用于生产丙型肝炎病毒多表位疫苗的表达载体PVX-6His-CTBt-Bt

摘要

本发明公开了一种用于生产丙型肝炎病毒多表位疫苗的表达载体PVX-6His-CTBt-Bt，该载体表达的丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt由组氨酸标签、口服免疫佐剂霍乱毒素B亚单位CTB和难治性丙型肝炎病毒基因型1的6个B细胞抗原表位Bp组成。为便于该疫苗在烟草高效表达，人工合成密码子优化的6His-CTBt-Bt基因，克隆至高效植物病毒表达载体马铃薯X病毒载体PVX201，获得丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt的重组表达载体PVX-6His-CTBt-Bt，该表达载体接种烟草，以烟草为反应器生产针对难治性丙型肝炎病毒的，易于纯化，有较好口服免疫效果和体外抗病毒感染的抗丙型肝炎病毒疫苗。

说明书

技术领域

本发明涉及抗病毒疫苗研发领域，尤其是涉及一种用于生产丙型肝炎（丙肝）病毒多表位疫苗的表达载体PVX-6His-CTBt-Bt。

背景技术

　　丙型肝炎病毒是丙型肝炎的致病因子，该病毒感染的世界总人数超过1.7亿，我国感染人数超过4000万。大多数丙型肝炎病毒感染者为持续性感染，进而引起慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。据报道，全球40%的慢性肝病和80%的肝细胞癌与丙型肝炎病毒有关，每年全球用于丙肝治疗费用超过1000亿美元。现有的治疗药物只对部分丙型肝炎肝病毒感染者有效，且治疗时间长，成本高和有副作用。疫苗是防治，特别是预防病毒性疾病的一种极其经济、简单和有效的手段。但是，至今还没有疫苗来预防和治疗丙型肝炎病毒感染。因此，研发具有自主知识产权的丙型肝炎病毒（特别是难治性丙型肝炎病毒）基因工程多表位疫苗具有极其重要的科学价值、无可估量的商业价值和社会效益。

植物作为制备基因工程疫苗生物反应器具有生产成本低、安全性好、可口服、容易运输和保存等优点，因而成为近年来国际上疫苗研究和生产的一个热点和发展趋势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于生产丙型肝炎病毒多表位疫苗的表达载体PVX-6His-CTBt-Bt。

本发明的目的是这样实现的：

（1）疫苗氨基酸组成设计：

丙型肝炎肝病毒多表位疫苗氨基酸组成设计：从N端至C端依次为6个组氨酸（便于疫苗纯化），口服免疫佐剂霍乱毒素B亚单位CTB（增强疫苗口服免疫效果），难治性丙型肝炎病毒基因型1的6个B细胞中和抗原表位Bt（E1_313-327aa-E2_396-424aa-E2_438-447aa-E2_523-540aa-E2_610-627aa-E2_631-648aa）。各个抗原表位之间通过一个甘氨酸和一个丝氨酸残基隔开）。>

（2）疫苗密码子优化：

为了促进疫苗基因在烟草的高表达，利用偏爱密码子在线分析软件http://www.bioinformatics.org/codon/cgi-bin/codon.cgi分析，合成6His-CTBt-Bt疫苗所需的优化密码子序列。

（3）疫苗基因合成

为了便于6His-CTBt-Bt疫苗基因的克隆和表达，对上述优化的丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt密码子序列，在其5’端引入ClaI酶切位点和烟草偏爱Kozak序列，3’端引入终止密码子和SalI酶切位点。使用在线分析软件http://helixweb.nih.gov/dnaworks/>

（4）疫苗表达载体构建及鉴定测序：

PCR合成的6His-CTBt-Bt疫苗基因和马铃薯X病毒载体PVX201，使用ClaI和SalI双酶切，连接，获得疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt，对表达载体进行酶切和测序鉴定。

（5）疫苗在烟草的表达和Western blot鉴定：

金刚砂磨损烟叶叶片，在磨损处接种疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt，同时以马铃薯X病毒PVX201（阴性对照）和PVX204（携带GFP基因接种烟叶作为对照，每个叶片接种病毒载体量为2-4μg。通过观察GFP蛋白表达验证、优化病毒接种和复制效果,制备烟草的蛋白提取物，分别使用鼠源的6×His Tag抗体（LanPower™）和CTB抗体（antibodies-online Inc），Western blot检测疫苗表达。Ni柱纯化表达的疫苗蛋白6His-CTBt-Bt。

（6）动物实验测定疫苗的免疫特性和安全性：

Ni柱纯化的疫苗蛋白口服免疫四周龄的BALB/c鼠三次（免疫时间为1，14和28天），每次每只鼠免疫10 µg的疫苗蛋白。不含疫苗的烟叶蛋白提取物（10 µg）免疫的鼠作为对照。实验组及对照组分别免疫三只鼠。不同时间取血，2倍系列稀释，ELISA测定不同时期（1，14，28，56和70天）抗体的滴度。阳性血清的OD值（490nm）大于阴性对照（疫苗免疫前的鼠血清和未进行疫苗免疫的鼠血清）OD值至少2倍的条件下，阳性血清的最大稀释度为此抗体的滴度。同时，疫苗免疫鼠前后，监测鼠体温和饮食，初步分析疫苗的安全性。

（7）丙肝病人血清反应实验测定疫苗的人体内抗原性：

ELISA测定30个随机选取的临床难治性丙型肝炎病毒（基因型1）病人血清（来自浙江省）与疫苗蛋白的反应性。20个随机选取的临床丙型肝炎病毒阴性血清（来自浙江省）作为阴性对照。阳性血清的OD值大于阴性对照OD值（20个丙型肝炎病毒阴性血清的平均值）2倍的条件下，判定疫苗蛋白与该阳性血清有反应性。

（8）病毒进入抑制实验测定疫苗的病毒感染抑制效果：

丙型肝炎病毒基因1型假病毒粒子（携带荧光素酶基因）用1 mg/ml的疫苗蛋白或0.5 mg/ml的CD81抗体（丙型肝炎病毒进入抑制的阳性对照）37度孵育2小时， 然后，未孵育和孵育的假病毒粒子分别感染Huh7细胞。三天后，收获病毒感染的细胞，荧光素活性（病毒滴度的指示剂）实验测定每种细胞内的病毒滴度，确定疫苗对病毒感染的抑制效果。

本发明依托已有的丙型肝炎病毒及其防治研究基础，基于烟草偏爱密码子和我国流行的难治性丙型肝炎病毒基因型1序列分析，利用马铃薯X病毒载体PVX201，通过分子生物学技术构建了用于生产难治性丙型肝炎病毒多表位疫苗的重组马铃薯X病毒表达载体PVX-6His-CTBt-Bt，该表达载体接种烟草，可生产具备免疫原性和体外抗型肝炎病毒感染的丙肝疫苗。

丙型肝炎病毒疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt及丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt可用来生产预防性或治疗性的丙型肝炎病毒疫苗或生产丙型肝炎病毒诊断试剂盒。>

附图说明：

图1: PVX-6His-CTBt-Bt载体的构建示意图， A：PVX-6His-CTBt-Bt载体示意图； B：ApaI/SaII酶切鉴定重组表达载体PVX-6His-CTBt-Bt；

图2: 疫苗在烟草的表达和鉴定示意图，A：PVX204和PVX201接种烟叶，12天后，制备烟叶蛋白提取物，Western blot检测（；B：PVX-6His-CTBt-Bt和PVX201接种烟叶，12天后，制备蛋白提取物，分别使用6×His Tag抗体（上图）和CTB抗体（下图）， Western blot检测；

图3: 疫苗的纯化和免疫原性示意图， A：Ni柱纯化的疫苗蛋白6His-CTBt-Bt； B：丙肝疫苗6His-CTBt-Bt免疫鼠血清的抗体滴度，M1，M2 和M3 表示疫苗免疫的三只鼠；

图4: 疫苗与丙型肝炎病毒感染病人血清反应的示意图，ELISA测定丙肝疫苗与临床难治性丙型肝炎病毒（基因型1）感染病人血清反应性，临床丙型肝炎病毒阴性血清作为阴性对照。丙型肝炎病毒阳性血清的OD值大于阴性对照OD值（20个丙型肝炎病毒阴性血清的平均值）2倍的条件下，判定疫苗蛋白与该阳性血清有反应性；

图5:疫苗体外抑制难治性丙型肝炎病毒（基因型1）的感染示意图，丙型肝炎病毒（基因型1）假病毒粒子用疫苗蛋白6His-CTBt-Bt， 37度孵育2小时后感染Huh7细胞。3天后，收获细胞，测定荧光素酶活性（病毒粒子滴度的指示剂）。

具体实施方式：

下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

PVX-6His-CTBt-Bt载体的构建与鉴定， 其方法如下：

（1）疫苗氨基酸组成设计：

丙型肝炎肝病毒多表位疫苗氨基酸组成设计：从N端至C端依次为6个组氨酸（便于疫苗纯化），口服免疫佐剂霍乱毒素B亚单位CTB（增强疫苗口服免疫效果），难治性丙型肝炎病毒基因型1的6个B细胞中和抗原表位Bt（E1_313-327aa-E2_396-424aa-E2_438-447aa-E2_523-540aa-E2_610-627aa-E2_631-648aa）。各个抗原表位之间通过一个甘氨酸和一个丝氨酸残基隔开）。>

　按上述要求设计的丙型肝炎肝病毒疫苗6His-CTBt-Bt氨基酸序列为：

His His His His His His Met Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe

1 5 1015

Thr Val Leu Leu Ser Ser Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile

202530

Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile His Thr Leu Asn

354045

Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met

505560

Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro

65707580

Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys

859095

Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu

100 105 110

Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met

115 120 125

Ala Asn Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp

130 135 140

Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ile Thr Ser Leu Phe Ser Arg Gly Pro Ser

145 150 155 160

Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg

165 170 175

Gly Ser Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Ala His Arg Phe Gly Ser

180 185 190

Gly Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu

195 200 205

Leu Asn Gly Ser Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr

210 215 220

Val Asn Phe Thr Ile Phe Gly Ser Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His

225 230 235 240

Arg Leu Asp Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg

245 250

（2）疫苗密码子优化：

为了促进疫苗基因在烟草的高表达，利用偏爱密码子在线分析软件http://www.bioinformatics.org/codon/cgi-bin/codon.cgi分析，合成6His-CTBt-Bt疫苗所需的优化密码子序列为：>

catatcgatg ccatgggaca tcatcatcat catcatatga ttaagcttaa gtttggagtt 60

ttttttactg ttcttctttc ttctgcttat gctcatggaa ctccacaaaa tattactgat120

ctttgtgctg aatatcataa tactcaaatt catactctta atgataagat tttttcttat180

actgaatctc ttgctggaaa gagagaaatg gctattatta cttttaagaa tggagctact240

tttcaagttg aagttccagg atctcaacat attgattctc aaaagaaggc tattgaaaga300

atgaaggata ctcttagaat tgcttatctt actgaagcta aggttgaaaa gctttgtgtt360

tggaataata agactccaca tgctattgct gctatttcta tggctaatat tactggacat420

agaatggctt gggatatgat gatgaattgg tctggatctg cttctggaat tacttctctt480

ttttctagag gaccatctca aaagattcaa cttgttaata ctaatggatc ttggcatatt540

aatagaggat ctggatttct tgctgctctt ttttatgctc atagatttgg atctggagtt600

ccaacttata attggggaga aaatgaaact gatgttcttc ttcttaatgg atctgattat660

ccatatagac tttggcatta tccatgtact gttaatttta ctatttttgg atctatgtat720

gttggaggag ttgaacatag acttgatgct gcttgtaatt ggactaga 768

（3）疫苗基因合成

为了便于6His-CTBt-Bt疫苗基因的克隆和表达，对上述优化的丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt密码子序列，在其5’端引入ClaI酶切位点和烟草偏爱Kozak序列，3’端引入终止密码子和SalI酶切位点。使用在线分析软件http://helixweb.nih.gov/dnaworks/>

1

catatcgatg ccatgggaca tcatcatcat catcatatga ttaagcttaa gttt 54

2

cagaagaaag aagaacagta aaaaaaactc caaacttaag cttaatcata tgatgatgat 60

3

gtttttttta ctgttcttct ttcttctgct tatgctcatg gaactccaca aaatattact 60

4

tgaatttgag tattatgata ttcagcacaa agatcagtaa tattttgtgg agttccatga 60

5

gtgctgaata tcataatact caaattcata ctcttaatga taagattttt tcttatactg 60

a 61

6

gccatttctc tctttccagc aagagattca gtataagaaa aaatcttatc attaagagta 60

7

gctggaaaga gagaaatggc tattattact tttaagaatg gagctacttt tcaagttgaa 60

8

cttcttttga gaatcaatat gttgagatcc tggaacttca acttgaaaag tagctccatt 60

9

tctcaacata ttgattctca aaagaaggct attgaaagaa tgaaggatac tcttagaatt 60

10

agcttttcaa ccttagcttc agtaagataa gcaattctaa gagtatcctt cattctttca 60

11

ctgaagctaa ggttgaaaag ctttgtgttt ggaataataa gactccacat gctattgctg 60

12

aagccattct atgtccagta atattagcca tagaaatagc agcaatagca tgtggagtct 60

13

aatattactg gacatagaat ggcttgggat atgatgatga attggtctgg atctgcttct 60

14

cttttgagat ggtcctctag aaaaaagaga agtaattcca gaagcagatc cagaccaatt 60

15

tttttctaga ggaccatctc aaaagattca acttgttaat actaatggat cttggcatat 60

16

aaaagagcag caagaaatcc agatcctcta ttaatatgcc aagatccatt agtattaaca 60

17

ctggatttct tgctgctctt ttttatgctc atagatttgg atctggagtt ccaacttata 60

18

taagaagaag aacatcagtt tcattttctc cccaattata agttggaact ccagatccaa 60

19

aaaatgaaac tgatgttctt cttcttaatg gatctgatta tccatataga ctttggcatt22

20

gatccaaaaa tagtaaaatt aacagtacat ggataatgcc aaagtctata tggataatca 60

21

tgtactgtta attttactat ttttggatct atgtatgttg gaggagttga acatagactt 60

22

gaggtcgact tatctagtcc aattacaagc agcatcaagt ctatgttcaa ctcctccaa59

使用上述22条引物，PCR合成疫苗基因6His-CTBt-Bt。

（4）疫苗表达载体构建及鉴定测序：

PCR合成的6His-CTBt-Bt疫苗基因和马铃薯X病毒载体PVX201（英国David Baulcombe教授惠赠），使用ClaI和SalI双酶切，连接，获得疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt，对表达载体进行酶切和测序鉴定。

按前面所述实验方法构建丙型肝炎病毒基因工程多表位疫苗的重组表达载体PVX-6His-CTBt-Bt载体（图1A），ApaI/SaII酶切鉴定表明构建载体正确（图1B），测序进一步证实：疫苗6His-CTBt-Bt的序列与设计序列吻合，表明重组表达载体PVX- 6His-CTBt-Bt已成功构建。

疫苗6His-CTBt-Bt的测序序列如下：>

gccatgggac atcatcatca tcatcatatg attaagctta agtttggagt tttttttact60

gttcttcttt cttctgctta tgctcatgga actccacaaa atattactga tctttgtgct 120

gaatatcata atactcaaat tcatactctt aatgataaga ttttttctta tactgaatct 180

cttgctggaa agagagaaat ggctattatt acttttaaga atggagctac ttttcaagtt 240

gaagttccag gatctcaaca tattgattct caaaagaagg ctattgaaag aatgaaggat 300

actcttagaa ttgcttatct tactgaagct aaggttgaaa agctttgtgt ttggaataat 360

aagactccac atgctattgc tgctatttct atggctaata ttactggaca tagaatggct 420

tgggatatga tgatgaattg gtctggatct gcttctggaa ttacttctct tttttctaga 480

ggaccatctc aaaagattca acttgttaat actaatggat cttggcatat taatagagga 540

tctggatttc ttgctgctct tttttatgct catagatttg gatctggagt tccaacttat 600

aattggggag aaaatgaaac tgatgttctt cttcttaatg gatctgatta tccatataga 660

ctttggcatt atccatgtac tgttaatttt actatttttg gatctatgta tgttggagga 720

gttgaacata gacttgatgc tgcttgtaat tggactagat aa762

实施例2

疫苗在烟草的表达和Western blot鉴定，其方法如下：

金刚砂磨损烟叶叶片，在磨损处接种疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt，同时以马铃薯X病毒PVX201（阴性对照）和PVX204（携带GFP基因接种烟叶作为对照，每个叶片接种病毒载体量为2-4μg。通过观察GFP蛋白表达验证、优化病毒接种和复制效果,制备烟草的蛋白提取物，分别使用鼠源的6×His Tag抗体（LanPower™）和CTB抗体（antibodies-online Inc），Western blot检测疫苗表达。Ni柱纯化表达的疫苗蛋白6His-CTBt-Bt。

按前面所述实验方法，重组表达载体PVX-6His-CTBt-Bt接种烟草。同时，作为病毒载体接种的阳性对照PVX204（表达GFP基因）接种烟叶，12天后， Western blot检测证实接种PVX204烟叶表达了GFP蛋白，但是，接种PVX201的烟叶，没有GFP蛋白表达（图2A）。因此，12天后，制备重组表达载体PVX-6His-CTBt-Bt接种烟草的蛋白提取物，分别使用6×His Tag抗体（图2A上）和CTB抗体（图2A下）， Western blot检测发现转染疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt的烟草成功表达了疫苗（图2B），作为阴性对照，接种空载体PVX201的烟草中没有疫苗蛋白带的出现（图2B）。这些结果表明：重组表达载体PVX-6His-CTBt-Bt接种的烟草成功表达了丙肝疫苗6His-CTBt-Bt。

实施例3

动物实验测定疫苗的免疫特性和安全性，其方法如下：

Ni柱纯化的疫苗蛋白口服免疫四周龄的BALB/c鼠三次（免疫时间为1，14和28天），每次每只鼠免疫10 µg的疫苗蛋白。不含疫苗的烟叶蛋白提取物（10 µg）免疫的鼠作为对照。实验组及对照组分别免疫三只鼠。不同时间取血，2倍系列稀释，ELISA测定不同时期（1，14，28，56和70天）抗体的滴度。阳性血清的OD值（490nm）大于阴性对照（疫苗免疫前的鼠血清和未进行疫苗免疫的鼠血清）OD值至少2倍的条件下，阳性血清的最大稀释度为此抗体的滴度。同时，疫苗免疫鼠前后，监测鼠体温和饮食，初步分析疫苗的安全性。

按前面所述实验方法，Ni柱纯化疫苗蛋白6His-CTBt-Bt（图3A，Lane 1，疫苗蛋白量约为烟草提取物总蛋白量的0.18%），纯化的疫苗蛋白口服免疫BALB/c鼠三次（免疫时间为1，14和28天），ELISA测定不同时期（1，14，28，56和70天）抗体的滴度。与对照组（不含疫苗的烟草提取物免疫鼠）相比， 14天时疫苗免疫鼠检测到抗体出现， 56天时达到峰值（三只疫苗免疫鼠血清的抗体滴度分别为：1：90000； 1：60000；1：80000）， 然后抗体滴度下降（图3B）。这些结果表明：烟草表达的丙肝疫苗免疫鼠，诱导了体液免疫反应。同时，疫苗免疫前后，鼠体温和进食量没有明显变化，表明疫苗免疫鼠并没有对鼠产生明显的体内毒性。

实施例4

丙肝病人血清反应实验测定疫苗的人体内抗原性，其方法如下：

ELISA测定30个随机选取的临床难治性丙型肝炎病毒（基因型1）病人血清（来自浙江省）与疫苗蛋白的反应性。20个随机选取的临床丙型肝炎病毒阴性血清（来自浙江省）作为阴性对照。阳性血清的OD值大于阴性对照OD值（20个丙型肝炎病毒阴性血清的平均值）2倍的条件下，判定疫苗蛋白与该阳性血清有反应性。

实施例3 发现烟草表达的疫苗6His-CTBt-Bt诱导鼠产生高滴度的抗体，说明烟草表达的丙肝疫苗6His-CTBt-Bt在鼠体内具有很好的免疫原性。为了进一步确定是否烟草表达的疫苗在人体内也具有免疫原性，ELISA实验测定丙肝疫苗与临床难治性丙型肝炎病毒（基因型1）病人血清的反应性。临床丙型肝炎病毒阴性血清作为阴性对照。丙肝疫苗6His-CTBt-Bt与30个临床难治性丙型肝炎病毒（基因型1）病人血清中的29个发生反应，反应率为96.67%(图4)。这些结果表明烟草表达的丙肝疫苗6His-CTBt-Bt在人体内具有很好的抗原性，也说明烟草表达的6His-CTBt-Bt可应用于临床难治性丙型肝炎病毒（基因型1）感染者的诊断。

实施例5

病毒进入抑制实验测定疫苗的病毒感染抑制效果，其方法如下：

丙型肝炎病毒基因1型假病毒粒子（携带荧光素酶基因，日本Takaji Wakita教授惠赠）用1 mg/ml的疫苗蛋白或0.5 mg/ml的CD81抗体（丙型肝炎病毒进入抑制的阳性对照）37度孵育2小时， 然后，未孵育和孵育的假病毒粒子分别感染Huh7.5.1细胞（美国Francis V. Chisari教授惠赠）。三天后，收获病毒感染的细胞，荧光素活性（病毒滴度的指示剂）实验测定每种细胞内的病毒滴度，确定疫苗对病毒感染的抑制效果。

按前面所述实验方法，难治性丙型肝炎病毒（基因型1）假病毒粒子用疫苗蛋白孵育，感染Huh7.5.1细胞。3天后，收获细胞，测定荧光素酶活性（病毒粒子滴度的指示剂）。与未孵育的难治性丙型肝炎病毒（基因型1）假病毒粒子相比，丙肝疫苗6His-CTBt-Bt孵育强烈抑制病毒粒子感染，使病毒感染性降低了86.5%。 作为阳性对照，CD81孵育病毒粒子显著降低了病毒感染性（图4）。这些结果表明：烟草表达的疫苗6His-CTBt-Bt在体外具备很强的中和难治性丙型肝炎病毒（基因型1）病毒感染的能力。