一种采用苏云金芽孢杆菌降解磷酸三(2-氯乙基)酯的方法

摘要

本发明涉及一种采用苏云金芽孢杆菌降解磷酸三(2-氯乙基)酯的方法，包括：在30℃条件下，将苏云金芽孢杆菌接种于磷酸三(2-氯乙基)酯降解培养基中，恒温摇床降解培养后，采用气相色谱质谱联用法(GC-MS)测定培养液中残留的磷酸三(2-氯乙基)酯浓度，以此分析该菌株对磷酸三(2-氯乙基)酯的降解效果。此方法对环境适应性强，对有机磷系阻燃剂降解的程度较高，且成本较其他方法低。

说明书

技术领域

本发明属于微生物降解有机污染物的领域，特别是涉及一种采用苏云金芽孢杆菌降解磷酸三(2-氯乙基)酯的方法。 

背景技术

有机磷系阻燃剂具有良好的阻燃性能，与聚合物基材相容性好，具有耐水、耐热以及耐迁移等特点，常作为电子/电器、家具、纺织等材料中的添加型阻燃剂。当前，含有机磷系阻燃剂的产品在生产、使用以及废弃回收处理过程中，其极易从这些产品中逃逸挥发并进入周围环境中,继而扩散分布在各种环境介质中。目前，有机磷系阻燃剂已是污水中的常见污染物，普遍认为污水处理厂的出水是地表水中有机磷系阻燃剂的主要来源；在没有明显污染源的农业地区，地表水中的有机磷系阻燃剂的污染主要来源于覆盖温室大棚的塑料薄膜；垃圾渗滤液中的有机磷系阻燃剂是地下水甚至也是海水中有机磷系阻燃剂的主要来源。目前随着溴系阻燃剂的限用和禁用，有机磷系阻燃剂的产量呈现逐年增加的趋势。由于有机磷系阻燃剂具有显著的毒理效应，环境中有机磷系阻燃剂污染及风险评估已经成为环境领域的研究热点。磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)是最常用的一类有机磷系阻燃剂，现已越来越受到人们的关注。 

目前，对有机磷系阻燃剂降解方法的研究大多都集中在物理化学方法和微生物降解法，从降解效果、二次污染、处理成本、适用性范围等多方面考虑，微生物降解法无疑是最佳的选择。有机磷系阻燃剂的微生物降解方法主要包括厌氧降解和好氧降解两种。厌氧降解反应时间长，而好氧降解反应时间短，微生物种类多，且对有机磷系阻燃剂降解的程度较高。从降解效果、工艺成本、条件控制等多方面综合比较，有机磷系阻燃剂的好氧微生物降解方法体现出了一定的优越性，且已经被广泛应用。但在实际应用中，好氧微生物降解有机磷系阻燃剂的效率往往不高，所以有机磷系阻燃剂好氧降解菌的筛选及应用仍具有一定的研究意义。由于微生物对环境的适应性强，且污染过程经历一段自然驯化期，因而可以通过驯化从自然环境中筛选到能够降解某种污染物的降解菌株。 

发明内容

本发明的目的是提供一种采用苏云金芽孢杆菌降解磷酸三(2-氯乙基)酯的方法，通过苏云金芽孢杆菌对磷酸三(2-氯乙基)酯的降解，为其污染治理和应用提供技术方法。 

本发明的一种采用苏云金芽孢杆菌降解磷酸三(2-氯乙基)酯的方法，包括： 

(1)将苏云金芽孢杆菌菌种接到装有已灭菌的富集培养基中，在摇床中培养； 

(2)然后接种于磷酸三(2-氯乙基)酯降解培养基中在摇床中培养； 

(3)培养液中的磷酸三(2-氯乙基)酯经气相色谱质谱联用法测定，分析该菌株对磷酸三(2-氯乙基)酯的降解效果。 

步骤(1)所述的富集培养基组成为：10g/L鱼粉蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/LNaCl，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.2。 

步骤(1)所述的培养条件为温度30℃，转速120rpm，培养48h。 

步骤(2)所述的磷酸三(2-氯乙基)酯降解培养基组成为：0.2g/L NaCl，1g/L(NH4)₂SO₄，0.2g/L MgSO₄·7H₂O，0.02g/L CaCl₂·2H₂O，0.01g/L FeCl₂，0.01g/L MnSO₄，40mg/L磷酸三(2-氯乙基)酯，蒸馏水1000mL。 

步骤(2)所述的降解磷酸三(2-氯乙基)酯的条件为pH＝6.8～7.2，温度30℃，摇床的转动频率120rpm，培养7天。 

所述苏云金芽孢杆菌是从污水处理厂的活性污泥中筛选出来的，此菌株属于微杆菌科(Microbacteriaceae)，该菌株的驯化采用梯度增加污染物浓度的驯化方法进行驯化培养，在无机盐培养基MSM(0.2g/L NaCl，1g/L(NH4)₂SO₄，0.2g/L MgSO₄·7H₂O，0.02g/L CaCl₂·2H₂O，0.01g/L FeCl₂，0.01g/L MnSO₄，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.2)中加入磷酸三(2-氯乙基)酯-丙酮溶液，配制磷酸三(2-氯乙基)酯浓度梯度为5、10、15、20、30、40、60mg/L的驯化培养基，采用梯度增加污染物浓度的驯化方法进行驯化培养。该菌落为圆形，边缘整齐，淡黄色，光滑，湿润，凸起；菌体呈微杆状，革兰氏染色阳性，菌体周围有粘液层包裹。 

在此条件下降解培养7天，磷酸三(2-氯乙基)酯的降解率达到82.25％。 

有益效果

此方法对环境适应性强，对有机磷系阻燃剂降解的程度较高，且成本较其他方法低。 

附图说明

图1是苏云金芽孢杆菌所属种群系统树； 

图2是磷酸三(2-氯乙基)酯标准样品的GC-MS图； 

图3是磷酸三(2-氯乙基)酯的总离子流图； 

图4是降解培养基(DM)中苏云金芽孢杆菌对磷酸三(2-氯乙基)酯的降解曲线。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

实施例1 

1、菌株的分离 

(1)采集污水处理厂的活性污泥，置于一个长31.2cm，宽22.0cm，高22.5cm的玻璃驯化装置，在不加营养物质，没有进水出水交换的基础上用空压机不间断曝气3天。然后进行换水，排出装置中大约10L的泥水混合物，加入营养液并进行不间断曝气。在培养了10天后在加入营养液的同时开始加入磷酸三(2-氯乙基)酯-丙酮溶液，保持装置中磷酸三(2-氯乙基)酯浓度在1ppm左右，并按照SBR工艺(进水、曝气、静置、排水和闲置)进行驯化培养，隔天换水，培养驯化一个月。培养液的配制：0.6g/L葡萄糖、0.8g/L无水乙酸钠、0.3g/L酵母粉、0.283g/L NH4Cl、0.07g/L K2HPO4·3H2O、0.022g/L KH2PO4。配制成大约10升左右的营养液。 

(2)将驯化后的水样沉淀30分钟后，用移液枪移取上清液1mL于装有100mL富集培养基的250mL灭菌锥形瓶中，放在摇床上培养。摇床转速为120rpm，温度为30℃。富集培养基EM(Enrichment Medium)的主要成分为：10g/L鱼粉蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/LNaCl，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.2。 

(3)在无菌条件下移取富集培养基的混浊菌液1mL于装有100mL驯化培养基的250mL灭菌锥形瓶中，放入摇床中，利用磷酸三(2-氯乙基)酯作为唯一碳源进行以7天为一个周期的逐渐增加污染物浓度的驯化方法进行驯化培养。摇床转速为120rpm，温度为30℃，培养时间为两个月。在无机盐培养基MSM(0.2g/L NaCl，1g/L(NH4)2SO4，0.2g/L MgSO4·7H2O，0.02g/L CaCl2·2H2O，0.01g/L FeCl2，0.01g/L MnSO4，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.2)中加入磷酸三(2-氯乙基)酯-丙酮溶液，配制磷酸三(2-氯乙基)酯浓度为5、10、15、20、30、40、60mg/L的驯化培养基。 

(4)取驯化两个月后最后一个周期的驯化培养基1mL，按10倍稀释法，用无菌水将菌液作10-1～10-7梯度稀释。每种稀释浓度分别取0.1mL菌液均匀涂布于固体培养基上，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养。固体培养基的主要成分为：0.2g/L NaCl，1g/L(NH4)2SO4，0.2g/L MgSO4·7H2O，0.02g/L CaCl2·2H2O，0.01g/L FeCl2，0.01g/L MnSO4，60mg/L磷酸三(2-氯乙基)酯，20g/L琼脂，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.2。 

(5)待长出单菌落后，观察各菌落形态，挑取形态清晰的单一菌落，编号，在分离培养基上划线分离，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养48h，再观察结果。反复5～7次，并在电子显微镜下观察，确保是纯的单一菌株后，将其标记为H-1，并将其接种到固体斜面培养基上，4℃下保存于冰箱中，待后续进行降解试验。分离培养基SM(Separate Medium)的主要成分为：10g/L鱼粉蛋白胨，5g/L酵母粉，5g/L NaCl，60mg/L磷酸三(2-氯乙基)酯，20g/L琼脂，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.2。固体斜面培养基和分离培养基的成分相同。 

2、菌株的鉴定 

(1)菌体及菌落形态特征 

菌株个体为微杆状，革兰氏染色阳性，菌体周围有粘液层包裹；其菌落为圆形，边缘整齐，淡黄色，光滑，湿润，凸起。 

(2)菌体的16S rDNA序列 

通过16S rDNA序列测定和分析比较，该序列与Bacillus thuringiensis的16S rDNA序列的同源性达到99％，确定该菌株为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。该菌株已于2014年6月30日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.9399，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。 

实施例2 苏云金芽孢杆菌对磷酸三(2-氯乙基)酯的降解分析 

在无菌条件下，将苏云金芽孢杆菌接种到装有已灭菌的100mL富集培养基的250mL锥形瓶中，置于恒温摇床内，30℃，120rpm，培养48h。富集培养基EM(Enrichment Medium)的主要成分为：10g/L鱼粉蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/LNaCl，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.2。 

将富集培养的菌液于10mL灭菌离心管中，以6000r/min的转速离心10min后收集菌体并用无菌生理盐水反复洗涤并离心2～3次，最后以等体积的生理盐水重悬配成一定浓度的菌悬液，按10％的量接种于磷酸三(2-氯乙基)酯降解培养基中进行降解实验，样品经GC-MS测定，分析该菌对磷酸三(2-氯乙基)酯的降解效果。磷酸三(2-氯乙基)酯降解培养基DM(Degradation Medium)的主要成分为：0.2g/L NaCl，1g/L(NH4)2SO4，0.2g/L MgSO4·7H2O，0.02g/L CaCl2·2H2O，0.01g/L FeCl2，0.01g/L MnSO4，40mg/L磷酸三(2-氯乙基)酯，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.2。 

TCEP浓度采用GC-MS法进行测定，分析条件如下： 

(1)气相色谱条件 

色谱柱：HP-5(30.0m×0.25mm×0.25m)； 

升温程序：初温90℃，以10℃/min升至230℃，保持10min； 

载气：高纯氦气，纯度大于99.999％； 

恒流控制：1.0mL/min； 

模式：不分流进样； 

进样量：1L； 

进样口温度：250℃。 

(2)质谱条件 

离子源：EI，70eV，温度230℃； 

四极杆温度：150℃； 

接口温度：270℃； 

溶剂延迟时间：5min； 

扫描质量范围：m/z 35-350amu； 

TCEP的特征峰：11.73min； 

特征离子：249，如图3。 

先用磷酸三(2-氯乙基)酯-丙酮溶液作为标准样品，并以色谱级丙酮为对照，测得样品中的磷酸三(2-氯乙基)酯在11.73min左右处出现波峰(如图2)。确定了磷酸三(2-氯乙基)酯标准样品的出峰时间，就可以进一步分析磷酸三(2-氯乙基)酯的降解效果。同时，配制磷酸三(2-氯乙基)酯浓度为5、10、15、20、40、60、80mg/L的磷酸三(2-氯乙基)酯-丙酮标准溶液，绘制磷酸三(2-氯乙基)酯浓度-峰面积标准曲线，此标准曲线为：y＝5×106x-1×107，R2＝0.9983。以向降解培养基(DM)中接种在ZY-6菌作为实验组，接种灭活的ZY-6菌为对照组，通过对实验组和对照组的GC-MS图比较，可以得到磷酸三(2-氯乙基)酯的初始浓度为40mg/L,最终浓度为7.10mg/L，降解效率为82.25％。