奶牛早期妊娠的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种基于荧光定量PCR技术的奶牛早期妊娠检测试剂盒及检测方法，通过联合检测奶牛外周血中两个干扰素刺激基因ISG15和RSAD2的表达量来进行妊娠诊断，可以在青年母牛人工授精后18d排查空怀牛和妊娠牛，使妊娠诊断的时间提前；可实现在青年母牛第一次配种后3周以内排查空怀牛，对其进行再次人工授精，从而缩短产犊至下一次妊娠的间隔，进而提高奶牛的繁殖率。本发明的试剂盒及其检测方法，操作简单，出结果快，检测结果准确，灵敏度高，有望成为今后奶牛业中早期妊娠诊断的主流技术。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域，具体的说，本发明涉及一种 基于荧光定量PCR技术的奶牛早期妊娠检测试剂盒及检测方法。

背景技术

妊娠诊断是奶牛生产管理中的重要环节，对奶牛实施早期妊娠诊断可以尽 早发现空怀牛并对其进行发情处理和再次人工授精，可缩短产犊间隔、减少空 怀导致的经济损失。根据国内外专家估计，空怀导致每头乳牛每日约减奶8-15 千克；最低少生产牛犊0.003头，每头每日饲料、能源、人力等方面的消耗约 20-30元。因此，探索科学、准确、简便、快捷的奶牛早期妊娠诊断新技术显得 尤为重要。

在生产中常见最常用的妊娠诊断方法是直肠触诊，技术比较成熟的繁殖员 在配种后45-50d可做出准确诊断，经验丰富的繁殖员最早可以在人工授精后35 d判断是否妊娠；通过测定牛奶或者血液中的孕酮含量也可以判断奶牛是否受 孕，该方法在人工授精后21-24d进行检测；目前已经开始初步使用但是尚未广 泛推广的牛妊娠相关蛋白(PAG)ELISA试剂盒能在妊娠后28d做出较为可靠 的判断。由此可见，这些方法均只能在奶牛人工授精三周后做出准确诊断。最 新的研究报道证实利用PAG ELISA试剂盒于人工授精后28d排查出来的空怀 牛，与同样条件下在妊娠46d时利用直肠检查的方法排查出来的空怀牛相比， 对其实施同期发情并再次配种后的妊娠率和空怀天数并没有提高(Sinedino L D, Lima F S,Bisinotto R S,et al.Effect of early or late resynchronization based on  different methods of pregnancy diagnosis on reproductive performance of dairy  cows[J].Journal of dairy science,2014,97(8):4932-41)。研究指出，如果人工授精 后一个情期内(三周)能排查出空怀牛，即可对其进行快速的同期发情处理， 在第21-23d进行复配，减少空怀天数，提高奶牛的繁殖效率(Lucy M C,McDougall  S,Nation D P.The use of hormonal treatments to improve the reproductive performance of  lactating dairy cows in feedlot or pasture-based management systems[J].Animal reproduction  Science,2004,82-83:495-512)。因此，从某种程度上来讲，能否于奶牛人工授精后一 个情期内判断奶牛妊娠或者空怀，是缩短奶牛产犊间隔和提高繁殖率的关键。

综上，需要能够实现快速、有效且准确检测奶牛早期妊娠的产品，以尽早 发现空怀牛并对其进行发情处理和再次人工授精，缩短产犊间隔、减少空怀导 致的经济损失。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高、准确地检测奶牛早期妊 娠的荧光定量RT-PCR的方法，以较早时间判断出青年牛人工授精后是否妊娠。

牛早期胚胎发育的过程中，在授精后14-18d即母体妊娠识别阶段，孕体合 成并分泌的干扰素-τ(IFN-τ)可作用于血液中白细胞，引起一系列干扰素刺激 基因上调表达，因此，通过定量PCR技术检测白细胞中这些干扰素刺激基因的 表达水平可以进行妊娠诊断。本发明通过荧光定量PCR技术检测奶牛人工授精 后18d外周血白细胞中干扰素刺激基因的表达水平来进行妊娠诊断，实现在奶 牛人工授精后一个情期内判别妊娠牛和空怀牛。为空怀牛的复配节约时间，从 根本上提高奶牛的繁殖效率。

该荧光定量RT-PCR检测方法包括如下步骤(步骤示意如图1)：

(1)血液标本的收集

采集青年牛(14-16月龄的奶牛)发情后人工授精前0d和人工授精后18d 的外周血1.5-2ml，抗凝，低温冷藏。

(2)标本RNA的提取

血液总RNA提取试剂盒提取标本中总RNA(标本采集后2h内完成)，之后 利用NanoDrop 2000超微量分光光度计分析RNA样本浓度与纯度 (OD_260/280＝1.9-2.1)，同时采用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，通过质 检的样本分装后，于-80℃保存备用。

(3)逆转录反应

逆转录采用试剂盒进行，每个反应RNA用量为500ng，根据RNA的浓度 计算得出每次反应所需的体积，按照试剂盒说明书进行。

(4)荧光定量PCR检测ISG15和RSAD2基因在青年牛外周血中的相对表达量

1)目的基因和内参基因引物的设计与合成

牛ISG15基因和内参基因β-Actin引物参考文献报道(Gifford CA,Racicot K, Clark D S,et al.Regulation of Interferon-Stimulated Genes in Peripheral Blood  Leukocytes in Pregnant and Bred,Nonpregnant Dairy Cows[J].Journal of dairy  science,2007,90:274-280)，其中，所述的牛ISG15基因的引物对是：SEQ ID NO： 1和SEQ ID NO：2，β-Actin的引物对是：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4， 具体的引物信息如下：

ISG15-F:5＇-GGTATCCGAGCTGAAGCAGTT-3＇

ISG15-R:5＇-ACCTCCCTGCTGTCAAGGT-3＇

β-Actin-F：5＇-CTGGACTTCGAGCAGGAGAT-3＇

β-Actin-R:5＇-GGATGTCGACGTCACACTTC-3＇

牛RSAD2基因引物对序列根据NCBI中提供的牛RSAD2基因序列 (NM_001045941)，利用软件Primer 5.0设计。所用引物序列如SEQ ID NO： 5和SEQ ID NO：6所示，具体的引物对序列为：

RSAD2-F:5＇-GCTGAAAGAAGCAGGTATGGA-3＇

RSAD2-R:5＇-CGTACTTCTGGAACCACCTCT-3＇

2)荧光定量PCR反应体系

牛ISG15和RSAD2基因荧光定量PCR扩增体系均为：Green 10 μl，上下游引物各0.5μl(10μmol/L)，cDNA模板0.3μl，ddH₂O 8.7μl，体系共 20μl。

3)荧光定量PCR反应条件

ISG15基因反应条件：95℃预变性60s，95℃变性15s，62℃退火15s；72℃ 延伸30s，共40个循环

RSAD2基因反应条件：95℃预变性60s，95℃变性15s，58℃退火15s； 72℃延伸30s，共40个循环

β-Actin基因反应条件：95℃预变性60s，95℃变性15s，60-62℃退火15s； 72℃延伸30s，共40个循环

(5)统计分析

1)ISG15和RSAD2基因表达量的分析

采用相对定量的方法检测目的基因的表达量：计算出检测标本中目的基因 Ct均值与内参基因Ct均值的差值(△Ct)，以2^-△△Ct表示样品中目的基因mRNA 相对表达量，其中△△Ct＝△Ct-(人工授精后0d检测样本目的基因的Ct均值- 该样品内参基因的Ct均值)。将奶牛人工授精后0d各基因的相对表达量较正为 1，人工授精后18d的表达量为0d时表达量的倍数。

2)利用牛ISG15和RSAD2基因的表达量进行青年牛早期妊娠诊断

人工授精后18d奶牛外周血中ISG15的表达量为X1，RSAD2的表达量为 X2，将X1和X2带入公式P＝1/[1+e^{-(-6.53+2.830X1+0.866X2)}]中，如果P值大于0.680 时，即为妊娠。

本发明的另一目的在于提供牛外周血中干扰素刺激基因表达水平的实时荧 光定量RT-PCR检测试剂盒，它含有牛干扰素刺激基因RSAD2和ISG15以及内 参基因β-Actin特异性引物对，其中：

(a)牛ISG15基因和内参基因β-Actin引物对信息如下：

ISG15-F:5＇-GGTATCCGAGCTGAAGCAGTT-3＇

ISG15-R:5＇-ACCTCCCTGCTGTCAAGGT-3＇

β-Actin-F：5＇-CTGGACTTCGAGCAGGAGAT-3＇

β-Actin-R:5＇-GGATGTCGACGTCACACTTC-3＇

(b)牛RSAD2基因引物对序列为：

RSAD2-F:5＇-GCTGAAAGAAGCAGGTATGGA-3＇

RSAD2-R:5＇-CGTACTTCTGGAACCACCTCT-3＇

所述试剂盒的统一浓度和1人份测试用量统一标准为：

根据本发明的教导，本领域技术人员将能够设计和合成引物，并用于荧光 实时PCR定量检测技术。

在本发明中，除了联合使用奶牛外周血中两个干扰素刺激基因ISG15和 RSAD2的表达量来进行妊娠诊断，检测所采用的RSAD2的引物对等与现有技术不 同之外，诸如从样品总抽提RNA、逆转录、PCR扩增和荧光检测等步骤的条件 可与现有技术相同，本领域技术人员完全可以用常规的条件进行上述各种步骤。 当然，也可采用本申请实施例中所给出的优选条件。

本发明通过实时荧光PCR定量检测方法联合检测青年牛外周血中两个干扰 素刺激基因ISG15和RSAD2的表达量来进行妊娠诊断，方法的准确性和灵敏性得 到很大程度增强，且无需电泳就可获得结果，减少检测时间；可以在奶牛人工 受精后18d排查空怀牛和妊娠牛，妊娠诊断的时间提前，可实现在奶牛第一次配 种后3周以内排查空怀牛，对其进行再次人工授精后可缩短产犊至下一次妊娠的 间隔，进而提高奶牛的繁殖率；由于本发明中分析的表达量是将人工授精后0d 各基因的相对表达量较正为1后，人工授精后18d的表达量相对于0d时表达量的 倍数，减少了由于个体差异导致误判的可能性。同时此法只需采取母牛少量血 液，操作成本低廉，也避免了传统操作可能带来的组织损伤和生殖系统感染问 题，无论对母体还是胎儿均不会造成任何伤害。特别是，本方法将分子生物学 技术引入到奶牛生产之中，强调实验室操作，这对于将来奶牛早期妊娠诊断向 着集约化和科学化的方向发展起到了很好的促进作用，势必会大大提高生产效 率，有望成为今后奶牛业中早期妊娠诊断的主流技术。

附图说明

图1为基于荧光定量PCR技术的奶牛早期妊娠诊断方法的步骤示意图。

图2为总RNA的凝胶电泳结果图，其中1-16为样品编号。

图3为ISG15、OAS1和RSAD2基因的扩增结果图，其中M：DNA相对分子质量 标准DL2000；泳道1，2:ISG15基因的PCR扩增产物；泳道3，4：OAS1基因的PCR 扩增产物；泳道5，6：RSAD2基因的PCR扩增产物。

图4为单基因进行妊娠诊断的ROC曲线。

图5为多基因联合进行妊娠诊断的ROC曲线。

图6为孕酮含量进行妊娠诊断的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。应理解，这些实施例仅用 于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New  York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造 厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计。

【实施例1】干扰素刺激基因的表达量单独或者联合应用于妊娠诊断

1材料与方法

1.1实验动物及样本采集

选择武汉市某规模化奶牛场14-16月龄的青年牛36头，利用EDTAK₂自动 定量静脉采血管(武汉致远医疗科技有限公司)分别于人工授精后0d和18d 尾静脉采集血液1.5-2ml，2小时内冷藏运输至实验室后立即进行总RNA提取。 人工授精后50-60d进行直肠检查，根据直肠检查的结果将试验牛只分为妊娠牛 19头和空怀牛17头。

1.2总RNA提取与逆转录

利用RNAprep pure血液总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取 血液样本中总RNA，具体步骤参照试剂盒说明书进行。利用NanoDrop 2000超 微量分光光度计(Thermo Scientific)计算RNA样本浓度并进行纯度分析 (OD_260/280＝1.9-2.1)；利用琼脂糖凝胶(1.2％)电泳检测RNA完整性；通过质 检的样本分装后于-80℃保存备用。反转录采用RevertAidTM First-Strand cDNA  Synthesis kit(Fermentas)进行，每个反应RNA用量为500ng，具体步骤参照试 剂盒说明书进行。

1.3牛干扰素刺激基因ISG15、OAS1和RSAD2基因的荧光定量PCR检测

用于荧光定量PCR扩增的预混液(Green Mix)购自东洋纺(上海) 生物科技有限公司，反应体系共20μl：Green 10μl，上下游引物各0.5 μl(10μmol/L)，cDNA模板0.3μl，最后用ddH₂O补至20μl。牛ISG15、OAS1和 内参基因β-Actin引物参考文献报道(1、Gifford C A,Racicot K,Clark D S,et al. Regulation of Interferon-Stimulated Genes in Peripheral Blood Leukocytes in  Pregnant and Bred,Nonpregnant Dairy Cows[J].Journal of dairy science,2007,90: 274-280.2、Green J C,Okamura C S,Poock S E,et al.Measurement of  interferontau(IFN-tau)stimulated gene expression in blood leukocytes for pregnancy  diagnosis within 18-20d after insemination in dairy cattle[J].Anim Reprod Sci,2010, 121:24-33)，RSAD2引物序列根据NCBI中提供的牛RSAD2基因序列 (NM_001045941)，利用软件Primer 5.0设计，具体的引物信息见表1。每个样 本重复3次，定量PCR实验在罗氏480实时荧光PCR仪上进行。 反应条件：95℃预变性60s，95℃变性15s，58-62℃退火15s；72℃延伸30s，共 40个循环；熔解曲线及信号采集：58℃-95℃，0.5℃/s，共10s。

表1定量PCR引物的序列及参数

1.4目的基因的表达量分析

基因相对表达以2^-△△Ct表示样品中目的基因mRNA相对表达量，0d时各基 因的相对表达量较正为1，其他时间点的表达量均为0d时表达量的倍数。

1.5统计分析

ROC曲线是一种全面、准确评价诊断试验的非常有效的方法，是临床用于 评价和比较诊断性试验优劣并确定最佳临界值的理想方法。ROC曲线下的面积 (AUC)被认为是评估一个试验诊断价值的最好的指标，当AUC<0.5时无诊断价 值，AUC在0.5-0.7时有较低准确性，AUC在0.7-0.9时有一定准确性，AUC>0.9 时有较高的准确性。Youden指数是反映诊断试验真实性的综合评价指标，其值 越大，表示该诊断试验在对应诊断临界值的诊断敏感性和特异性上达到最佳平 衡，从而确定该诊断临界值作为诊断试验的截断值。

分别以ISG15基因的相对表达量(ISG15)，OAS1基因的相对表达量(OAS1), RSAD2基因的相对表达量(RSAD2),ISG15+OAS1，ISG15+RSAD2， OAS1+RSAD2以及ISG15+OAS1+RSAD2作阳性诊断，计算出各自的真阳性率 和假阳性率，并用SPSS19.0软件进行ROC分析，绘制ROC曲线图，计算各种 方法的准确性。其中，2个及以上多基因联合诊断时，ROC曲线分析方法参照 刘润幸等人的报道(刘润幸.使用SPSS作多变量观察值的ROC曲线分析[J].中 国公共卫生，2003，19(9)：1151-1152.)。

2结果

2.1总RNA的提取与质量检测结果

从血液中提取总RNA的凝胶电泳结果见图2。从图中可以看到，在凝胶上 显示出两条清晰的条带，分别为28S和18S，表明总RNA无降解。经核酸/蛋白 质浓度测定仪测定，所提取的总RNA在260nm的吸收值与280nm的吸收值之 比值均在1.8-2.0间，表明无蛋白质和其他杂质污染。因此，提取的总RNA质 量完好，可进行逆转录反应用于下一步的定量PCR实验。

2.2定量PCR引物扩增结果

ISG15、OAS1和RSAD2基因的扩增结果见图3。

2.3ISG15、OAS1和RSAD2单基因进行妊娠诊断时的效能

根据ISG15、OAS1和RSAD2单个基因在人工授精后18d的相对表达量及 妊娠诊断的结果建立单个基因用于奶牛早期妊娠诊断的ROC曲线(见图4)。 三个单基因的表达量进行妊娠诊断时的ROC曲线下面积(AUC)排列顺序为 AUC_RSAD2>AUC_ISG15>AUC_OAS1。以Youden指数最大时所对应的临界值作为判断 妊娠的截断值，即ISG15、OAS1和RSAD2基因的相对表达量分别大于或者等于 2.190，1.815和1.152时，对应的诊断敏感性和特异性见表2。

表2单基因进行妊娠诊断的性能分析

2.4ISG15、OAS1和RSAD2多基因联合进行妊娠诊断的效能

多基因联合用于诊断时，ISG15与RSAD2联合应用时ROC曲线面积与 ISG15、OAS1和RSAD2三个基因联合应用时相等，且高于其它两个组合(见图5)。 各组合的最佳临界值、敏感性和特异性见表3。从表3中可以看出，各组的特异 性均达到100％，但是ISG15+RSAD2组合和ISG15+OAS1+RSAD2组合的敏感性 最高，均为0.947，两个组合对应的最佳临界值分别为0.680和0.615。综合考虑 诊断方法的简便性，多基因联合诊断时，ISG15联合RSAD2的诊断价值最高。 ISG15+RSAD2组合应用时，协变量ISG15和RSAD2的Logistic回归系数、标准 误和P值见表4。从表4中可得RSAD2回归方程：P＝1/[1+e^{-(-6.530+2.830X1+0.866X2)}] (X1＝ISG15,X2＝RSAD2)，即当样本中ISG15和RSAD2多基因的相对表达量满 足方程P≥0.680时，该个体被诊断为妊娠。

表3多基因联合进行妊娠诊断的性能分析

表4协变量ISG15和RSAD2的Logistic回归系数、标准误和P值

3结论

干扰素刺激基因ISG15、OAS1和RSAD2的表达量在妊娠18d时发生了显著变 化，通过检测这些干扰素刺激的表达水平可以进行妊娠诊断。本试验通过建立 单个干扰素刺激基因的相对表达量用于妊娠诊断的ROC曲线，结果显示RSAD2 基因的表达量作为妊娠诊断指标时AUC值最高，为0.975，说明诊断的准确性较 高。提示单项指标用于妊娠诊断时，RSAD2的诊断价值最高。但是，试验结果 同时显示，RSAD2的相对表达量用于妊娠诊断时，Youden指数最大为0.882，对 应的灵敏度为100％，而特异性为88.2％。

为了进一步的提高敏感性和特异性，本试验分析了多基因联合检测对于妊 娠的诊断价值。结果显示，与单项检测相比，多基因联合分析可提高诊断的特 异性，各联合诊断组的特异性均为100％，但ISG15+RSAD2组合和 ISG15+OAS1+RSAD2组合的敏感性最高，均为94.7％。基于诊断方法的简便性， 多基因联合诊断时，ISG15联合RSAD2的诊断价值最高。

综上所述，利用干扰素刺激基因的表达对青年牛进行妊娠诊断时，ISG15 与RSAD2基因的表达量联合应用时，诊断的敏感性为94.9％，特异性为100％， 诊断价值最高。另外，本试验结果提示，该组合Youden指数最大为0.947，对 应的诊断临界值0.680可作为妊娠诊断的截断值。对个体的预测方法为：令人工 授精后18d奶牛外周血中ISG15的表达量为X₁，人工授精后18d奶牛外周血 中RSAD2的表达量为X₂，将X₁和X₂带入公式P＝1/[1+e^{-(-6.53+2.830X1+0.866X2)}]中， 如果P值大于0.680时，即为妊娠。

【实施例2】基于定量PCR技术的妊娠诊断方法与孕酮和PAG检测法的比较

1、材料与方法

1.1试验动物及样本采集

实验动物同实施例1，来源于武汉市某规模化奶牛场青年牛36头，于人工 授精后18d，21d和28d尾静脉采集血液5ml，5000rpm离心15min，收集上 清至1.5ml离心管中，-20℃保存。人工授精后50-60d进行直肠检查，根据直 肠检查的结果将试验牛只分为妊娠牛(19头)和空怀牛(17头)。

1.2血清样本孕酮含量测定

孕酮测定使用北京西门子医疗诊断设备有限公司生产的孕酮测定试剂盒， 严格按照试剂盒使用说明进行操作，孕激素测定的标准曲线范围为0-60ng/ml。 1.3血清中PAG蛋白的检测

PAG蛋白的检测使用北京爱德士元亨生物科技有限公司提供的牛怀孕检测 试剂盒(PAG ELISA试剂盒)。将待检血清和牛怀孕检测试剂盒恢复到室温，按 照ELISA试剂盒产品说明书要求进行孵育和操作，检测待检牛的妊娠状况。判断 方法为：血清或EDTA血浆S-N值<0.300，为阴性，表示母牛空怀；血清或EDTA 血浆S-N值≥0.300，为阳性，表示母牛怀孕。其中，S为A(450nm)-A(参考波长) 下测定样本的吸光值，N为阴性对照的平均吸光值。

1.4统计分析

分别以人工授精后18d和21d血清中孕酮含量作阳性诊断，计算出各自的真 阳性率和假阳性率，并用SPSS19.0软件进行ROC分析，绘制ROC曲线图，计算 两种诊断方法的敏感性和特异性，并且将该方法以及牛怀孕检测试剂盒(PAG 检测)同实施例1中的基于定量PCR技术的妊娠诊断方法进行对比分析。

2、结果

2.1孕酮进行妊娠诊断时的效能

利用ROC曲线，将人工授精后18d和21d血清中孕酮含量的检测结果进行分 析，表明以21d血清中孕酮含量作为妊娠诊断指标时ROC曲线下的面积(AUC) 高于18d血清中孕酮含量(图6)。以21d血清中孕酮含量作为依据进行妊娠诊断 时，AUC大于0.9，表明具有较高的准确性(表5)。以Youden指数最大时的临 界点为最佳的诊断切割点，两者诊断的特异性相同，但是21d血清中孕酮含量对 应的敏感度高于18d血清中孕酮含量。因此，利用21d血清中孕酮含量进行妊娠 诊断的价值高于18d血清中孕酮含量。

表5孕酮含量进行妊娠诊断的性能分析

2.2血清中PAG蛋白的检测

试验中经直肠检查确认，妊娠牛只19头，空怀牛只17头。19头妊娠牛只利 用PAG ELISA试剂盒检测，18头奶牛血清样本的S-N值大于0.300，1头奶牛血清 样本的S-N值小于0.300。17头空怀牛只利用PAG ELISA试剂盒检测，结果表明， 16头奶牛血清样本的S-N值小于0.300，1头奶牛血清样本的S-N值大于0.300。因 此，在本次试验中，PAG ELISA试剂盒的敏感性为94.74％，特异性为94.12％。 2.3不同妊娠诊断方法的比较

实施例1表明牛干扰素刺激基因ISG15和RSAD2的表达量联合应用于妊娠诊 断时，诊断的敏感性为94.9％，特异性为100％。本试验中孕酮检测法(21d血清 孕酮含量)的敏感性为88.9％，特异性为94.1％，诊断效能不及ISG15和RSAD2基 因的联合诊断。PAG ELISA试剂盒诊断的敏感性为94.74％，特异性为94.12％， 特异性低于ISG15和RSAD2基因的联合检测。

3、结论

利用干扰素刺激基因的表达量可以在青年牛人工授精后18d进行妊娠诊断， 孕酮检测法在人工授精后21d进行诊断准确性和特异性较高，PAG ELISA试剂盒 在奶牛人工授精后28d可以检测到其是否怀孕。本试验表明基于定量PCR技术的 早期妊娠诊断方法对于青年牛诊断的灵敏度为94.9％，特异性为100％，综合诊断 效能优于孕酮检测法(21d血清孕酮含量)，诊断的特异性高于PAG ELISA检测 法。因此，基于定量PCR技术的早期妊娠诊断方法可以快速而且准确地对青年牛 进行妊娠诊断，可实现在青年牛第一次配种后3周以内排查空怀牛，对其进行再 次人工授精，进而缩短产犊间隔，提高奶牛的繁殖率。