一种美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白及其应用

摘要

本发明公开了一种美国白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白及其应用，该美国白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白表达方法如下：构建pETSUMO-ABP-dHC-CecropinA表达载体，在大肠杆菌中表达，超声破碎后收集上清Ni

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白及其应用。

背景技术

随着抗生素的大量应用，致病菌耐药性的产生和新生抗生素的筛选瓶颈使得抗生素的应用受到一定的制约。近年来的研究发现，抗菌肽（Antimicrobal peptides，AMPs）以其独特的作用机理和分子特性成为有望替代传统抗生素的理想药物。

要将抗菌肽应用到生产实践，还有许多问题亟待解决，其中最主要的问题就是如何大量获取，现阶段主要通过以下3种途径获得抗菌肽：（1）天然提取；（2）化学合成；（3）基因工程表达。虽然生物提取可为工农业生产提供便宜、安全、可靠的抗菌肽产品，而且最早研究与发现抗菌肽往往采用生物提取的方法，但由于抗菌肽在动植物体内含量极微，因而天然提取抗菌肽往往杂质较多、提取率较低、费时长、工艺复杂，因此成本相对较高，无法实现大规模生产，这也成为制约抗菌肽进入实际应用的最大障碍。化学合成的方法虽然在生产上行得通，但是运用于产业化并不现实，特别是费用昂贵、对长链肽合成的低效率和抗菌活性不稳定的问题，使得其应用受到限制，仍不及通过基因工程在体外表达的发展潜力。利用基因工程方法来生产抗菌肽是一条理想途径，通过对基因工程菌种、表达载体、表达条件、分离纯化条件、表达系统等的不断改造与优化，得到了大量不同种类有活性的重组抗菌肽。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，具有很好的抗菌活性。本发明的另一目的是提供上述美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，由以下步骤获得：

1）根据美国白蛾天蚕素A基因序列设计引物A1、A2，以美国白蛾DNA为模板进行PCR，将PCR产物割胶回收，回收产物用Stu1和HindⅢ酶切，SUMO载体只用HindⅢ酶切，T4 DNA Ligase连接酶切后的载体和PCR产物，连接产物转化E.coli top10中，获得含Petsumo-ABP-dHC- Cecropin A重组菌株；挑选阳性重组菌株，扩大培养提取Petsumo-ABP-dHC- Cecropin A重组质粒，转化到大肠杆菌BL21；

2）IPTG浓度0.2 mmol/L，低温诱导含有重组载体pETSUMO-dHC- Cecropin A的大肠杆菌表达菌株BL21，20小时后4℃收菌，冰上超声破碎表达菌体，4℃，13000g，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni⁺-NTA柱洗去杂蛋白，收集目的多肽透析过滤除菌后保存；

其中，美国白蛾天蚕素A基因序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，所述的引物A1、A2序列分别为：

A1序列：5’- CAGGTGGAAGATCTTTAAGAAAATCG-3’，

A2序列：5’- CCCAAGCTTTTATTTTCTTAATGCTTTTGC-3’；

其中，A1的5’端具有Stu1酶切位点，A2的5’端具有HindⅢ酶切位点。

所述的美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，过Ni⁺-NTA柱洗去杂蛋白的步骤为：Binding Buffer平衡Ni⁺-NTA柱后，上样含可溶性重组多肽的上清，先用Washing buffer洗去杂蛋白，再用不同浓度的咪唑Tis HCl洗脱，目的多肽在洗脱浓度为250 mmol/L Imidazole，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris HCl，pH 8.0洗脱下来。

所述的美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白在抗真菌活性中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明通过基因重组方法获得美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，并在大肠杆菌中获得高效表达，目的多肽经过HPLC分析达到大95%的纯度，通过质谱分析，分子量与预测多肽分子量也吻合。经检测，多肽具有明显的抗真菌活性，所制备的目的多肽，其活性高、成本低。

附图说明

图1是pET-SUMO- ABP- dHC-Cecropin A质粒图；

图2是融合多肽SUMO-ABP- dHC-Cecropin A 37℃诱导表达12% SDS-PAGE图；

图3是融合多肽SUMO-ABP- dHC-Cecropin A纯化 12% SDS-PAGE图；

图4是SUMO酶切SUMO标签并获得ABP- dHC-Cecropin A的4-20% 梯度SDS-PAGE电泳图；

图5是SUMO酶切SUMO标签并获得ABP- dHC-Cecropin A的质谱分析图；

图6是表达的ABP- dHC-Cecropin  A 抗真菌抑菌圈图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。以下实施例中使用的美国白蛾由徐州林业站提供。

实施例1  克隆Cecropin A cDNA

1、提取美国白蛾总RNA。

应用RNA抽提试剂（TIANGEN）按照其操作手册提取美国白蛾蛹脂肪体的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度，大于95%，紫外分光光度计测定其浓度为720 ng/μL，满足使用需求。

2、采用Transgen cDNA逆转录试剂盒转录为第一链cDNA。

1）引物设计：根据NCBI惜古比天蚕，家蚕及果蝇Cecropin A序列比对设计兼并引物：

Cec-A1：5’- ATGAATTTCNCAANAATNNTNTNCTTCGT -3’，

Cec-A2：5’- NTATTTNCNAANGNTTTTNCNGTACCCAG -3’。

2）逆转录：在DEPC处理的1.5mL Eppendorf管中依次加入总RNA抽提物3μL，Oligo d（T）₁₈（0.5μg/μL）1μL，2×TS Reaction Mix 10μL，DEPC水5μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1μL；42℃孵育30min，85℃加热5min失活TransScript RT。将得到的cDNA分装后-20℃保存。

3）PCR：利用逆转录所得模板进行PCR，体系为25μL，10μmol/L上、下游引物（上游引物：5’- ATGAATTTCTCAAGAATTTTATTCTTC-3’，下游引物：5’- TTATTTTCCT AATGCTTTTG CGGTAC-3’）各1μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10×DreamTaq buffer 2.5μL，cDNA模板1.5μL，DreamTaq酶0.3μL，加ddH₂O 16.7μL。反应程序为：94℃ 5min，（94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min），30个循环，最后72℃延伸10min。反应完成后将产物于1%琼脂糖凝胶中电泳分离，用胶回收试剂盒回收得到DNA条带，克隆入pMD19-T载体，经含Amp抗生素（50mg/mL）的琼脂糖平板筛选转化子，挑出阳性克隆送往上海英骏测序公司进行碱基序列测定，得到192bp的片段，将该序列与惜古比天蚕和家蚕Cecropin A比对，具有很高的同源相似性，因此确定该序列为美国白蛾Cecropin A（美国白蛾ABP- dHC-Cecropin A）的cDNA，序列如SEQ ID NO.1所示，共440碱基，其中1-58号碱基为该基因的5’UTR非编码区，59-247号碱基是该基因的全长编码序列ORF区，翻译63个氨基酸（从137-247号碱基是该基因的功能区，翻译37个氨基酸），248-250为终止密码子序列，251-440号碱基为该基因的3’UTR非编码区。所表达的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，共63个氨基酸，为基因的ORF区表达产物。

实施例2  美国白蛾ABP- dHC-Cecropin A 大肠杆菌体外表达

将美国白蛾ABP-Cecropin A 序列构建到pET-SUMO质粒中区，如图1所示，获得pET-SUMO- ABP- dHC-Cecropin A，具体构建方法如下：

1）根据实施例1获得的ABP-dHC- Cecropin A序列设计引物A1、A2，

A1序列：5’- CAGGTGGAAGATCTTTAAGAAAATCG-3’，

A2序列：5’- CCCAAGCTTTTATTTTCTTAATGCTTTTGC-3’；

其中A1的5’端具有Stu1酶切位点，A2的5’端具有HindⅢ酶切位点。

以美国白蛾DNA为模板进行PCR，将PCR产物割胶回收，回收产物用Stu1和HindⅢ酶切，SUMO载体只用HindⅢ酶切，T4 DNA Ligase连接酶切后的载体和PCR产物，连接产物转化E.coli top10中，获得含pETSUMO-dHC- Cecropin A重组菌株。挑选阳性重组菌株，扩大培养提取pETSUMO-dHC- Cecropin A重组质粒，转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，挑选阳性菌株诱导表达，融合多肽SUMO-ABP- dHC-Cecropin A 37℃诱导表达结果如图2所示。

2）IPTG浓度0.2mmol/L，低温（16℃）诱导含有重组载体pETSUMO-ABP-dHC- Cecropin A的大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）20小时后，4℃收菌，冰上超声破碎（160W，工作4s，暂停8s，共99次）表达菌体，4℃，13000g，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni⁺-NTA柱。简要过程是：Binding Buffer平衡Ni⁺-NTA柱后，上样含可溶性重组多肽的上清，先用Washing buffer（20mmol/L Imidazole，0.5mol/L NaCl，20mmol/L Tris HCl，pH8.0）洗去杂蛋白，再用不同浓度的咪唑Tis HCl洗脱，目的多肽在洗脱浓度为250mmol/L Imidazole，0.5mol/L NaCl，20mmol/L Tris HCl，pH8.0洗脱下来。收集目的多肽（美国白蛾ABP- dHC-Cecropin A）透析过滤除菌后保存。

融合多肽SUMO-ABP- dHC-Cecropin A纯化电泳图如图3所示，SUMO酶切SUMO标签并获得ABP- dHC-Cecropin A的电泳图如图4所示， ABP- dHC-Cecropin A的质谱分析图如图5所示，可见目的多肽经过HPLC分析达到95%的纯度，且分子量与预测多肽分子量也吻合。

实施例3 美国白蛾ABP- dHC-Cecropin A抗真菌活性鉴定

1）抗白色念珠菌白色念珠菌Canidia albicans活性鉴定

采用琼脂糖孔穴扩散法测定大肠杆菌表达抗菌肽美国白蛾ABP- dHC-Cecropin A对白色念珠菌Canidia albicans的抗菌活性。接种Canidia albicans于液体土豆培养基，25℃ 200rpm培养2小时，按1%菌量加至融化的土豆琼脂糖培养基中（35-50℃），混匀后按10mL/皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入待测的样品后置于25℃培养箱48小时，观察抑菌活性，结果见图6A，具有明显的抗真菌活性。

2）抗粗糙脉孢菌Neurospora crassa活性鉴定

采用琼脂糖孔穴扩散法测定大肠杆菌表达抗菌肽美国白蛾ABP- dHC-Cecropin A对粗糙脉孢菌Neurospora crassa的抗菌活性。接种Neurospora crassa于液体土豆培养基，25℃ 200rpm培养2小时，按1 % 菌量加至融化的土豆琼脂糖培养基中 （35-50℃），混匀后按10 mL/皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入待测的样品后置于25℃培养箱48小时，观察抑菌活性，结果见图6B，具有明显的抗真菌活性。

3）抗根霉菌Rhizopus sp的活性鉴定

采用琼脂糖孔穴扩散法测定大肠杆菌表达抗菌肽美国白蛾ABP- dHC-Cecropin A对根霉菌Rhizopus sp的抗菌活性。接种Rhizopus sp于液体土豆培养基，25℃ 200rpm培养2小时，按1 % 菌量加至融化的土豆琼脂糖培养基中 （35-50℃），混匀后按10 mL/皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入待测的样品后置于25℃培养箱48小时，观察抑菌活性，结果见图6C，具有明显的抗真菌活性。

4）抗镰刀菌Fusarium sp的活性鉴定

采用琼脂糖孔穴扩散法测定大肠杆菌表达抗菌肽美国白蛾ABP- dHC-Cecropin A对镰刀菌Fusarium sp的抗菌活性。接种Fusarium sp于液体土豆培养基，25℃ 200rpm培养2小时，按1 % 菌量加至融化的土豆琼脂糖培养基中 （35-50℃），混匀后按10 mL/皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入待测的样品后置于25℃培养箱48小时，观察抑菌活性，结果见图6D，具有明显的抗真菌活性。

5）抗链格孢菌Alternaria sp的活性鉴定

采用琼脂糖孔穴扩散法测定大肠杆菌表达抗菌肽美国白蛾ABP- dHC-Cecropin A对链格孢菌Alternaria sp的抗菌活性。接种Alternaria sp于液体土豆培养基，25℃ 200rpm培养2小时，按1 % 菌量加至融化的土豆琼脂糖培养基中 （35-50℃），混匀后按10 mL/皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入待测的样品后置于25℃培养箱48小时，观察抑菌活性，结果见图6E，具有明显的抗真菌活性。

6）抗毛霉菌Mucor sp的活性鉴定

采用琼脂糖孔穴扩散法测定大肠杆菌表达抗菌肽美国白蛾ABP- dHC-Cecropin A对毛霉菌Mucor sp的抗菌活性。接种Mucor sp于液体土豆培养基，25℃ 200rpm培养2小时，按1%菌量加至融化的土豆琼脂糖培养基中（35-50℃），混匀后按10mL/皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入待测的样品后置于25℃培养箱48小时，观察抑菌活性，结果见图6F，具有明显的抗真菌活性。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京林业大学

 

<120>  一种美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白及其应用

 

<130>  100

 

<160>  7

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  440

<212>  DNA

<213>  美国白蛾

 

<400>  1

acatgggcac tgtatcgtca gttttgaaat taaataatta aattatttat ttcccgaaat     60

 

gaatttctca agaattttat tcttcgtgtt cgcttgtttc gtcgcgttgg cgagcgtttc    120

 

tgcggctcct gagcccaggt ggaagatctt taagaaaatc gagagagtgg ggcagaacgt    180

 

tcgtgatggc atcattaaag cgggtcctgc tattcaagtt ctgggtaccg caaaagcatt    240

 

aggaaaataa gcaatcatag attaaagact gaaaaaggaa aaaaatcttg aaatattcct    300

 

ccgtagtgga ctttcgccta tttgtacata actttagtat taaatttagt cttaaagaaa    360

 

ctttaagtat actgctataa tgtgctatat tacgttaaca tgactcaata aataatctta    420

 

tttattacaa aaaaaaaaaa                                                440

 

 

<210>  2

<211>  63

<212>  PRT

<213>  美国白蛾

 

<400>  2

 

Met Asn Phe Ser Arg Ile Leu Phe Phe Val Phe Ala Cys Phe Val Ala

1               5                   10                  15

 

 

Leu Ala Ser Val Ser Ala Ala Pro Glu Pro Arg Trp Lys Ile Phe Lys

20                  25                  30

 

 

Lys Ile Glu Arg Val Gly Gln Asn Val Arg Asp Gly Ile Ile Lys Ala

35                  40                  45

 

 

Gly Pro Ala Ile Gln Val Leu Gly Thr Ala Lys Ala Leu Gly Lys

50                  55                  60

 

 

<210>  3

<211>  29

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  Cec-A1

 

<400>  3

atgaatttcn caanaatnnt ntncttcgt                                       29

 

 

<210>  4

<211>  29

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  Cec-A2

 

<400>  4

ntatttncna angnttttnc ngtacccag                                       29

 

 

<210>  5

<211>  27

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  上游引物

 

<400>  5

atgaatttct caagaatttt attcttc                                         27

 

 

<210>  6

<211>  26

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  下游引物

 

<400>  6

ttattttcct aatgcttttg cggtac                                          26

 

 

<210>  7

<211>  26

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  A1序列

 

<400>  7

caggtggaag atctttaaga aaatcg                                         26

 

 

<210>  8

<211>  30

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  A2序列

 

<400>  8

cccaagcttt tattttctta atgcttttgc                                      30