一种试纸以及一种同时检测液体样品中的IgG和IgM的方法

摘要

本发明公开了一种试纸，所述试纸包括依次排列的加样区、结合物区、观测区和吸水区；其中，所述结合物区含有结合有抗原的胶体金，所述结合有抗原的胶体金能够被液体样品洗脱；所述观测区包括按照结合物区到吸水区的方向依次排列的抗体线、抗原线T3以及质控线C；其中，所述抗体线包括T1线和T2线；其中，所述抗体线T1固定有抗人IgG的抗体，所述抗体线T2固定有抗人IgM的抗体，所述抗原线T3固定有抗原，所述质控线C固定有抗抗原的抗体；所述IgG和IgM能够特异性地与所述抗原结合。本发明的试纸可以在一次检测中同时检测样品中是否含有IgM和IgG，可以避免漏检、缩短检测时间、降低检测费用，便于现场检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种试纸以及一种同时检测液体样品中的IgG和IgM的方 法。

背景技术

免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G(IgG)是人类或者动物体内最重 要的两种抗体。当机体感染抗原后，IgM是抗原刺激诱导体液免疫应答中最 先产生的免疫球蛋白，其可以结合补体，主要分布于血清中。由于IgM有较 高的结合价，所以是高效能的抗生物抗体，在机体的早期防御中起着重要的 作用。IgG抗体的出现要晚于IgM抗体，是初级免疫应答中最持久、最重要 的抗体，它仅以单体形式存在。大多数的抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于 IgG，IgG在抗感染中起到主要作用。因此，通过检测机体内特异性IgM和 IgG抗体的存在与否，可以间接的反映出人或者动物对相应抗原的免疫反应 状态。

目前通过酶联免疫试剂盒检测样品中的特异性IgM和IgG的检测技术 都需要对IgM和IgG进行分别检测，导致检测所需时间较长（用ELISA方 法检测一般需要几个小时）。如果简单地同时检测特异性IgM和IgG，会存 在漏检和假阴性等缺陷。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种可以在一次 检测中同时检测样品中的IgM和IgG，避免漏检、缩短检测时间、降低检测 费用，便于现场检测的试纸。

为了达到以上目的本发明提供一种试纸，所述试纸包括依次排列的加样 区、结合物区、观测区和吸水区；

其中，所述结合物区含有结合有抗原的胶体金，所述结合有抗原的胶体 金能够被液体样品洗脱；

所述观测区包括按照结合物区到吸水区的方向依次排列的抗体线、抗原 线T3以及质控线C；

其中，所述抗体线包括T1线和T2线；

其中，所述抗体线T1固定有抗人IgG的抗体，所述抗体线T2固定有 抗人IgM的抗体，所述抗原线T3固定有抗原，所述质控线C固定有抗抗原 的抗体；

所述IgG和所述IgM能够特异性地与所述抗原结合。

本发明还提供了本发明所述的试纸在制备同时检测IgG和IgM的试剂 盒中的用途，其中，所述IgG和所述IgM能够特异性地与同一抗原结合。

此外，本发明还提供了一种同时检测IgG和IgM的方法。

本发明所述的胶体金试纸条依照免疫捕获法原理和双抗原夹心法的原 理同时测定特异性的IgM和IgG，通过一次性操作即可联合检测出液体样品 中的特异性IgM、IgG。这种胶体金试纸条具有特异性强，价格低廉，读取 结果快捷而直观等优点，不需要特殊仪器设备，也不需要专业人员的操作， 检测结果的总体符合率较高，适合于现场检测。同时改进了现有联合检测 IgM和IgG技术中漏检的缺点，在一次检测中能够清楚的区分IgM和IgG 的阴性和阳性，从而获取更多的相关信息。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

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附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与 下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在 附图中：

图1检测液体样品中特异性IgG和IgM的胶体金试纸的示意图

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种试纸，所述试纸包括依次排列的加样区、结合物区、 观测区和吸水区；

其中，所述结合物区含有结合有抗原的胶体金，所述结合有抗原的胶体 金能够被液体样品洗脱；

所述观测区包括按照结合物区到吸水区的方向依次排列的抗体线、抗原 线T3以及质控线C；

其中，所述抗体线包括T1线和T2线；

其中，所述抗体线T1固定有抗人IgG的抗体，所述抗体线T2固定有 抗人IgM的抗体，所述抗原线T3固定有抗原，所述质控线C固定有抗抗原 的抗体；

所述IgG和所述IgM能够特异性地与所述抗原结合。

在本发明所述的试纸中，所述抗体线T1固定的抗人IgG抗体能够与人 IgG发生特异性结合；所述抗体线T2固定的抗人IgM的抗体能够与人IgM 发生特异性结合。所述T3线中固定的抗原能够与所述人IgG和IgM发生特 异性结合；所述质控线C固定的抗抗原的抗体能够与结合物区中的所述抗原 发生特异性结合。

其中，本发明对所述观测区中T1线、T2线、T3线和C线的排列顺序 有一定的限制，所述排列顺序包括按照结合物区到吸水区的方向依次排列 T1线、T2线、T3线和C线，或者，按照结合物区到吸水区的方向依次排列 T2线、T1线、T3线和C线。

在本发明的实施方式中，T1线、T2线、T3线和C线的排列顺序要使得 当液体样品加入到样品垫上时，液体样品在毛细管力的作用下会先后经过两 条抗体线，再经过抗原线T3，最后经过质控线C。所述T1、T2、T3和C 线可以垂直于液体流动的方向。

在本发明所述的试纸中，所述T1、T2、T3和C线的长度可以为 0.35-0.4cm，每条线的宽度可以为0.5-1mm。

本发明所述的试纸中，彼此相邻的两条线之间要保持一定的距离，优选 情况下，所述距离为3.5-4mm，每平方厘米的所述T1、T2、T3和C线上所 包被的抗原或抗体的量为0.003-0.004mg。

在本发明的实施方式中所述加样区的基底和结合物区的基底为玻璃纤 维膜，所述观测区的基底为硝酸纤维素膜，所述吸水区的基底为吸水纸。

所述加样区、结合物区、观测区和吸水区的基底依次相互搭接的排列， 当将待测液体样品加到加样区时，待测液体样品能够在毛细管力的作用下依 次经过结合物区、观测区到达吸水区。

本发明所述的试纸中，在结合物区中所述结合有抗原的胶体金中胶体金 的颗粒的直径为20-50nm。所述胶体金可以为通过本领域常规方法制备的胶 体金，例如，所述胶体金的制备方法可以为柠檬酸三钠还原法。

本发明所述的试纸中，所述结合有抗原的胶体金可以采用以下手段制 得：在金溶胶中按照20μg/ml～80μg/ml的比例加入纯化的抗原，经封闭、离 心处理后，取沉淀稀释至A₃₅₀值为2.0。

本发明所述的试纸的结合物区可以通过将含有结合有抗原的胶体金溶 液涂覆在玻璃纤维膜上面制备。

本发明所述的胶体金试纸条的制备方法，具体可以包括如下步骤：

（1）将150-250μg抗原置于透析袋中，将透析袋置于150-200mL浓度 为5-10mM的Tris-HCl缓冲溶液中进行透析，并且每隔2h-3h更换一次缓冲 溶液，共透析18-24h，透析完成后，将保留液取出置于离心管中，加入2-3mL 三蒸水并以10000-15000rpm离心10-25min后弃去沉淀获得离心后抗原；

（2）在烧杯中加入500-1500mL三蒸水，然后加入10-40mL的1重量% 的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后，再加入5-15mL0.5-1.5重量%的氯金酸溶 液，煮沸15min-20min并冷却至15-50℃后取15-25mL所述胶体金溶液置于 烧杯中，加入150-160μL0.05-0.15M的K₂CO₃溶液调节溶液的pH至6.8-7.2， 搅拌均匀后加入所述离心后抗原，搅拌20min-40min，再加入1.5-2.5mL3-7 重量%的BSA溶液并以10000-15000rpm离心35-45min后弃去上清液，再加 入20ml溶解于0.8-1.2mM的pH8.5-8.7的Tris-HCl缓冲溶液中的浓度为 0.5-1.5重量%的BSA溶液继续在10000-15000rpm离心10-20分钟，弃去上 清液，将沉淀物在恢复液中进行恢复，得到A₃₅₀值为2.0的胶体金溶液，将 胶体金溶液涂覆在玻璃纤维膜上，在零下45-60℃冷冻后作为结合物垫，将 所述结合物垫冻干后在15-25℃避光保存备用；

其中，所述恢复液中NaCl的浓度为150-200mM、BSA的浓度为1-1.5 重量%、蔗糖的浓度为0.5-1重量%、酪蛋白钠的浓度为0.5-1重量%，所述 胶体金溶液中胶体金颗粒的直径为20-50nm；

（3）在支持物板上一端顺次相互搭接地贴附样品垫、结合物垫、硝酸 纤维素膜和吸水纸制成试纸基板；

（4）通过三维平面划膜仪在纸质基板上的硝酸纤维素膜上包被T1、T2、 T3和C线：其中，C线为抗肺炎支原体抗原的抗体，浓度为0.2-0.3mg/mL， T1和T2线中抗体的浓度为0.3-0.5mg/mL，T3线为肺炎支原体抗原，浓度 为0.2-0.3mg/ml；

（5）将试纸基板切成3.5-4mm宽的试纸条。

本发明所述的试纸可以应用于本领域对液体样品中的IgG和IgM的检 测。例如，本发明所述的试纸可以应用于检测样品中的抗人类肺炎支原体或 衣原体的IgG和IgM。

当本发明所述的试纸用于检测样品中的抗人类肺炎支原体的IgG和IgM 时，所述IgG和IgM均为抗人类肺炎支原体抗原的特异性抗体。

当本发明所述的试纸用于检测样品中的抗人类肺炎衣原体的IgG和IgM 时所述IgG和IgM均为抗人类肺炎衣原体抗原的特异性抗体。

本发明还提供了本发明所述的试纸在制备同时检测IgG和IgM的试剂 盒中的用途，其中，所述IgG和所述IgM能够特异性地与同一抗原结合。所 述用途可以为同时检测液体样品中是否含有IgG和IgM。

本发明还提供了一种同时检测IgG和IgM的方法，其中，所述IgG和 所述IgM能够特异性地与同一抗原结合，该方法包括：将待测液体样品加入 本发明所述的试纸的加样区，然后观测T1、T2、T3和C线的颜色变化，并 且得到IgG和IgM的检测结果。

其中，所述液体样品可以为新鲜的全血或血清，加入到试纸加样区的液 体样品的体积为70-100μl，优选地，所述液体样品的体积为90-100μl。

当所述液体样品为血清时，需要对血清进行澄清处理，所述处理的方法 可以为通过高速离心去除血清中浑浊的杂质。

本发明对检测结果的观察时间有一定的限制，在将液体样品滴加到加样 区后，需要在20分钟内察结果，否则认为读取的结果无效，优选地，观察 的最佳时间为滴加液体样品后10-15分钟内。

在加样区加入被检测样品后，如果液体样本中含有待测抗体，那么样品 中抗体会和抗原-胶体金形成结合物，结合物在毛细管力的作用下向吸水纸 一端的方向移动。如果被检测样品中含有抗特异性抗原的IgG，那么当样品 继续移动到T1线即抗人IgG的抗体的包被线时，T1线中的抗体能够与结合 物中含有的IgG结合导致IgG和抗原-胶体金的结合物被T1线捕获，在T1 线显示一条红色条带；如果样品中含有抗特异性抗原的IgM，当样品通过 T2线即抗人的IgM抗体包被线时，T2线中的抗体能够与结合物中含有的IgM 结合导致IgM和抗原-胶体金的结合物被T2线捕获，在T2线显示一条红色 条带；样品继续移动至T3处的抗原包被线时，T3线中的抗原会通过双抗原 夹心法的原理与IgG和IgM结合导致IgG和抗原-胶体金的结合物以及IgM 和抗原-胶体金的结合物被T2线捕获，在T3处显示一条红色的条带；在液 体样品流经C线时，液体样品中携带的抗原-胶体金结合物中的抗原能够与C 线中的抗体结合，在C线显示一条红色条带。

本发明中对结果的读取可以按照以下标准进行：

T1、T2和T3处均显示红色条带，则指示待测液体样品中同时含有IgM 和IgG；

T2显示红色的条带而T1和T3未显示红色条带时，则指示待测液体样 品中含有IgM不含有IgG；

T1显示红色的条带而T2和T3未显示红色条带时，则指示待测液体样 品中含有IgG不含有IgM；

T1和T2显示红色的条带而T3未显示红色条带时，则指示待测液体样 品中同时含有IgM和IgG；

T1未显示红色条带而T2和T3显示红色条带时，则指示待测液体样品 中含有IgM不含有IgG；

T1和T3显示红色的条带而T2未显示红色条带时，则指示待测液体样 品中含有IgG不含有IgM；

T1和T2未显示红色而T3显示红色条带时，则指示待测液体样品中含 有IgG不含有IgM；

T1、T2和T3处都未显示红色条带时，则指示待测液体样品中不含有IgM 和IgG抗体。

本发明中，采用C作为检测试纸有效性的质控线，当C显示红色条带 时，则指示试纸条的结果有效，当C未显示红色条带时，则指示试纸结果无 效。

本发明所述的检测方法可以用于液体样本中肺炎支原体IgM和IgG抗 体的检测。

本发明所述的检测方法可以用于液体样本中肺炎衣原体IgM和IgG抗 体的检测。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述，以下实施例中：

兔抗人IgG购自赛尔维生物技术有限公司，编号：C020221；

鼠抗人IgM购自赛尔维生物技术有限公司，编号：C010204；

肺炎支原体抗原P1蛋白原购自厦门万科隆生物技术有限公司，批号： 20120518；

肺炎衣原体抗原购自厦门万科隆生物技术有限公司，批号：20120518；

抗肺炎支原体抗原的抗体和抗肺炎衣原体抗原的抗体，是用肺炎支原体 抗原和肺炎衣原体抗原分别免疫兔子得到的。

抗体的制备方法具体包括以下步骤：

1、订购日本大耳白兔六只，用肺炎支原体抗原和肺炎衣原体抗原分别 免疫三只兔子，并编号：1、2、3免疫肺炎支原体抗原；4、5、6免疫肺炎 衣原体的抗原。

2、每隔两周进行免疫一次，每次免疫时的抗原用量为500μg/只。兔子 第一次免疫时，需要将免疫的肺炎支原体抗原和肺炎衣原体抗原分别和弗氏 完全佐剂乳化1h，然后通过背部皮下多点注射免疫兔子。之后几次的免疫需 要将抗原和弗式不完全佐剂进行乳化1h，然后进行背部皮下多点注射免疫。

3、免疫5次之后（第5次免疫后第2周）进行心脏采血，然后提取抗 血清，经过抗体的纯化分别得到抗肺炎支原体抗原的抗体和抗肺炎衣原体抗 原的抗体，抗体的纯化步骤按照文献（郎靖，金敏，王新为，李君文，晁福 寰，大肠杆菌0157：H7多克隆抗体纯化.解放军预防医学杂志，2008，26， （4）：238-241.）中记载的方法进行。

4、通过ELISA方法检测获得抗抗原的抗体的效价。

具体的检测方法包括：在96孔板上包被肺炎支原体和肺炎衣原体的抗 原2μg/mL（稀释于浓度为0.5M，pH为9.3的碳酸缓冲中），并将包被好抗 原的96孔板于4℃冰箱过夜放置，检测时在每孔中加入200μL的0.5重量% 的BSA溶液进行室温封闭1小时，封闭结束后用洗液（pH为7.6的0.1M Tris-HCl，0.05重量%Tween20，0.15M的NaCl）洗板3次每次5分钟，然 后在各孔中分别加入100μl按照不同浓度稀释的抗体（用0.5重量%的BSA 溶液，按照1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、 1：12800、1：25600和1：51200的比例进行梯度稀释），在37℃孵育1h， 然后用洗液（pH为7.6的0.1M Tris-HCl，0.05重量%Tween20，0.15M的 NaCl）洗板3次每次5分钟，加入按照1：2500的比例稀释于0.5重量%的 BSA溶液的酶标的羊抗兔IgG抗体，孵育1h，最后用洗液（pH为7.6的0.1M Tris-HCl，0.05%Tween20，0.15M的NaCl）洗板3次每次5分钟，加入TMB 显色液进行显色，15min后，每孔加入0.1ml0.3M的盐酸终止显色反应，读 取吸光度值，抗肺炎支原体抗原的抗体的效价为1：64万；抗肺炎衣原体抗 原的抗体的效价为1：64万。

当所使用的待测液体样品为血清样品时，如果待测血清样品出现浑浊现 象，可以10000rpm离心10分钟取上清液备用。

制备例1

本制备例用于说明利用本发明所提供的试纸条的制备方法制备用于检 测液体样品中的抗肺炎支原体IgG和IgM的试纸：

（1）分别将200μg肺炎支原体抗原置于透析袋中，将透析袋分别置于 200mL浓度为5mM的Tris-HCl缓冲溶液中进行透析，并且每隔2.5h更换一 次缓冲溶液，共透析24h，透析完成后，将透析袋中的保留液取出置于离心 管中，加入2mL三蒸水并以10000rpm离心10min后弃去沉淀获得离心后抗 原。

（2）在烧杯中加入1000mL三蒸水，然后加入20mL的1重量%的柠檬 酸钠溶液并加热至沸腾，再加入10mL1重量%的氯金酸溶液，煮沸15min 后冷却至30℃获得胶体金溶液，取20mL所述胶体金溶液置于烧杯中，加入 150μL0.1M的K₂CO₃溶液调节溶液的pH至7，搅拌均匀后加入步骤（1） 中的离心后抗原，搅拌20min，再加入2mL5重量%的BSA溶液并以10000rpm 离心40min后弃去上清液，再加入20ml溶解于1mM的pH8.6的Tris-HCl 缓冲溶液中的浓度为1重量%的BSA溶液继续在10000rpm离心10分钟， 弃去上清液，将沉淀物在恢复液（NaCl的浓度为150mM、BSA的浓度为1 重量%、蔗糖的浓度为0.5重量%、酪蛋白钠的浓度为0.5重量%）中进行恢 复，得到A₃₅₀值为2.0的胶体金溶液，将胶体金溶液涂覆在200平方厘米大 小的玻璃纤维膜上，在零下45℃冷冻后作为结合物垫，将所述结合物垫冻干 后在25℃避光保存备用；

（3）在PVC板上一端顺次相互搭接地贴附样品垫、结合物垫、硝酸纤 维素膜和吸水纸制成试纸基板；

（4）通过三维平面划膜仪在纸质基板上的硝酸纤维素膜上包被T1、T2、 T3和C线：其中，C线为抗肺炎支原体抗原的抗体，浓度为0.25mg/mL， T1和T2线中抗体的浓度为0.4mg/mL，T3线为肺炎支原体抗原，浓度为 0.2mg/ml；T1、T2、T3和C的长度为0.4cm，宽度为0.5mm，彼此相邻的 两条线之间的距离为4mm，每平方厘米的所述T1、T2、T3和C上所包被 的抗原或抗体的量为0.003mg。

（5）将纸质基板切成3.5mm宽的试纸条。将试纸条在25℃避光保存备 用。

制备例2

按照与制备例1相同的方法制备用于检测抗肺炎衣原体抗原的特异性 IgG和IgM的试纸条。

实施例1

本实施例用于说明本发明所提供的试纸条在检测液体样品中是否含有 抗肺炎支原体的IgG和IgM中的应用。

采用本发明所述肺炎支原体检测试纸对临床经过酶联免疫法（ELISA） 已经确诊的血清进行检测。

将制备例1中制得的试纸条平放在检测台面上，将100μl澄清的血清样 品滴加于试纸的加样区，10分钟后观察结果。检测结果如表1所示。

表1

对比例1

本对比例用于说明现有技术的试纸条在检测液体样品中是否含有抗肺 炎支原体的IgG和IgM中的应用。

采用按照CN101021532A中提供的方法制备的试纸对与实施例1相同的 血清样品进行检测。

将试纸条平放在检测台面上，将100μl澄清的血清样品滴加于试纸的加 样区，10分钟后观察结果。检测结果如表2所示。

表2

实施例2

本实施例用于说明本发明所提供的试纸条在检测液体样品中是否含有 抗肺炎衣原体的IgG和IgM中的应用。

采用本发明所述肺炎衣原体检测试纸对临床经过酶联免疫法（ELISA） 已经确诊的血清进行检测。

将制备例2中制得的试纸条平放在检测台面上，将100μl澄清的血清样 品滴加于试纸的加样区，10分钟后观察结果。检测结果如表3所示。

表3

对比例2

本对比例用于说明现有技术的试纸条在检测液体样品中是否含有抗肺 炎衣原体的IgG和IgM中的应用。

采用按照CN101021532A中提供的方法制备的试纸对与实施例2相同的 血清样品进行检测。

将试纸条平放在检测台面上，将100μl澄清的血清样品滴加于试纸的加 样区，10分钟后观察结果。检测结果如表4所示。

表4

从实施例1和2以及对比例1和2的结果可以看出，本发明提供的胶体 金试纸条能够同时测定特异性的IgM和IgG，通过一次性操作即可联合检测 出样品中是否含有肺炎支原体或衣原体的特异性IgM和IgG，而且，本发明 的试纸条改进了现有联合检测IgM和IgG技术中漏检的缺点，在一次检测中 能够清楚的区分IgM和IgG的阴性和阳性，从而获取更多的相关信息。

从检测的符合率来看，本发明所提供的胶体金试纸条的特异性强，价格 低廉，读取结果快捷，一般仅需10-15分钟即可读取结果，而现有的技术比 如：ELISA方法检测需要3-4小时，需要专业的操作人员进行复杂的ELISA 操作过程，并且需要大型的仪器来获得检测结果。因此，本发明所提供的方 法快捷、直观，并且不需要特殊仪器设备，也不需要专业人员的操作，检测 结果的总体符合率较高，适合于现场检测。同时本发明克服了现有联合检测 IgM和IgG技术中易漏检的缺点，在一次检测中能够清楚的区分IgM和IgG 的阴性和阳性，从而获取更多的相关信息。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，在本发明的技术构思范 围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于 本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必 要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。