三(2-氯乙基)磷酸酯致肝细胞毒性的分子调控机制

摘要

三（2-氯乙基）磷酸酯（tris(2-chloroethyl) phosphate，TCEP）是一种常用的阻燃剂和增塑剂。由于TCEP以非共价键的方式结合在高分子材料中，因而极易逸出进入环境。目前，环境样品（室内空气、饮用水和室内灰尘等）和生物样品（斑马鱼、海鸥和人母乳）中已检出 TCEP。实验研究表明，TCEP有神经毒性、生殖毒性和内分泌毒性，并可致小鼠肝脏肿瘤。但是，TCEP致肝毒性作用的机制仍不清楚。
　　外源性毒物侵入机体后常诱导过量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的生成，继而导致蛋白质、DNA、多醣体和脂类等大分子物质的损伤。线粒体是内源性ROS产生与代谢的主要场所，最先受ROS攻击，因而影响细胞的正常分裂和生长，导致细胞的正常生理功能发生紊乱。在调节细胞生长的多条信号通路中，PI3K/Akt/mTOR通路是重要的信号通路之一。PI3K被ROS激活后可使膜磷酸肌醇发生磷酸化，继而与Akt的PH区结合促发Akt磷酸化,促发Akt下游分子事件来调节细胞的分裂与生长。
　　不可逆的细胞生长阻滞是细胞衰老的重要表型。氧化应激、线粒体损伤、端粒变短和DNA损伤等经p53-p21-Rb信号通路、DNA损伤反应信号通路和NFκB信号通路调控导致细胞衰老。本文旨在研究 TCEP的肝细胞毒性、线粒体毒性以及PI3K/Akt/mTOR通路和p53-p21-Rb通路在TCEP致肝细胞生长阻滞中的调控机制，为阐明TCEP致肝毒性的分子机制提供科学依据。
　　第一部分 TCEP致肝细胞毒性的研究
　　目的：研究TCEP的肝细胞毒性。
　　方法：用TCEP（3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L和200.00mg/L）和DMSO（终浓度<0.1％，溶剂对照）分别处理张氏人肝细胞、人胚肝细胞（L02）和人肝肿瘤细胞（HepG2）24h和48h。检测细胞活力、乳酸脱氢酶释放率、细胞色素P4501A1和3A4酶活力、评价细胞氧化应激（包括胞内ROS、丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和还原型胱甘肽/氧化型谷胱甘肽）以及细胞增殖率、细胞周期分布和凋亡率。
　　结果：①TCEP处理三种细胞株24h和48h，张氏人肝细胞所有处理组的细胞活力均下降（P<0.05或P<0.01），但L02细胞仅有200mg/L TCEP处理组的细胞活力分别降至81.64%（P<0.05）和75.80%（P<0.01），HepG2细胞仅在200.00mg/L TCEP处理组细胞活力降至87.30%（P<0.05）和88.49%（P<0.01）；②TCEP处理张氏肝细胞24h，所有处理组细胞LDH释放率升高（P<0.05），在48h仅200mg/L TCEP的细胞LDH释放率为0.48（P<0.05）。TCEP处理L02细胞24h，所有处理组细胞LDH释放率升高（P<0.05或P<0.01），在48h，≥50.00mg/L处理组细胞LDH释放率均升高（P<0.05或P<0.01）。TCEP处理HepG2细胞24h，所有处理组细胞LDH释放率均升高（P<0.05）），在48h，≥12.50mg/L处理组细胞LDH释放率升高（P<0.05或P<0.01）；③TCEP处理张氏肝细胞24h，仅200.00mg/L处理组的胞内ROS水平升高（P<0.05）。TCEP处理L02细胞24h，仅200.00mg/L处理组的胞内ROS水平升高（P<0.05），在48h，50.00mg/L和200.00mg/L处理组的胞内ROS水平升高（P<0.05）。TCEP处理HepG2细胞24h，50.00mg/L和200.00mg/L处理组胞内ROS水平升高（P<0.05），但在48h，仅200.00mg/L处理组胞内ROS水平升高（P<0.05）；④TCEP处理张氏肝细胞24h和48h，≥12.50mg/L处理组GSH/GSSG比值均升高（P<0.05或P<0.01）。TCEP处理L02细胞24h，仅200.00mg/L处理组的GSH/GSSG比值升高（P<0.05），但在48h所有处理组GSH/GSSG比值均无显著性变化。TCEP处理HepG2细胞24h和48h，所有处理组GSH/GSSG比值均升高（P<0.05或P<0.01）；⑤TCEP处理张氏肝细胞24h，≥12.50mg/L处理组的细胞增殖均受抑制（P<0.05或P<0.01），不过在48h则所有处理组细胞增殖均受抑制（P<0.05或P<0.01）。TCEP处理L02细胞24h和48h，所有处理组细胞增殖均受抑制（P<0.05或P<0.01）。TCEP处理HepG2细胞24h和48h，仅200.00mg/L TCEP处理组细胞增殖受到抑制（P<0.05）；⑥TCEP处理三个细胞株24和48h,所有处理组均未见细胞凋亡。但TCEP处理张氏细胞24h，3.12mg/L和50.00mg/L处理组细胞周期均阻滞在G2/M期（P<0.05），在48h所有处理组细胞周期均阻滞在G2/M期（P<0.05或P<0.01）。TCEP处理L02细胞24h，3.12mg/L和200.00mg/L处理组细胞周期阻滞在G2/M期（P<0.05），在48h所有处理组均未见细胞周期分布变化。TCEP处理HepG2细胞24h，除200.00mg/L外，其他处理组细胞周期均阻滞在G2/M期（P<0.05或P<0.01），在48h仅200.00mg/L处理组细胞周期阻滞在G0/G1期（P<0.05）。
　　结论：TCEP导致了肝细胞氧化抗氧化失衡，抑制了细胞生长，但未致细胞凋亡。
　　第二部分 TCEP促发线粒体信号通路致细胞生长阻滞的调控机制
　　目的：研究线粒体、Sirtuins及PI3K/Akt/mTOR通路在TCEP致肝细胞生长阻滞的调控机制，并揭示SIRT1在TCEP致L02细胞和HepG2细胞生长抑制中的调控机制。方法：用TCEP（3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L和200.00mg/L）和DMSO（终浓度<0.1%，溶剂对照）分别处理L02细胞和HepG2细胞24h和48h，评价细胞线粒体功能（线粒体内ROS水平、线粒体膜电位、线粒体DNA拷贝数目、细胞内ATP水平和胞内游离Ca2+水平）、Sirtuins蛋白的mRNA和蛋白表达水平以及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达。用SIRT1抑制剂EX-527与TCEP共处理细胞，测定细胞增殖率和PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白的表达。
　　结果：①TCEP分别处理L02细胞和HepG2细胞24h和48h，两个细胞株的所有处理组细胞生长率均降低（P<0.05或P<0.01）；②TCEP处理L02细胞24h，≥12.50mg/L处理组胞内T-AOC水平均升高（P<0.05或P<0.01），在48h，则≥50.00mg/L处理组胞内T-AOC水平升高（P<0.05或P<0.01）。TCEP处理HepG2细胞24h，≥50.00mg/L处理组的胞内T-AOC水平均升高（P<0.05），在48h，≥3.12mg/L处理组胞内T-AOC水平均升高（P<0.05或P<0.01）；③TCEP处理L02细胞24h和48h，仅在48h发现50.00mg/L和200.00mg/L TCEP处理组胞内mtROS水平升高（P<0.05，P<0.01）。TCEP处理HepG2细胞24h和48h，≥12.50mg/L TCEP处理组胞内mtROS含量均升高（P<0.05，P<0.01）；④TCEP处理L02细胞和HepG2细胞24h和48h，两个细胞株所有处理组的mtDNA数目均下降（P<0.05或P<0.01）；⑤TCEP处理L02细胞和HepG2细胞24h和48h，两个细胞株都仅在24h可见所有处理组MMP下降（P<0.05或P<0.01）；⑥TCEP处理L02细胞24h和48h，仅200.00mg/L处理组胞内ATP水平降低（P<0.05）。TCEP处理 HepG2细胞24h，50.00mg/L和200.00mg/L处理组胞内 ATP水平降低（P<0.05），但在48h各处理组未见胞内ATP水平的变化（P>0.05）；⑦TCEP处理L02细胞24h和48h，50.00mg/L和200.00mg/L TCEP处理组胞内游离 Ca2+水平均升高（P<0.05，P<0.01）。TCEP处理HepG2细胞24h和48h，在24h仅200.00mg/L TCEP处理胞内游离Ca2+水平升高（P<0.05），但在48h可见50.00mg/L和200.00mg/L TCEP处理组胞内游离 Ca2+水平均升高（P<0.01）；⑧TCEP处理 L02和HepG2细胞24h，>3.12mg/L处理组SIRT1基因mRNA表达均上调（P<0.05或P<0.01），在48h所有处理组的SIRT1基因mRNA表达均上调（P<0.05或P<0.01）；⑨TCEP处理L02细胞24h和48h，所有处理组SIRT2基因mRNA表达下调（P<0.05或P<0.01）。TCEP处理HepG2细胞24h和48h，>3.12mg/L处理组SIRT2基因mRNA表达下调（P<0.05或P<0.01）；⑩TCEP处理L02细胞24h，所有处理组SIRT3基因mRNA表达均下调（P<0.05或P<0.01），在48h，>3.12mg/L处理组SIRT3基因mRNA表达均下调（P<0.05或P<0.01）。TCEP处理HepG2细胞24h，所有处理组SIRT3基因mRNA表达均下调（P<0.05或P<0.01），在48h，>3.12mg/L处理组SIRT3基因mRNA表达均下调（P<0.05或P<0.01）；○11 TCEP处理L02细胞24h和48h，所有处理组SIRT1蛋白表达均上调，但是SIRT3蛋白表达均下调，不过仅在200mg/L TCEP处理组可见SIRT2蛋白表达下调。TCEP处理HepG2细胞24h和48h，所有处理组细胞SIRT1蛋白表达均上调，但SIRT3蛋白表达均下调，SIRT2蛋白表达变化不明显；○12 TCEP处理L02细胞24h，≥12.5mg/L处理组SIRT1蛋白表达均上调（P<0.05或P<0.01），在48h，所有处理组SIRT1蛋白表达均上调（P<0.05或P<0.01）。TCEP处理HepG2细胞24h和48h，所有处理组SIRT1蛋白表达均上调（P<0.05或P<0.01）；○13 TCEP处理L02细胞24h和48h，≥12.50mg/L处理组mTOR、p-mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达均下调。TCEP处理HepG2细胞24h和48h，所有处理组mTOR、p-mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达均下调；○14 TCEP处理L02细胞24h，≥50.00mg/L处理组的细胞增殖受抑制（P<0.05或 P<0.01），在48h，≥12.50mg/L处理组细胞增殖均受抑制（P<0.05或P<0.01）。TCEP与EX-527共处理L02细胞24h和48h，所有处理组的细胞增殖均受抑制（P<0.01）。TCEP处理HepG2细胞24h，≥12.50mg/L处理组细胞增殖均受抑制（P<0.05或P<0.01），在48h仅200.00mg/L处理组细胞增殖受抑制（P<0.05）。TCEP与EX-527共处理HepG2细胞24h，≥12.50mg/L处理组细胞增殖均受抑制（P<0.05或 P<0.01），在48h，所有处理组细胞增殖均受抑制（P<0.05或 P<0.01）；○15 TCEP和EX-527共处理L02细胞24h和48h，所有处理组mTOR、p-mTOR、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达均下调。TCEP和EX-527共处理HepG2细胞24h和48h，所有处理组mTOR、p-mTOR、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达均下调。
　　结论：TCEP致肝细胞线粒体损伤及线粒体功能紊乱，消弱 SIRT1非依赖性PI3K/Akt/mTOR信号通路，最终导致肝细胞生长阻滞。
　　第三部分 TCEP激活p53非依赖p21/Rb通路致细胞衰老样生长阻滞的调控机制
　　目的：研究TCEP致肝细胞衰老及其p53-p21-Rb信号通路的调控机制。
　　方法：用RNA干扰技术沉默L02细胞中p53蛋白表达，建立L02-p53细胞模型。用TCEP（3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L和200.00mg/L）和DMSO（终浓度<0.1%，溶剂对照）分别处理L02细胞、L02-p53细胞和Hep3B（p53缺失细胞株）细胞24h和48h，对比性研究衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）阳性细胞率，IL-6分泌水平，以及p53、MDM2、Rb、p-Rb、Ras、p21、IL6R、p38MAPK、p-p38MAPK、NFkB和p-NFkB蛋白表达。
　　结果：①TCEP处理 L02细胞24h和48h，所有处理组的 SA-β-Gal阳性细胞率升高（P<0.05或P<0.01）。TCEP处理L02-p53细胞24h，≥12.50mg/L处理组SA-β-Gal阳性细胞率均升高（P<0.05或P<0.01），在48h所有处理组 SA-β-Gal阳性细胞率均升高（P<0.01），阴性对照组与溶剂对照组相比无显著性差异。TCEP处理Hep3B细胞24h和48h，所有处理组的SA-β-Gal阳性细胞率均升高（P<0.05或P<0.01）；②TCEP处理L02细胞24h，≥12.50mg/L处理组IL-6水平均降低（P<0.05或P<0.01），在48h，≥50.00mg/L处理组IL-6水平均降低（P<0.05或P<0.01）。TCEP处理L02p53-细胞24h，≥12.50mg/L处理组的IL-6水平均降低（P<0.05或P<0.01），在48h，≥50.00mg/L处理组IL-6水平均降低（P<0.05或P<0.01）。TCEP处理Hep3B细胞24h和48h，≥12.50mg/L处理组IL-6水平均降低（P<0.05或P<0.01）；③TCEP处理L02细胞24h和48h，所有处理组 MDM2蛋白的表达均上调，p53蛋白表达均下调；≥50.00mg/L处理组p38MAPK、p-p38MAPK、NFκB、p-NFκB和IL6R蛋白表达均下调；所有处理组Rb和p-Rb蛋白表达上调；≥12.50 mg/L处理组p21蛋白表达均上调。TCEP处理L02-p53细胞24h和48h，≥12.50mg/L处理组 p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表达均下调，≥50.00mg/L处理组NFκB、p-NFκB和IL6R蛋白表达均下调；所有处理组的Rb、p-Rb和p21蛋白表达均上调。TCEP处理 Hep3B细胞24h和48h，≥12.50mg/L处理组p38MAPK、p-p38MAPK和IL6R蛋白表达均下调；所有处理组NFκB和p-NFκB蛋白表达均下调，Rb、p-Rb和p21蛋白表达均上调。
　　结论：TCEP诱导肝细胞衰老样生长阻滞可能由p53非依赖性p21/Rb信号通路调控。但未见IL-6/IL6R和p38MAPK/NFκB信号通路参与TCEP诱导肝细胞衰老样生长阻滞。

目录

封面

声明

目录

英文缩写词汇表

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 TCEP致肝细胞毒性的研究

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第二部分 TCEP促发线粒体信号通路致细胞生长阻滞的调控机制

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第三部分 TCEP激活p53非依赖p21/Rb通路致细胞衰老样生长阻滞的调控机制

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

结论

本研究创新之处：

本研究不足之处：

参考文献

综述: 细胞衰老的分子机制研究进展

附录

致谢