一种干制辣椒铁高效基因型育种资源的快速筛选方法

摘要

本发明提供了一种干制辣椒铁高效基因型育种资源的快速筛选方法，本发明首先确定了铁浓度为0.1mg/L浓度水平适合作为铁胁迫筛选的临界浓度，在此基础上，又确定了生长点状态、叶片黄化指标和根系发育指标作为评估指标，建立了干制辣椒铁高效基因型育种资源的筛选方法，最终所筛选的育种材料是具有较高的耐缺铁性表现型，目的是筛选出铁高效基因型的品种资源，本发明所述的筛选方法是建立在科学实验的基础上，并且经过具体筛选例证进行筛选确定，所选育的育种材料可以直接用于辣椒铁高效基因型新品种选育中，具有良好的市场应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于植物新品种选育技术领域，具体涉及一种干制辣椒铁高效基因 型育种资源的快速筛选方法。

背景技术

植物缺铁失绿症是一个世界性植物营养失调问题。在干旱、半干旱地区的 石灰性土壤上广泛存在着植物缺铁问题，在盐碱土上植物常发生缺铁现象。据 统计，全世界约有40％的土壤缺铁。我国南起四川盆地，北至内蒙古高原，东 至淮北平原，西到黄土高原及甘肃、青海、新疆都有大面积缺铁土壤。

铁是植物生命过程中必需的重要微量元素，它参与和影响包括氮素代谢、 有机酸代谢、碳水化合物代谢及原生质性状等许多生理过程。轻度缺铁会导致 叶绿素合成减少，光合速率降低，严重缺铁时，叶绿素合成停止，新叶变黄， 生物量大幅度下。

辣椒正常生长最低需铁量为2.5mg/L。然而，根据2006-2012年在新疆辣 椒生产主产区土壤抽样调查表明，该区域土壤有效铁含量太低。焉耆、和静、 博湖等县土壤抽样测定有效铁含量是在0.15-0.37mg/L之间。因此提高干制辣 椒产量潜力的一个重要途径是，选育耐缺铁高效基因型的辣椒新品种，筛选出 铁高效基因型的育种材料是辣椒育种工作的首要任务。

发明内容

本发明的发明目的是提供了一种干制辣椒铁高效基因型育种资源的快速 筛选方法，具体包括：适宜的铁浓度筛选水平；建立筛选铁高效基因型的辣椒 形态学指标；筛选出铁高效基因型的品种资源。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种干制辣椒铁高效基因型育种资源的快速筛选方法，它包括以下步骤：

(1)先基质育苗，待辣椒幼苗展2叶时移入完全营养液育苗；

(2)当达到辣椒苗龄4-5叶时移入铁胁迫营养液继续培养，使用所述铁胁 迫营养液水培培养20-30天，所述铁胁迫营养液中铁浓度为0.1mg/L；

(3)然后进行形态评估，铁高效基因型的形态指标体系判别标准包括： 辣椒苗生长点状态、叶片黄化指标和根系发育指标；

a、辣椒苗生长点状态，分3级：

生长点正常：顶端生长点新叶依次展出，叶色正常，叶形正常；

生长点畸形：顶端生长点新叶卷缩，或卷曲，或新叶片在幼小时呈叶脉皱， 叶色不正常；

生长点坏死：顶端生长点新叶无法抽出，枯顶，新叶色变深或褐黑色；

b、叶片黄化指标，分5级：

看新叶叶片状态：正常；卷曲；皱缩；花叶；

每份材料随机抽取10株，每株自生长点向下取1至5片叶判别叶片黄化 度，计算叶片黄化指数；

0级：正常绿叶；

1级：微黄绿色，叶片的叶基部分表现发黄，叶尖大部分仍绿色；

2级：黄绿色，整片叶片均表现出比正常叶呈黄绿色；

3级：黄色，整片叶片表现出比正常叶呈黄色；或叶色褪色轻但是叶片出现 小枯斑；

4级：白黄色，整片叶片表现出比正常叶呈白黄色；或叶片上沿叶脉伴有较 大的透明坏死斑；

c、根系发育指标，分5级：

每份材料随机取10株评估，统计根系伤害指数；

1级：发新根多，根粗长，根尖未枯，色白；

2级：发新根较多，根粗长，根尖稍枯，色较白；

3级：发新根较少，根较粗，稍短，根尖稍枯，色褐；

4级：发新根少，根较粗短，根尖枯，色褐；

5级：不发根，根尖严重枯，色褐；

(4)辣椒育种资源耐缺铁统计分析

统计每份辣椒资源的叶片黄化指数和根系伤害指数，计算公式如下：

叶片黄化指数％＝{∑(黄化级叶片数×黄化级级数)}/(总叶片数×黄化最重 级级数)×100；

根系伤害指数％＝{∑(株数×级数)}/(总株数×最高级数)×100；

(5)筛选和评估铁高效基因型育种资源

计算出参试材料的叶片黄化指数和根系伤害指数的平均值±标准差，依据 表型判断育种材料耐铁基因型判别式：≤平均值-3标准差，而且生长点接近正 常状态是铁高效基因型；≥平均值-2标准差且≤平均值-标准差，且生长点畸形 明显的是铁次高效基因型；≥平均值，且生长点坏死的是铁低效基因型，予以 淘汰。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明经过一系列实验首 先确定了铁浓度为0.1mg/L浓度水平适合作为铁胁迫筛选的临界浓度，在此基 础上，又确定了生长点状态、叶片黄化指数和根系发育指数三个指标作为评估 指标，建立了干制辣椒铁高效基因型育种资源的筛选方法，最终所筛选的育种 材料是具有较高的耐缺铁性表现型，目的是筛选出铁高效基因型的品种资源， 本发明所述的筛选方法是建立在科学实验的基础上，并且经过具体筛选例证进 行筛选确定，所选育的育种材料可以直接用于辣椒铁高效基因型新品种选育中， 具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明所确定的铁高效基因型的根系分级标准图。

图2是本发明所确定的铁高效基因型的叶片分级标准图。

图3是本发明所确定的铁高效基因型的生长点状态分级标准图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明 实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1、建立干制辣椒铁高效基因型育种资源的筛选方法

1、配置营养液

(1)水培营养液配方(母液)如表1所示：

表1 水培营养液组成配方

化肥(化学试剂) 用量(g/L) 化肥(化学试剂) 用量(g/L) KH₂PO₄2.7 MnSO₄0.051 KNO₃10.2 (NH₄)6Mo₇O₂₄0.0081 Ca(NO₃)₂·4H₂O 23.6 ZnSO₄·7H₂O 0.011 MgSO₄·7H₂O 9.8 Na_2-EDTA 0.745 Na₂B₄O₇0.175 FeSO₄·7H₂O-EDTA 0.257 CuSO₄·5H₂O 0.0039    

(2)营养液电导度(EC)、酸碱度(pH)和溶解氧的调整与补充

完全营养液电导度(EC)的调整控制在1.7-2.5ms/cm，低于此范围时，应 向营养液中补充预先配制好的母液。高于此范围时，更换全部的营养液。

完全营养液酸碱度(pH)的调整控制在5.8-6.5范围。

完全营养液中的溶解氧的补充：辣椒属于耗氧量较大的蔬菜作物，在水温 为15℃时，保证氧气的溶解度在10mg/L，每天用压缩空气泵，在上午和下午 分别供应氧2-3小时，每日检测pH、EC和温度(℃)值，并定期4-5天添加或更 换营养液。

在辣椒苗培养时，初始营养液pH调至6.0，EC值1.7ms；处理中营养液 pH6.5-7.5，EC值2-2.5ms/cm之间。

(3)光照与温度调整与控制

水培光照时长每天14h，光强2000Lx，白天温度为22-28℃，夜间17-21℃， 相对湿度60-90％。

(4)营养液配制方法：

大量元素按配方取量，分别配制100ml作为母液使用；微量元素按配方取 量，分别配制50ml作为母液使用；铁元素在配制过程中需加热来帮助其溶解， 配制100ml作为母液使用。对照用培养液与铁胁迫营养液配方差别是，铁元素 用量对照为2.5mg/L，铁胁迫处理为0.1mg/L。

2、确定筛选铁胁迫浓度的试验

首先取一份同质遗传背景干制辣椒的种子育苗，当基质育苗至幼苗展2片 真叶大小时移入所述完全营养液下培养至4-5叶展幼苗，再移入铁胁迫营养液 (铁胁迫培养液和所述完全营养液除了铁浓度不同，其余组分相同)培养。

(1)设置不同铁浓度梯度：

胁迫水平：0mg/L、0.1mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L、0.75mg/L；

适量的下限水平：2.5mg/L(对照)；

(2)胁迫时间

培养正常苗达4-5片真叶后，移入所述铁胁迫培养液中，胁迫培养20天， 进行第一次评估，胁迫培养40天后进行第2次评估。

(3)评估指标：形态指标、生长点状态、叶片黄化指标和根系发育指标。

3.评估指标

3.1形态指标

(1)株高(cm)：辣椒苗自子叶至生长点的高度；

(2)茎粗(cm)：子叶位置的茎直径；

(3)展叶数(片)：真叶展叶数(不包括子叶)。

不同铁胁迫水平下幼苗形态性状差异显著性比较实验结果如下：

第20天和第40天测定幼苗的株高、茎粗、叶展数，数据方差分析结果：

株高：对照与胁迫处理存在极显著差异，胁迫处理间不存在显著性差异。 第20天时胁迫比对照株高绝对值降低15-19％，第40天时胁迫比对照降低 25-45％，0mg/L与其他值存在显著性差异。随处理时间的延长，铁胁迫对辣椒 生长影响日益明显。

茎粗：差异不显著。

叶展数：主茎展叶数由多到少排列顺序：2.5mg/L＞0.75mg/L、0.5mg/L ＞0.25mg/L＞0.1mg/L＞0mg/L。2.5mg/L平均展叶片数16.3571，0.1mg/L平均 展叶片数14.2105，0mg/L平均展叶片数11.1250。方差分析结果：0.1mg/L与 0mg/L差异显著，所以选择最低的铁含量0.1mg/L水平处理就可以与0mg/L比 较出统计差异的展叶数，设为最低铁胁迫的敏感点浓度。

3.2生长点状态：

正常：新叶依次展出，叶色、叶形正常；

畸形：新叶卷缩或卷曲、或新叶片在幼小时叶脉皱，叶色不正常；

坏死：新叶抽不出来，枯顶，新叶色变深或褐黑色；

新叶片生长状态：正常；卷曲；皱缩；花叶或无。

不同浓度铁胁迫的生长点状态实验结果如下：

观察表现：在正常浓度下生长，新叶依次展出，叶色、叶形舒展正常。在 0.75-0.5mg/L处理下生长点畸形不显著，在40天时畸形才显现出来。在0.25mg/L 处理下第20天开始出现畸形态，新叶卷缩或卷曲。在0.1mg/L和0mg/L处理 下均出现叶色明显黄化，幼叶片主叶脉皱，或生长点新叶抽不出来，枯顶，新 叶色变深或褐黑色，严重者新叶叶柄枯死，幼茎有枯斑(见图1)，但是0.1mg/L 出现坏死的时间比0mg/L处理的能晚5天左右。所以选择0.1mg/L铁浓度作为 选择指标浓度，就能较早出现铁胁迫坏死症状，减少试验水培的时间。

3.3叶片黄化指标

试验中叶色表现出的黄化程度划分为五级。每株自生长点向下取1至5片 新叶判别叶片黄化度(见图1)，统计叶片黄化指数。

0级：正常绿叶；

1级：微黄绿色，叶片的叶基部分表现发黄，叶尖大部分仍绿色；

2级：黄绿色，整片叶片均表现出比正常叶呈黄绿色；

3级：黄色，整片叶片表现出比正常叶呈黄色；或叶色褪色轻但是叶片出现 小枯斑；

4级：白黄色，整片叶片表现出比正常叶呈白黄色；或叶片上沿叶脉伴有较 大的透明坏死斑。

不同浓度铁胁迫的叶片黄化指数差异比较试验结果如表2：采用Duncan多 重比较，0mg/L叶片黄化指数与其他处理差异极显著。比其他处理叶片黄化指 数高出76.39-421.92％；0.1mg/L与0.25mg/L以上铁浓度处理差异均极显著。所 以叶片黄化指标是一个非常重要的筛选辣椒铁高效基因型品种资源选择指标， 因此可以将0.1mg/L水平处理作为叶片黄化的敏感点浓度。

表2 不同铁胁迫处理叶片黄化指数差异比较

3.4根系发育指标

试验中根系生长表现出：根尖坏死；褐变；短根多；根系色泽暗等。根据 发新根数、根系粗度、长度、根尖状态、根色等综合状态，将根系生长状态表 现型分级5级。(见图版1)

1级(正常)：发新根多，根粗长，色白；

2级：发新根较多，根粗长，根尖稍枯，色较白；

3级：发新根较少，根较粗，稍短，根尖稍枯，色褐；

4级：发新根少，根较粗短，根尖枯，色褐；

5级：不发根，根尖严重枯，色褐。

不同浓度铁胁迫的根系伤害指数差异比较实验结果如表3：根系伤害指数 越大，根系生长状态越不好，根尖坏死多，新根量越少，根系白度越差。对照 处理的辣椒根系伤害指数最小,其根系生长最好，与其他处理存在极显著差异； 随着铁胁迫浓度的降低，根系生长状态变得越来越差。0mg/L比其他处理根系 伤害指数高出60.68-262％。因此，根系生长伤害指数可以作为筛选辣椒铁高效 基因型品种资源主要指标之一。0.1mg/L处理与0mg/L根系生长伤害指数达极 显著差异，因为0.1mg/L水平处理可以与0mg/L比较出统计学意义上的极显著 差异性，所以此浓度可以表达出是铁胁迫造成根系伤害指数的敏感点浓度。

表3 不同铁胁迫处理根系伤害指数差异比较

处理 均值 5％显著水平 1％极显著水平 比0mg/L低百分率(％) 0mg/l 96.73 a A   0.1mg/l 60.2 b B -60.68 0.25mg/l 51 c C -89.67 0.5mg/l 35.3 d D -174.02 0.75mg/l 30.23 e DE -219.95 2.5mg/l 26.67 e E -262.73

3.5评估公式

相对生长量：将形态测定值化为相对生长量进行评估。其公式如下：

相对生长量＝(处理后生长量-处理前生长量)/处理前生长量；

胁迫生长降低率＝(处理生长量-对照生长量)/对照生长量；

叶片黄化指数：每个单株随铁胁迫培养时间的递增，依次展出的叶片表现 出差异，用黄化指数量化单株评估值；

叶片黄化指数％＝{∑(黄化级叶片数×黄化级数)}/(总叶片数×黄化最重 级数)×100；

根系伤害指数：根系伤害指数％＝{∑(株数×级数)}/(总株数×最高级数) ×100；

试验测定数据用dps系统统计分析。

不同浓度铁胁迫的相对生长量差异比较实验结果如下：

在第20天和第40天铁胁迫处理间相对生长量趋势，以对照(2.5mg/L) 的株高相对生长量增加幅度最大。与其他处理差异极显著。

0.1mg/L至0.75mg/L铁胁迫处理的辣椒株高相对生长量是随浓度降低而降 低趋势，0.1mg/L浓度水平表现出比较平稳的减低率。0mg/L水平浓度的辣椒 株高相对生长量降低明显，第40天达到最低与其他铁胁迫处理差异显著。

本发明经上述实验证明铁浓度为0.1mg/L浓度水平适合作为铁胁迫筛选的 临界浓度。与0mg/L水平比较：它是叶片展叶数显著差异、叶片黄化度敏感变 化、生长点坏死斑延迟出现5天左右的浓度；同时是根系伤害、新根发生量显 著差异的浓度；也是相对生长量表现出比较平稳地减低率的浓度。

实施例2、铁高效辣椒基因型品种资源的筛选例证

以上述确定的铁浓度0.1mg/L水平为筛选水平，按照如下步骤筛选：

1、正常基质育苗，展2叶时移入完全营养液育苗；

育苗基质配方为:草炭:珍珠岩:蛭石＝6:3:1的配方比，同时每立方米加入 0.4kg的17:17:17的NPK复合肥。

所使用的原料保证其育苗基质的容重为0.3-0.8g/m³，总孔隙度为60-90％， 通气孔隙度大于15％,且基质能够提供20-35％容易被利用的水分,pH在6-6.8左 右，EC值≤2.5ms/cm的理化性状范围内。

完全营养液配方和水培方法同实施例1。

2、当达到苗龄4-5叶时准备移入铁胁迫营养液继续培养，铁胁迫营养液继 续培养苗30天；

辣椒苗培养为：初始营养液pH调至6.0，EC值1.7ms；处理中营养液 pH6.5-7.5，EC值2-2.5ms之间；每天14h光照，光强2000Lx，白天温度为22-28℃， 夜间17-21℃，相对湿度60-90％；每天上午、下午营养液充氧2h；每日检测pH、 EC和温度(℃)值，并定期添加或更换营养液。

3、铁高效基因型的形态指标体系标准包括：辣椒苗生长点状态；叶片黄 化指标和根系发育指标，如图1、2和3所示：

a、辣椒苗生长点状态(分3级)：

生长点正常：顶端生长点新叶依次展出，叶色正常，叶形正常；

生长点畸形：顶端生长点新叶卷缩，或卷曲，或新叶片在幼小时就表现叶 脉皱，叶色不正常；

生长点坏死：顶端生长点新叶抽不出来，枯顶，新叶色变深或褐黑色；

b、叶片黄化指标(分5级)：

先看新叶叶片状态：正常；卷曲；皱缩；花叶；

每份材料随机抽取10株，每株自生长点向下取1至5片叶判别叶片黄化 度，计算叶片黄化指数。

0级：正常绿叶；

1级：微黄绿色，叶片的叶基部分表现发黄，叶尖大部分仍绿色；

2级：黄绿色，整片叶片均表现出比正常叶呈黄绿色；

3级：黄色，整片叶片表现出比正常叶呈黄色；或叶色褪色轻但是叶片出 现小枯斑；

4级：白黄色，整片叶片表现出比正常叶呈白黄色；或叶片上沿叶脉伴有较 大的透明坏死斑。

c、根系发育指标(分5级)：

辣椒在缺铁环境下根系生长会表现出根尖坏死，褐变，短根多，根系色泽 暗等，根据发新根数、根系粗度、长度、根尖状态、根色等综合状态，将根系 生长表现型分级五级。每份材料随机取10株评估，统计根系评价指数；

1级：发新根多，根粗长，根尖未枯，色白；

2级：发新根较多，根粗长，根尖稍枯，色较白；

3级：发新根较少，根较粗，稍短，根尖稍枯，色褐；

4级：发新根少，根较粗短，根尖枯，色褐；

5级：不发根，根尖严重枯，色褐；

4、辣椒育种资源耐缺铁统计分析

统计每份辣椒资源的叶片黄化指数和根系伤害指数。计算公式：

叶片黄化指数％＝{∑(黄化级叶片数×黄化级级数)}/(总叶片数×黄化最重 级级数)×100；

根系伤害指数％＝{∑(株数×级数)}/(总株数×最高级数)×100；

5、筛选和评估铁高效基因型育种资源

求出参试材料的叶片黄化指数和根系伤害指数的平均值±标准差，依据表 型判断育种材料耐铁基因型判别式：≤平均值-3标准差，而且生长点接近正常 状态或有点畸形的是铁高效基因型；≥平均值-2标准差≤平均值-标准差，且生 长点畸形明显的是铁次高效基因型；≥平均值，且生长点坏死的是铁低效基因 型，予以淘汰。

采用如上步骤对53份辣椒品种资源进行苗期铁胁迫处理，在第30天测定 各项指标。评估结果如下：铁高效基因品种资源占7.54％，次铁高效基因品种 资源占29.29，耐缺铁基因品种资源占31.19％，不耐缺铁基因品种资源占 32.08％。育种时可以将后二者合并予以淘汰。育种选择时可以结合其他目的性 状考虑次铁高效基因以上品种资源的利用价值。

经过具体筛选例证证明使用本发明所述的筛选方法可以快速、准确的筛选 出所需要的铁高效基因的品种资源。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照 前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依 然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进 行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要 求保护的技术方案的精神和范围。