7.21(t,J＝7.6Hz,1H), 7.05(t,J＝7.5Hz,1H)；ESI-MS m/z:262.1[M+H]⁺，260.1[M-H]^-.

实施例5：化合物5的合成

于三颈瓶中加入1.8g化合物4、2.1g醋酸铵,用混合溶剂DMSO-H₂O(50 mL/2.7mL)溶解，N₂保护，于150℃反应24小时。将反应液倒入大量冰水中， 不断搅拌，析出大量固体，将析出的黄棕色固体过滤，红外灯下烘干，DCM过 柱纯化，得1.2g淡黄色固体5。

产率61％；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ13.62(s,1H),13.11(s,1H),10.49(s, 1H),8.28(d,J＝8.0Hz,1H),8.22(d,J＝7.1Hz,1H),7.92(dd,J＝11.1,4.1Hz,1H), 7.86(d,J＝7.8Hz,1H),7.70(d,J＝8.1Hz,1H),7.61(t,J＝6.9Hz,1H),7.43(t,J＝ 7.1Hz,1H),7.36(t,J＝7.1Hz,1H)；ESI-MS m/z:290.1[M+H]⁺，288.0[M-H]^-.

实施例6：化合物6的合成

于单口瓶中加入1.1g化合物5、2mL POCl₃,0.3mL N，N-二甲基苯胺，回流 反应6个小时，将反应液倒入冰水中，不断搅拌，析出大量固体，将析出的淡黄 色固体过滤，红外灯下烘干，EA:PE＝1：3过柱纯化，得0.67g淡黄色固体6。

产率57％；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.68(s,1H),8.28(d,J＝6.6Hz,2H), 7.94(t,J＝7.6Hz,1H),7.87(d,J＝7.8Hz,1H),7.74(d,J＝7.8Hz,1H),7.66(t,J＝ 7.6Hz,1H),7.55(s,1H),7.50(t,J＝7.9Hz,1H),7.43(t,J＝7.8Hz,1H)；ESI-MS m/z:308.1[M+H]⁺，306.0[M-H]^-.

实施例7：化合物SYS-B1的合成

将127mg化合物6加入到15mL的甲苯中，吸取0.1mL三乙胺，以及0.4mL N，N-二乙基乙二胺，于110℃反应12h，反应液呈金黄色，点板显示反应完全。 后处理：将反应液于75℃水浴锅中旋干溶剂和少量三乙胺，再用CHCl₃、饱和 食盐水萃取产物及分离少量杂质。干燥有机相，旋干溶剂，用氯仿：甲醇：氨水 ＝15：1：0.5％做洗脱剂过柱纯化得浅红色固体。

产率57％；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ11.45(s,1H),10.56(s,1H),8.51(d,J ＝5.1Hz,1H),7.77(t,J＝9.8Hz,2H),7.71-7.65(m,1H),7.44(d,J＝7.9Hz,1H), 7.41-7.37(m,1H),7.27(dd,J＝5.3,1.9Hz,2H),7.14(s,1H),3.66(d,J＝4.1Hz, 2H),2.76(t,J＝5.7Hz,2H),2.63(dd,J＝14.4,7.2Hz,4H),1.08(t,J＝7.1Hz,6H). ¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ191.1,159.3,154.3,149.3,142.9,135.1,133.0,128.3, 127.0,126.5,124.9,123.2,123.0,121.4,117.5,114.3,111.6,50.9,46.8,38.3,11.4. HRMS(ESI)m/z:calcd for C₂₃H₂₅N₅O,[M+H]⁺388.2132,found 388.2119.

实施例8：化合物SYS-B2的合成

将127mg化合物6加入到15mL的甲苯中，吸取0.1mL三乙胺，以及过量 的胺链氨丙基吗啡啉0.3mL。于110℃反应12h，反应液呈浅红色，点板显示反 应完全。后处理：将反应液于75℃水浴锅中旋干溶剂和少量三乙胺，再用CHCl₃、 饱和食盐水萃取产物及分离少量杂质。干燥有机相，旋干溶剂，用氯仿：甲醇： 氨水＝20：1：0.5％做洗脱剂过柱纯化得淡黄色固体。

产率51％；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ11.48(s,1H),10.09(s,1H),8.53(d, J＝8.2Hz,1H),8.30(s,1H),7.85(d,J＝8.5Hz,2H),7.76(t,J＝7.1Hz,1H),7.48 (dd,J＝13.4,7.1Hz,2H),7.35(d,J＝7.1Hz,1H),7.30(t,J＝8.5Hz,1H),.3.87(t,J ＝7.8Hz,4H),3.82(dd,J＝10.3,5.7Hz,2H),2.69(t,J＝7.9Hz,2H),2.62(s,4H), 1.97(dd,J＝10.8,5.6Hz,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ191.0,159.7,154.5, 149.3,142.7,134.8,132.9,128.5,127.1,126.1,124.9,123.3,123.0,121.4,117.6, 114.4,111.3,67.0,59.3,54.0,43.1,23.1.HRMS(ESI)m/z:calcd for C₂₄H₂₅N₅O₂, [M+H]⁺416.2081,found 416.2080.

实施例9：化合物SYS-B3的合成

将150mg化合物6加入到15mL的甲苯中，吸取0.1mL三乙胺，以及过量 的胺链氨乙基哌啶0.3mL。于110℃反应11h，反应液呈浅红色，点板显示反应 完全。后处理：将反应液于75℃水浴锅中旋干溶剂和少量三乙胺，再用CHCl₃、 饱和食盐水萃取产物及分离少量杂质。干燥有机相，旋干溶剂，用氯仿：甲醇： 氨水＝20：1：0.5％做洗脱剂过柱纯化得浅红色固体。

产率53％；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ11.49(s,1H),10.16(s,1H),8.53(d, J＝8.4Hz,1H),7.86(d,J＝9.5Hz,1H),7.80-7.71(m,2H),7.51(d,J＝8.2Hz,1H), 7.49-7.44(m,1H),7.35(d,J＝5.7Hz,1H),7.32-7.28(m,1H),7.05(s,1H),3.75(dd, J＝10.5,5.6Hz,2H),2.73(t,J＝5.9Hz,2H),2.52(s,4H),1.72-1.62(m,4H),1.53(d, J＝4.8Hz,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ191.0,159.4,154.4,149.4,142.7, 134.9,132.9,128.4,127.1,126.4,124.9,123.3,123.0,121.2,117.6,114.3,111.4,56.3, 54.1,37.9,26.1,24.3.HRMS(ESI)m/z:calcd for C₂₄H₂₅N₅O,[M+H]⁺400.2132, found 400.2131.

实施例10：化合物SYS-B4的合成

将150mg化合物6加入到15mL的甲苯中，吸取0.1mL三乙胺，以及过量 的215mg对硝基苯胺。于110℃反应11h，反应液呈浅红色，点板显示反应完全。 后处理：将反应液于75℃水浴锅中旋干溶剂和少量三乙胺，再用CHCl₃、饱和 食盐水萃取产物及分离少量杂质。干燥有机相，旋干溶剂，用氯仿：甲醇：氨水 ＝35：1：0.5％做洗脱剂过柱纯化得红棕色固体。

产率50％；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.48(s,1H),8.27(d,J＝7.9Hz,1H), 8.21(d,J＝7.8Hz,1H),7.95(d,J＝2.0Hz,1H),7.93(d,J＝1.8Hz,1H),7.92– 7.89(m,1H),7.85(d,J＝7.9Hz,1H),7.69(d,J＝8.1Hz,1H),7.61(t,J＝6.9Hz, 1H),7.42(t,J＝7.6Hz,1H),7.35(t,J＝7.5Hz,1H),6.70(s,1H),6.64–6.60(m, 1H),6.59(d,J＝3.2Hz,1H).

¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ187.49,161.73,156.78,153.88,145.29,135.82, 134.85,134.63,128.83,127.58,127.35,126.79,126.34,126.07,125.34,125.03, 123.21,122.43,122.23,121.74,120.11,113.23,112.34.ESI-MS m/z:410.2[M+H]⁺， 408.1[M-H]^-.

实施例11：化合物SYS-B5的合成

将117mg化合物6加入到15mL的甲苯中，吸取0.1mL三乙胺，以及过量 的胺链氨丙基哌啶0.3mL。于110℃反应11h，反应液呈浅红色，点板显示反应 完全，后处理：将反应液于75℃水浴锅中旋干溶剂和少量三乙胺，再用CHCl₃、 饱和食盐水萃取产物及分离少量杂质。干燥有机相，旋干溶剂，用氯仿：甲醇： 氨水＝15：1：0.5％做洗脱剂过柱纯化得浅红色固体。

产率58％；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.08(s,1H),8.18(d,J＝7.4Hz,1H), 8.07(d,J＝7.7Hz,1H),7.84(dd,J＝14.4,7.5Hz,2H),7.70(d,J＝7.8Hz,1H), 7.53(t,J＝8.2Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),7.25(t,J＝7.1Hz,1H),3.86(s, 2H),2.43(s,4H),2.03(s,2H),1.50(s,4H),1.37(s,2H),1.21(s,2H).¹³C NMR(101 MHz,DMSO)δ188.17,162.2,156.4,135.9,134.3,133.9,128.7,127.2,126.2,126.0, 124.9,122.8,121.9,121.5,120.4,119.0,113.2,56.8,56.1,53.8,27.2,25.3,23.9. HRMS(ESI)m/z:calcd for C₂₅H₂₇N₅O,[M+H]⁺414.2288,found 414.2274.

实施例12：化合物SYS-B6的合成

将117mg化合物6加入到15mL的甲苯中，吸取0.1mL三乙胺，以及101mg 对甲氧基苯胺。反应13h，点板显示反应完全，后处理：将反应液于75℃水浴锅 中旋干溶剂和少量三乙胺，再用CHCl₃、饱和食盐水萃取产物及分离少量杂质。 干燥有机相，旋干溶剂，用氯仿：甲醇：氨水＝35：1：0.5％做洗脱剂过柱纯化 得深棕色固体。

产率54％；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ12.72(s,1H),10.48(s,1H),9.45(s, 1H),8.33(d,J＝8.1Hz,1H),8.20(d,J＝6.8Hz,1H),7.91(d,J＝8.9Hz,2H),7.85 (d,J＝7.9Hz,2H),7.70(t,J＝8.2Hz,1H),7.55(t,J＝7.3Hz,1H),7.39(t,J＝7.9 Hz,1H),7.29(t,J＝7.4Hz,1H),7.10(d,J＝8.9Hz,2H),3.84(s,3H).¹³C NMR (101MHz,DMSO)δ187.4,162.1,158.7,150.2,149.1,146.6,140.3,135.9,134.8, 134.5,131.2,129.0,127.6,127.2,126.4,125.9,125.1,123.2,122.8,121.8,121.6, 120.1,119.8,114.6,113.2,55.4.HRMS(ESI)m/z:calcd for C₂₄H₁₈N₄O₂,₂[M+H]⁺395.1503,found 395.1491.

实施例13：化合物SYS-B7的合成

将117mg化合物6加入到15mL的甲苯中，吸取0.1mL三乙胺，以及94.45mg 胺链对氟苯胺。反应11h，点板显示反应完全，后处理：将反应液于75℃水浴锅 中旋干溶剂和少量三乙胺，再用CHCl₃、饱和食盐水萃取产物及分离少量杂质。 干燥有机相，旋干溶剂，用氯仿：甲醇：氨水＝35：1：0.5％做洗脱剂过柱纯化 得深黄色固体。

产率57％；¹H NMR(400MHz,DMSO):δ12.80(s,1H),9.48(s,1H),8.34(d, J＝7.8Hz,1H),8.20(d,J＝7.6Hz,1H),7.98-7.90(m,2H),7.87(dd,J＝13.9,7.4Hz, 2H),7.71(d,J＝8.1Hz,1H),7.56(t,J＝7.2Hz,1H),7.39(dd,J＝15.2,7.1Hz,3H), 7.30(t,J＝7.3Hz,1H).¹³C NMR(101MHz,DMSO):δ187.4,162.0,159.9,152.7, 149.0,146.3,143.8,135.9,134.5,131.6,129.0,127.3,126.5,125.9,125.2,123.4, 123.3,121.8,119.7,116.2,116.0,113.0,112.9；HRMS(ESI)m/z:calcd for  C₂₃H₁₅FN₄O,[M+H]⁺383.1303,found 383.1287.

实施例14：应用小鼠前脂肪细胞3T3-L1细胞分化模型，采用油红O染色并结合 显微镜拍照，评价Bouchardatine和Bouchardatine衍生物衍生物对脂肪细胞内甘 油三酯含量影响。

实验步骤

对数生长期的3T3-L1前脂肪细胞，5.0*10⁴细胞/孔，均匀接种至48孔板，细 胞培养箱静置培养，每两天更换一次培养液。待细胞生长接近至80％融合，更换 培养液，继续培养2天至细胞完全融合(Day0),更换含有分化诱导液Ⅰ的DMEM 完全培养液(含10％FBS及1％双抗的DMEM培养液)，37℃5％CO₂静置培养 3天(Day3)。3天后，更换含有分化诱导液Ⅱ的DMEM完全培养液继续培养3 天(Day6)。对于药物干预组，以含分化诱导液的DMEM完全培养液为稀释液， 稀释药物溶液至一定浓度，在Day0与Day3时，一同加入。空白对照组与分化 对照组，分别加入等体积的DMSO溶液。在Day6时，进行油红O染色拍照以 及甘油三酯含量分析。

(1)分化诱导液配制

分化诱导液Ⅰ：含500μM3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤，100ng/mL地塞米松，2 μg/mL胰岛素的DMEM完全培养液 分化诱导液Ⅱ：含2μg/mL胰岛素的DMEM完全培养液

(2)油红O染色

细胞诱导分化至Day6时，细胞经预冷PBS润洗1次，4％冰冻多聚甲醛固定 液室温固定60min。0.3％油红O染色工作液室温染色30min。室温的去离子水漂 洗2-3次，倒置显微镜拍照(40×)。

每孔分别加入300uL异丙醇溶液，摇床平缓摇动室温萃取油红O染料30mins， 分别移取100μL染液进行510nm吸光度检测。

(3)甘油三酯含量分析

细胞分化结束后，预冷PBS润洗2次，去尽PBS，加入含0.2％Triton X-100 的去离子溶液，室温静置1h，收集细胞悬液，超声破碎10min，使细胞充分裂 解，离心收集上清液，按照甘油三酯检测试剂盒说明书测定甘油三酯含量。

(4)结果分析

甘油三酯含量分析以分化对照组为“100％对照”表示，即化合物甘油三酯含量 /分化对照组含量*100％。实验结果为三次独立实验的平均值，结果按照“平均值± 标准差”进行统计学分析。

(5)实验结果

如图1所示，DM组代表分化对照组，代表正常分化的细胞，有大量的脂质 累积。Bouchardatine为天然产物，化合物SYS-B1等均为Bouchardatine衍生物。 与DM相比，1μM的SYS-B1、SYS-B2、SYS-B3及SYS-B5均能有效的抑制 脂肪生成(*，p<0.05；**，p<0.01)；其中以化合物SYS-B1与SYS-B3的抑制 效果最明显。

如图2显示，Bouchardatine及SYS-B3均能够以浓度梯度依赖性的方式减少 3T3-L1细胞内脂质含量(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)，而化合物SYS-B3 活性更强。由图可知，经过5μM的Bouchardatine及SYS-B3处理过的细胞，甘 油三酯含量分别减少了18％、65％；我们通过计算，得到Bouchardatine及SYS-B3 的EC₅₀值分别为22.59μM、1.1μM，化合物SYS-B3降脂活性提高了约23倍。

图3中，BM代表基础对照组，代表未分化的细胞，细胞内无脂质累积；DM 代表分化对照组，细胞内清晰可见大量的脂质；而化合物处理组细胞内的脂质含 量随着化合物浓度的升高而逐渐减少。如化合物SYS-B3在0.1、0.5、1、5、10μM 浓度下，甘油三酯含量分别为对照组的73％、56％、47％、28％、15％。

实施例15：应用人肝癌细胞株HpeG-2，采用甘油三酯含量分析试剂盒以及BCA 蛋白浓度测定试剂盒，体外评价Bouchardatine和Bouchardatine衍生物对油酸钠 诱导的人肝癌细胞株HpeG-2细胞甘油三酯含量的影响。

实验步骤：

该实验设置空白对照组(不加油酸钠)、油酸钠诱导组(含油酸钠)，以及不 同浓度的药物干预组。具体操作如下：

将人肝癌细胞HepG-2均匀接种至48孔板，静置培养24h。更换含有0.5mM 油酸钠的DMEM完全培养液(含有10％FBS及1％双抗的DMEM培养液)，油 酸钠终浓度为1mM。37℃5％CO₂环境下共孵育24h。此实验中，化合物干预 组是化合物经含有油酸钠的DMEM完全培养液稀释至所需浓度。而空白对照组 与油酸钠对照组分别加入等量的DMSO。

(1)油红O染色及吸光度分析

细胞经预冷PBS(PH7.4)润洗2次，4％冰冻多聚甲醛固定液室温固定60min。 0.3％油红O染色液室温染色30mins。去离子水漂洗2-3次，倒置显微镜拍照(40×)

(2)甘油三酯含量与蛋白含量分析

经过处理的细胞，PBS润洗2次，去尽PBS，加入含0.2％Triton X-100的去 离子溶液，室温静置1h，反复吹打使细胞充分裂解，收集细胞悬液至离心管， 超声破碎10min，离心收集上清液，分别按照甘油三酯检测试剂盒说明书与BCA 蛋白定量检测试剂盒测定甘油三酯含量与蛋白浓度。最后甘油三酯含量以 “nmol/mg蛋白”形式表示。为了便于与对照组比较，以对照组为“100％”，分别换 算(处理组甘油三酯含量(nmol/mg蛋白)/对照组甘油三酯含量((nmol/mg蛋 白)*100％)。实验结果为三次独立实验的平均值，结果按照“平均值±标准差”进 行统计学分析。

(3)实验结果

由图4中可知，与空白对照Blank组相比，油酸钠诱导组细胞内甘油三酯含 量显著升高(#，p<0.01)。而化合物干预则可有效的减少细胞内甘油三酯含量， 如1μM时，化合物SYS-B1、SYS-B2、SYS-B3组甘油三酯含量分别减少了43％、 28％、54％，以化合物SYS-B3效果最好。

图5显示，Blank组代表未经油酸钠处理的，细胞内无明显的脂质积累； Control组代表油酸钠诱导处理的，细胞内清晰可见大量的脂质积累。而 Bouchardatine在10μM浓度时细胞内脂质积累无明显变化，而Bouchardatine衍 生物1μM时细胞内脂质积累均明显减少，其中以化合物SYS-B1效果最好，该 实验再次说明，经过结构改造，Bouchardatine衍生物的降脂活性得到了明显提高。