一种用于转基因马铃薯检测的阳性标准质粒

摘要

本发明提供了一种可作为检测转基因马铃薯的阳性标准质粒，是含有SEQIDNO:1～SEQIDNO:3分别所示的核苷酸片段，以及SEQIDNO:4所示的核苷酸片段，由以下方式获得：将SEQIDNo.1所示的抗马铃薯甲虫 cry3A 基因、SEQIDNo.2所示的胭脂碱合成酶启动子（ P-nos ）基因、SEQIDNo.3所示的抗马铃薯Y病毒 PVYCP 基因、SEQIDNo.4所示的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 UGPase 基因通过PCR技术叠加重组而成，命名为pBJGMM003。该阳性标准质粒用于转基因马铃薯的鉴定、检测与监管工作，解决了转基因马铃薯的阳性标准品匮乏等问题，保障了我国转基因马铃薯的相关工作的顺利进行。检测范围涵盖所有已批准转化体及部分在研转基因马铃薯。

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因马铃薯定性检测用标准质粒，具体涉及一种可检测转基因马铃 薯的阳性标准质粒。

背景技术

转基因标准物质严重缺乏

随着转基因作物及相关产品在全世界范围内的迅速发展，其环境安全和食用安全问题 一直受到各国政府和广大消费者及相关检测机构人员的重视。对转基因作物核酸进行监 测、检测，并保证结果的准确、可靠和有效性，需要阳性标准物质的支撑。在保证转基因 检测结果的可比性、溯源性，推进转基因产品检测方法标准化等方面，转基因生物标准物 质发挥着十分重要的作用。

目前国外研制的转基因阳性标准物质的组织或企业主要是欧洲标准物质研究院 (IRMM)和美国的油料化学学会(AOCS)。研制的种类主要包括转基因玉米、大豆、马 铃薯、油菜、棉花、甜菜等50余种。但这与190多种转基因作物种类相比，还远远不够。 我国目前已获的计量认证的转基因检测用标准物质不到10种，质粒阳性标准区区2种。 因此，转基因阳性标准物质的研制和应用成为国内外农业转基因生物安全管理体系建设的 当务之急，也是转基因检测监测的重要技术支撑之一。转基因标准物质的缺乏已成为制约 转基因植物检测技术发展和检测机构建设的瓶颈问题之一。

转基因马铃薯问题广受关注

近几年，部分媒体及网络传言，“美国的土豆削皮、切丝后变黑，可是中国已经没有 这样的土豆了。无论在云南还是北京买，土豆削皮切丝永远不会变色。基本上可以肯定， 全中国城市出售的土豆都是转基因。”虽然，长期研究马铃薯种植技术的专家明确表示， 中国没有转基因马铃薯，我国也从未批准进口转基因马铃薯，但长期以来，国内民众一直 对转基因食品心存戒备，甚至到了"谈转基因色变"的地步。

目前，全球共批准商业化种植的转基因马铃薯31种，即将获批的转基因马铃薯2种， 详见表1。国际上对转基因成分的检测主要是采用以核酸为基础的检测方法。关于转基因 马铃薯，我国目前尚无用于检测的阳性标准物质，因而一定程度上阻碍了我国转基因马铃 薯的检测工作进行。

转基因作物虽然多，但是绝大多数为跨国公司掌握的材料，国内检测机构很难取得， 这就给检测带来了困难。阳性标准质粒的择优采用检测靶标基因片段，构建于质粒框架， 用于转基因检测，解决了材料缺乏的问题。阳性标准质粒近几年已开始用于核酸检测领域， 且具有易于富集，快捷高效等优点。如《耐除草剂转基因大豆质粒标准分子》(中国农业 大学学报，2014)、《DAS-59122-7玉米的鉴定以及结合质粒标准品的品系特异性定量检 测》(农业生物技术学报，2013)、《转cry1Ab基因棉花质粒标准分子的构建与分析》 (中国生物防治学报，2013)、《转基因大豆MON89788质粒分子》(中国专利，专利 号201010106138)等等。

本发明针对转基因马铃薯检测中因缺乏标准物质而产生的瓶颈问题，经过科学的调 研、选择及克隆等步骤，发明了用于转基因马铃薯检测的阳性标准质粒，能筛选检测现行 批准的所有转基因马铃薯(31)种，和即将获批的转基因马铃薯2种。此阳性标准质粒检 测范围广，兼备性能稳定、易于制备、成本低等优点。

表1国际上转基因马铃薯信息汇总表

注：表中1～31在国际上已获批种植；32和33即将获批种植。

发明内容

本发明的目的是构建一种可作为检测转基因马铃薯的阳性标准质粒，在转基因马铃薯 筛选检测时，用其作为阳性参照物质，可检测多种转基因马铃薯，达到覆盖面积广的目的。

本发明通过调研国际转基因马铃薯的功能基因、元件信息、筛选标记等分子特征，得 到了可以全面覆盖国际上已获批转化体的组合元件，包括抗马铃薯甲虫基因Cry3A、胭脂 碱合成酶启动子P-nos、抗马铃薯Y病毒基因PVYCP等3个外源基因；还确定了内标准基 因尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase。

上述外源插入基因和内标准基因的序列号及所含核苷酸片段如表2所示：

表2外源插入基因和内标准基因的序列号、引物号

因此，本发明的技术方案是：

一种用于转基因马铃薯定性检测的阳性标准质粒，含有SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3 分别所示的3个外源插入核苷酸片段，且含有SEQ ID NO:4的1个内标准基因核苷酸片段。

本发明经过PCR扩增验证，结果证明上述构建的阳性标准质粒可作为转基因马铃薯 筛选检测时阳性对照品。

该阳性标准质粒可在转基因马铃薯定性筛选检测时作为阳性对照物质，解决了阳性标 准品的缺乏问题。

所述4个核苷酸片段可以任意顺序连接，共同构建于pEASY-Blunt Zero载体。

上述Cry3A、P-nos、PVYCP等3个外源调控元件分别由SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10～SEQ ID NO:11等3对引物分别进行特异性 扩增，内标准基因UGPase由SEQ ID NO:12～SEQ ID NO:13等1对引物分别进行特异性 扩增，将以上4个扩增片段以任意顺序进行组合叠加获得含有这个片段的核酸片段，其段 先的序列如SEQ ID NO:5所示。

所用引物的序列号具体见表2。

本发明具有以下有益效果：

本发明得到的阳性标准质粒是严格按照计量标准《JJF 1006-1994一级标准物质技术 规范》制备、均匀性和稳定性测定、量值及试用评价的。该质粒可用于转基因马铃薯定性 筛选、监测中，作为转基因检测用的阳性对照物质或阳性标准品，解决了转基因马铃薯的 阳性标准品匮乏等问题，保障了我国转基因马铃薯的相关工作的顺利进行。

由于本发明的质粒分子含有3种不同的外源检测元件、1种内标准基因，通过外源基 因和内标准基因的不同组合，可用于检测已获批的全部转基因马铃薯。同时，在转基因马 铃薯的检测、监管或境外相关产品非法入境等方面提供了重要的技术支持。

附图说明

图1是在本发明的一种实施方式中，构建的转基因马铃薯定性检测用质粒 pBJGMM003构建物理图。质粒分子大小为4994bp，C3A为抗马铃薯甲虫基因片段，P-n 为胭脂碱合成酶启动子片段，PVYCP为抗马铃薯Y病毒，UGP为尿苷二磷酸葡萄糖焦磷 酸化酶片段，Amp为氨苄青霉素抗性筛选标记。

图2是pBJGMM003质粒标准分子验证的电泳图，其中，M为100bp marker；1为内 标准基因UGPase(89bp)；2、3、4分别为调控元件P-nos(183bp)、PVYCP(269bp)、 Cry3A(499bp)。

具体实施方式

实施例1标准分子构建

1、目标基因序列查找及引物设计

通过查阅转基因马铃薯转化元件的相关资料，选取使用频率较高的调控元件和标记基 因(外源基因)序列片段(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3)；选取单拷贝内 标准基因片段(SEQ ID NO:4)，作为内标准基因。

由于本申请中所涉及的引物、扩增子序列对应的检测方法已通过循环试验，得到有效 性验证。本实验需要的所有引物，由上海生工合成。引物序列，扩增产物大小及来源如表 3。

表3外源基因和内标准基因引物

2、目标DNA片段的获得与标准分子构建

按照表2中所述的核酸序列引物，通过基因融合叠加的方式，分别获得序列SEQ ID  NO:1～4。将这两段核酸序列连接后，再与克隆载体pEASY-Blunt Zero的T位点连接，从而 得到质粒标准分子，命名为pBJGMM003。质粒图谱及质粒分子大小见图1。

质粒分子通过三家国内测序实验室，即上海英潍捷基生物技术有限公司、生工生物工 程有限公司和北京诺赛基因组研究中心完成测序验证。三家实验室均采用Applied  Biosystems 3730/xl遗传分析仪测序，测序结果表明pBJGMM003质粒分子中的基因片段均 以单拷贝形式连入。

实施例2阳性标准质粒验证

1、测序验证：

质粒分子通过三家国内测序实验室，即上海英潍捷基生物技术有限公司、生工生物工 程有限公司和北京诺赛基因组研究中心完成测序验证。三家实验室均采用Applied  Biosystems 3730/xl遗传分析仪测序，测序结果表明pBJGMM003质粒分子中的基因片段均 以单拷贝形式连入。

2、PCR扩增验证：

标准质粒验证：

利用上述引物对标准质粒pBJGMM003的外源插入基因进行验证，检验构建质粒是否 扩增预期的所有片段。PCR反应体系见表4。PCR仪器：AB公司9700。反应程序为：94℃ 变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35次循环；72℃ 延伸7min。

结果如图2，外源插入基因和内标准基因均可被检测到。

表4PCR检测反应体系

实施例3 pBJGMM003质粒分子标准物质特性

参照JJF 1006-1994一级标准物质技术规范要求，对阳性标准质粒pBJGMM003进行 了分装、均匀性检验、稳定性考察和适用性研究，结果如下：

1、质粒分子标准物质的分装和保存

将制备的质粒稀释到5.00×10⁵拷贝/μL进行分装。分装的质粒500μL/单元，共500单 元。将分装的质粒置于塑料盒中，每盒50单元，将分装的质粒分子标准物质保存于-70℃ 冰箱。

2、均匀性检验

均匀性分析方法：采用PCR方法，在500单元中随机取样15单元扩增外源基因和内 标准基因。在DNA序列的固有特征一致的前提下，实验证明批次间的序列比值没有差异。 通过琼脂糖凝胶电泳，表明所取全部样品均有阳性扩增，证明了样品均匀性良好。

3、稳定性考察

分别存储在-20℃、4℃、25℃和37℃，保存0、7、14、28天，每个时间点在每个温 度下各取3单元，每单元设置3个平行反应(N＝3，n＝3)。以存储在-70℃的做参照，通 过PCR对基因片段进行分析。结果表明，质粒分子标准物质在检测期间内均处于稳定状 态。

4、适用性

标准物质的适用性研究是用研制的标准物(包括标准样品、标准分子或标准器等等) 检测或测定已知结果的实际样品，以验证该标准物的可行性和有效性。

在本发明的适用性研究实验中，是采用本发明所得的pBJGMM003的外源基因元件与 内标准基因对有产业化前景的转基因马铃薯样品进行适用性验证。

所用的马铃薯样品为：EH92-527-1及6种非转基因马铃薯。

结果表明，pBJGMM003质粒分子均能正确鉴定出转基因马铃薯对应的外源元件及内 标准基因，及非转基因马铃薯的内标准基因。因此证明了此阳性质粒标准适用于转基因马 铃薯筛选、检测。

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120>一种用于转基因马铃薯检测的阳性标准质粒

<160> 13

<210> 1

<211>499

<212> DNA

<400> 1

AAGCCCTCGACAGTTCTACCACTAAGGATGTTATCCAGAAGGGTATCTCCGTTGTGGGAGACCTCTTGGGCGTGGTTGGATTTCCCTTCGGTGGAGCCCTCGTGAGCTTCTATACAAACTTTCTCAACACCATTTGGCCAAGCGAGGACCCTTGGAAAGCATTCATGGAGCAAGTTGAAGCTCTTATGGATCAGAAGATTGCAGATTATGCCAAGAACAAGGCTTTGGCAGAACTCCAGGGCCTTCAGAACAATGTGGAGGACTACGTGAGTGCATTGTCCAGCTGGCAGAAGAACCCTGTTAGCTCCAGAAATCCTCACAGCCAAGGTAGGATCAGAGAGTTGTTCTCTCAAGCCGAATCCCACTTCAGAAATTCCATGCCTAGCTTTGCTATCTCCGGTTACGAGGTTCTTTTCCTCACTACCTATGCTCAAGCTGCCAACACCCACTTGTTTCTCCTTAAGGACGCTCAAATCTATGGAGAAGAGTGGGGATACGA

 

<210> 2

<211>183

<212> DNA

<400> 2

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TAA

 

<210> 3

<211>269

<212> DNA

<400> 3

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<210> 4

<211>89

<212> DNA

<400> 4

CCTACCTCTACCCCTCCTGCGTACCCCCTACCACCATTACCTCGCACCTCCTCACTGGGGCGTCTGCAGCTCCGTCTCTTCACATGTCC

 

<210> 5

<211> 1040

<212> DNA

<400> 5

AAGCCCTCGACAGTTCTACCACTAAGGATGTTATCCAGAAGGGTATCTCCGTTGTGGGAGACCTCTTGGGCGTGGTTGGATTTCCCTTCGGTGGAGCCCTCGTGAGCTTCTATACAAACTTTCTCAACACCATTTGGCCAAGCGAGGACCCTTGGAAAGCATTCATGGAGCAAGTTGAAGCTCTTATGGATCAGAAGATTGCAGATTATGCCAAGAACAAGGCTTTGGCAGAACTCCAGGGCCTTCAGAACAATGTGGAGGACTACGTGAGTGCATTGTCCAGCTGGCAGAAGAACCCTGTTAGCTCCAGAAATCCTCACAGCCAAGGTAGGATCAGAGAGTTGTTCTCTCAAGCCGAATCCCACTTCAGAAATTCCATGCCTAGCTTTGCTATCTCCGGTTACGAGGTTCTTTTCCTCACTACCTATGCTCAAGCTGCCAACACCCACTTGTTTCTCCTTAAGGACGCTCAAATCTATGGAGAAGAGTGGGGATACGAGCCGTTTTACGTTTGGAACTGACAGAACCGCAACGTTGAAGGAGCCACTCAGCCGCGGGTTTCTGGAGTTTAATGAGCTAAGCACATACGTCAGAAACCATTATTGCGCGTTCAAAAGTCGCCTAAGGTCACTATCAGCTAGCAAATATTTCTTGTCAAAAATGCTCCACTGACGTTCCATAACTCAGATGTTGCAGAAGCGTATATAGAAATGCGCAACAAGAAGGAACCATATATGCCACGATATGGTTTAGTTCGTAATCTGCGCGATGGAAGTTTGGCTCGCTATGCTTTTGACTTTTATGAAGTTACATCACGGACACCAGTGAGGGCTAGAGAGGCACACATTCAAATGAAGGCCGCAGCTTTAAAATCAGCTCAATCTCGACTTTTCGGATTGGATGGTGGCATTAGTACACAAGAGGAAAACACAGAGAGGCACACCACCGAGGCCTACCTCTACCCCTCCTGCGTACCCCCTACCACCATTACCTCGCACCTCCTCACTGGGGCGTCTGCAGCTCCGTCTCTTCACATGTCC

 

<210> 6

<211>19

<212> DNA

<400> 6

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GCCGTTTTACGTTTGGAACTG

 

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<212> DNA

<400> 13

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