一种培养结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的方法

摘要

本发明公开了一种培养结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的方法。该方法包括(1)胚胎发生，(2)胚萌发和再生植株的获得步骤，其中(1)胚胎发生中将分离出的小孢子置于18±0.5℃培养箱中暗培养，直至有肉眼可见的胚状体产生；将小胚状体转到25±0.5℃、黑暗、50～55rpm摇床上震荡培养，至子叶胚状体形成。应用此方法，可批量获得遗传上纯合的双单倍体植株材料，加速种质资源创新，缩短育种进程。本发明也可在结球甘蓝分子标记育种、突变体筛选及细胞全能性的模式体系等研究领域中推广应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种培养结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的方法。

技术背景

结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)简称甘蓝，在中国又称为包菜、圆白菜、洋 白菜、卷心菜等，是十字花科芸薹属中最重要的蔬菜作物之一。甘蓝为异花授粉植物，杂种优 势十分明显。但是，作为绿体春化植物，受条件的限制，一般一年只能自交繁殖一代，育成一 个稳定的自交系至少需要5～6年的时间。游离小孢子培养是快速获得纯合双单倍体的最佳方法 之一，对加快农作物的新品种选育，提高育种效率具有重要作用。此外，游离小孢子培养还可 应用于遗传图谱构建、诱变、基因转化、突变体筛选等的研究。同时，小孢子胚胎诱导和发育 作为一种研究细胞全能性及胚胎发育的模式体系也引起越来越多的关注。

在芸薹属植物中，30～35℃热激预处理被作为游离小孢子培养中诱导胚胎发生的一个先决 条件。目前结球甘蓝游离小孢子培养使用的诱导胚胎发生的胁迫条件为30～35℃热激24～48h 后再置于25℃培养，在此基本培养体系下，已有较多胚胎诱导成功的报道。但是，许多基因 型胚胎发生率还是很低，尤其是一些农艺性状重要的基因型在小孢子胚胎形成时表现出顽抗 性，限制了该技术在甘蓝育种中大规模应用。同时，相较于其他作物小孢子培养的植株再生率， 结球甘蓝胚状体的植株再生较为困难。

发明内容

本发明的目的在于针对现有结球甘蓝小孢子培养体系存在的胚胎发生率、植株再生频率低 的问题，提供一种由结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的新方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种培养结球甘蓝游离小孢子获得再生植株的方法，包括以下步骤：

(1)胚胎发生

1)供体材料选取：选取健康结球甘蓝植株处于单核后期的花蕾为供体花蕾；

2)供体材料灭菌；

3)小孢子的分离、分装；

4)小孢子胚状体的诱导培养：将上一步分离出的小孢子置于18±0.5℃培养箱中暗培养，直至 有肉眼可见的胚状体产生；

5)子叶胚形成：将小胚状体转到25±0.5℃、黑暗、50～55rpm摇床上震荡培养，至子叶胚状 体形成；

(2)胚萌发和再生植株的获得

1)胚萌发在6000lx光照14h/d、25±0.5℃条件下，将子叶胚转接在胚萌发固体培养基上于培 养皿中进行培养，直至胚萌发；

2)植株再生2～3周后，转入植株再生固体培养基上，于三角瓶中继续培养1–2周长成幼苗。

所述的小孢子的分离、分装方法优选：将灭菌后的花蕾放入无菌研钵中，加入小孢子提取 培养基，用研棒轻轻挤压，使小孢子从花药中游离到溶液中，45μm孔径的尼龙筛网过滤，收 集滤液，100×g离心3次，每次3min；最后1次离心后，弃上清，将小孢子沉淀悬浮在胚状 体诱导培养基中，调整小孢子密度为1×10⁵个/mL，于每个无菌玻璃培养皿(Φ60mm)中分装 2mL悬浮液，并加入100μL 1％的活性炭，Parafilm封口。

所述的小孢子提取培养基配方为：B5+蔗糖130g/L+甘露醇7g/L，pH5.8。

所述的胚状体诱导培养基配方为：NLN+蔗糖130g/L+阿拉伯半乳糖12mg/L，pH6.0。

所述的小孢子胚状体的诱导培养步骤中优选将上一步分装后的小孢子悬浮液置于 18±0.5℃培养箱中暗培养，直至有肉眼可见的胚状体产生。

所述的胚萌发固体培养基配方为：B5+蔗糖20g/L+琼脂10g/L+6-BA 0.15mg/L，pH 5.8。

所述的植株再生固体培养基配方为：B5+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。

供体材料灭菌方法优选先用纯净水清洗花蕾，然后在超净工作台中用体积比75％酒精消毒 30s，之后用体积比7％的次氯酸钠溶液表面消毒15min，再用无菌水冲洗3次，每次5min。

有益效果

本研究以结球甘蓝为材料，建立了高效的游离小孢子培养胚胎发生与植株再生体系，为结 球甘蓝育种、细胞、基因工程等的研究奠定了基础。本发明提供的一种高效获得结球甘蓝游离 小孢子培养再生植株的新方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

(1)本发明小孢子胚胎发生的诱导培养的条件为18±0.5℃低温培养直至有肉眼可见的胚状体 产生，该培养条件与32.5±0.5℃高温热激处理24h后置于25±0.5℃培养相比，不但获得了较高 的胚胎发生率，而且胚状体的质量也得到很大改善(图1)。

(2)本发明在胚胎发生中，不但观察到32.5±0.5℃高温热激处理24h，再置于25±0.5℃培养下 的无胚柄的多细胞类胚结构(图4a)，也观察到与合子胚相似的具有胚柄的多细胞类胚结构(图 4b)，该细胞学事件为体外合子胚的发育模式研究提供了技术平台。

(3)本发明在植株再生中使用B5-2固体培养基，比使用MS-2固体培养基植株再生率提高。

(4)本发明在游离、纯化小孢子的B5-13液体提取培养基添加7g/L甘露醇，降低小孢子培养 中小孢子的死亡率，提高了结球甘蓝小孢子的胚胎发生。

(5)本发明在悬浮培养小孢子的NLN-13液体培养基中添加12mg/L阿拉伯半乳糖蛋白，对小 孢子胚状体诱导有明显的促进作用，特别是诱导了部分难出胚基因型的胚胎发生，这对于难出 胚材料是一个较大的突破。

(6)本发明在胚萌发的B5-2固体培养基中添加了0.15mg/L 6-BA,比不添加任何调节剂的植 株再生率提高显著。

附图说明

图1(a)32.5±0.5℃高温热激处理24h再置于25±0.5℃培养下获得的胚状体；(b)18±0.5℃低温培 养下获得的胚状体；

图2胚状体萌发；

图3植株再生；

图4(a)32.5±0.5℃高温热激处理24h再置于25±0.5℃培养中获得的无胚柄的多细胞类胚结构； (b)18±0.5℃低温培养中获得的具有胚柄的多细胞类胚结构。

具体实施方案

本发明所提供的结球甘蓝游离小孢子培养和植株再生的方法，通过以下实施例对本发明作 进一步的详细说明，但本发明的内容不局限于此：

实施例1

(1)胚胎发生

1)供体材料选取选择生长健康的供体植株不同长度的花蕾，使用镊子挤出部分小孢子，醋酸 洋红或4，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)荧光染料染色后在显微镜下对其小孢子发育时期 进行观察，选择小孢子处于单核后期的花蕾为供体花蕾。不同基因型最适培养时期对应的花蕾 长度存在差异，但基本上在3.5～4.5mm范围内的花蕾中处于单核后期的小孢子比例最高。

2)供体材料灭菌用纯净水清洗花蕾，然后在超净工作台中用体积比75％酒精消毒30s，之后 用体积比7％的次氯酸钠溶液表面消毒15min，再用无菌水冲洗3次，每次5min。

3)甘露醇处理对灭菌后的花蕾用添加0(CK)、4、7、10、15g·L^-1甘露醇的B5-13液体提 取培养基进行游离、纯化。与对照相比,随提取培养基中甘露醇浓度提高,各材料的平均出胚 量随之提高,并在7g·L^-1甘露醇处理时达到最高；之后,随甘露醇浓度继续提高,平均出胚量 又显著下降。

4)阿拉伯半乳糖处理将分离纯化后的小孢子用添加0(CK)、6、12、20、30mg/L阿拉伯 半乳糖的NLN-13胚状体诱导培养基进行悬浮，观察小孢子出胚情况。结果表明，在NLN-13培 养基中加入一定浓度的阿拉伯半乳糖，对小孢子胚状体诱导有显著影响。当阿拉伯半乳糖达到 12mg/L时，供试品种的小孢子胚状体诱导率最高。

5)小孢子的分离、分装将灭菌后的花蕾放入无菌研钵中，加入适量B5+蔗糖130g/L+甘 露醇7g/L，pH5.8提取培养基，用研棒轻轻挤压，使小孢子从花药中游离到溶液中，45μm孔 径的尼龙筛网过滤，收集滤液，100×g离心3次，每次3min。最后1次离心后，弃上清，将 小孢子沉淀悬浮在NLN+蔗糖130g/L+阿拉伯半乳糖12mg/L，pH6.0液体培养基中，调整小 孢子密度为1×10⁵个/mL，于每个无菌玻璃培养皿(Φ60mm)中分装2mL悬浮液，并加入100μL 1％的活性炭，Parafilm封口。

6)诱导培养条件处理将上述培养皿分别置于32.5±0.5℃高温热激处理24h再置于25±0.5℃ 培养；18±0.5℃培养箱中暗培养，直至有肉眼可见的胚状体产生。结果表明，18±0.5℃培养条 件与32.5±0.5℃高温热激处理24h再置于25±0.5℃培养相比，不但获得了较高的胚胎发生率， 而且胚状体的质量也得到很大改善。

7)子叶胚形成将小胚状体转到25±0.5℃、黑暗、50-55rpm摇床上震荡培养，至子叶胚状体 形成(图1)。

(2)胚萌发和再生植株的获得

1)胚萌发B5-2固体培养基中6-BA处理设置添加0(CK)、0.15mg/L、0.3mg/L 6-BA的 B5-2固体培养基进行胚萌发实验，结果表明：添加0.15mg/L 6-BA促进了胚萌发，并且降低 了胚褐化、玻璃化的现象。

2)植株再生培养基处理胚萌发后，分别将其置于B5-2(琼脂7％)、MS-2(琼脂7％)固体 培养基中培养，结果表明：B5-2培养基显著提高了植株再生频率。

3)胚萌发在6000lx光照14h·d^-1、25±0.5℃条件下，将子叶胚转接在B5+蔗糖20g/L+琼脂 10g/L+6-BA 0.15mg/L,pH 5.8固体培养基上于培养皿中进行培养，直至胚萌发(图2)。

4)植株再生2～3周后，转入B5+蔗糖20g/L+琼脂7g/L,pH 5.8的固体培养基上，于三角瓶 中继续培养1～2周长成幼苗(图3)。

综上所述，在对花蕾进行消毒后最好使用B5+蔗糖130g/L+甘露醇7g/L，pH5.8的液体 提取培养基游离、纯化小孢子，然后悬浮在NLN+蔗糖130g/L+阿拉伯半乳糖12mg/L，pH6.0 的液体胚状体诱导培养基中，于18±0.5℃暗培养；现肉眼可见的胚状体后，将其转到25±0.5℃、 50～55rpm摇床上震荡培养；胚萌发培养基配方为B5+蔗糖20g/L+琼脂10g/L+6-BA 0.15mg/L, pH 5.8，植株再生培养基配方为：B5+蔗糖20g/L+琼脂7g/L,pH 5.8。

附：培养基配方