一种抗J亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及动物病毒学和免疫学领域，提供了一种抗J亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗，该疫苗采用原核表达后筛选纯化的高活性的重组蛋白His-cENV联合弗氏佐剂制备而得，其中编码重组蛋白His-cENV的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示，利用该表位疫苗免疫7日龄种禽雏鸡可以产生1:128000的中和抗体，体外病毒中和实验、动物实验显示该表位疫苗可中和不同ALV-J分离毒株，有效保护鸡群抵抗ALV-J毒株感染，该表位疫苗基于env来源的多表位抗原基因序列，克服了ALV-J的病毒变异，开辟了ALV-J疫苗新时代，提供了抗ALV-J感染的新手段，为ALV-J的防控提供了技术支撑。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体提供了一种抗J亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗及其制 备方法和应用。

背景技术

J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒(ALV-J)引起的一种肿瘤性传染病，临床上主 要以髓细胞性白血病多见，多以免疫抑制、生长抑制和多器官组织出现肿瘤等为其主要特征。 我国J亚群禽白血病的发生已相当普遍，临床病例从最初的商品肉鸡群发展到商品蛋鸡、地 方种鸡群及其他家禽，并伴随着致瘤性增强及肿瘤多样性的发生。研究显示，我国的J亚群 禽白血病毒呈现高感染率、高发病率，早期感染普遍、发病日龄明显提前，混合感染多发/ 频发，宿主范围扩展、肿瘤谱扩大，病理变化复杂化等特点，给我国的养禽业造成了巨大的 损失。基于J亚群禽白血病毒囊膜蛋白的超变特性，加之自身的免疫逃避能力及宿主的免疫 选择压力，使得禽白血病病毒的抗原变动性极大，成为其传统灭活疫苗、弱毒疫苗研制无法 逾越的瓶颈。目前，临床上尚无相关药物及疫苗用于J亚群禽白血病的防控。国外通过净化 控制本病的发生，由于净化周期长、成本高，在我国目前还未能有效实施，只能通过淘汰感 染鸡只进行大群净化，无法控制ALV-J的感染，不断出现ALV-J大范围密集感染的报道，我 国的J亚群禽白血病防控形势严峻。国内外均有过对于J亚群禽白血病的疫苗研发方法的报 道，主要为传统的甲醛灭活疫苗、弱毒疫苗，基于SU的亚单位疫苗、核酸疫苗，这些疫苗在 一定程度上可以对机体提供保护，但都会造成毒力恢复以及散毒的可能，免疫效果不稳定无 法临床应用。基于以上现状，研制安全高效的表位疫苗对于J亚群禽白血病病毒的防控具有 重大现实意义。

表位疫苗是近年发展起来成熟的新型疫苗，在人源病毒中研究深入。表位疫苗是利用基 因工程手段，体外表达或人工合成病原微生物的表位，继而开发出预防性或治疗性疫苗。表 位疫苗相对传统疫苗拥有较多优势，表位肽短小，免疫原性强，可以克服主要组织相容性复 合体(MHC)分子的遗传限制，本身安全、无毒、稳定，可以直接刺激机体产生特异性免疫反应， 其最大的优点就是可以克服传统疫苗造成的毒力恢复或散毒的可能，有着非常广阔的发展前 景。目前，已开发出有效的艾滋病病毒、乙肝病毒、人类疱疹病毒等表位疫苗。ALV-J属于 反转录病毒。病毒囊膜蛋白(env)可分为由gp85基因编码的表面蛋白(surface protein,SU) 和gp37基因编码的跨膜蛋白(transmembrane protein，TM)，二者在一起形成二聚体，病毒 囊膜蛋白决定亚群的特异性。gp85是病毒囊膜蛋白表面的主要成分，在ALV感染吸附宿主细 胞并诱导机体产生特异性抗体中具有重要作用，含有众多的抗原表位，负责识别靶细胞膜上 的特异性受体，TM主要负责介导病毒与细胞的融合过程。基于ALV-J的病毒特性，表位疫苗 的研究成果为对抗ALV-J的超变特性，成功研制ALV-J疫苗提供了科学基础和技术支撑。

发明内容

针对现有技术中的相关情况，发明人考虑将表位疫苗应用于抗禽J亚群禽白血病病毒感 染疫苗，进而经研究实验后提供了一种抗J亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗，该疫苗采用 原核表达后筛选纯化的高活性的重组蛋白His-cENV联合弗氏佐剂制备而得，其中编码重组蛋 白His-cENV的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示，利用该表位疫苗免疫7日龄种禽雏鸡可以 产生1:128000的中和抗体，体外病毒中和实验、动物实验显示该表位疫苗可中和不同ALV-J 分离毒株，有效保护鸡群抵抗ALV-J毒株感染，该表位疫苗基于env来源的多表位抗原基因 序列，克服了ALV-J的病毒变异，开辟了ALV-J疫苗新时代，提供了抗ALV-J感染的新手段， 为ALV-J的防控提供了技术支撑。

发明人经研究发现ALV-J在整个env都存在不同的抗原表位，通过筛选env上的抗原表 位可以开发有效的多表位疫苗。通过发明人前期对ALV-J的致病性进行了系统深入的研究， 在系统解析其免疫抑制机制、跨种传播机制和免疫逃避机制的基础上，结合多表位可以传递 广谱表位信息这一理念，最终制备了抗禽J亚群禽白血病病毒感染疫苗，可以避免由于病毒 变异而造成的免疫失败，有利于提供更完全和更有针对性的免疫保护，表位疫苗的研究成果 为的研制开辟了新的方向和重要的技术支撑。

本发明的具体技术方案如下：

通过分析获得NCBI上发表的ALV-J囊膜上的抗原表位，筛选出代表流行毒株的抗原表 位基因序列，通过采用编码甘氨酸、丝氨酸的密码子进行串联，最终确定人工合成基因片段 998bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，原核表达出重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示，联合弗氏佐剂制备表位疫苗，所获得的表位疫苗可以实现保护机体抵抗J亚群禽白血 病感染。

其具体过程如下：

查找NCBI上发表的ALV-J囊膜基因序列，结合国内外对ALV-J抗原表位及免疫逃避机 制的研究进展，运用DNAman软件分析获得来源于囊膜基因的22段抗原表位，筛选出代表流 行毒株囊膜抗原表位基因序列，采用编码甘氨酸、丝氨酸的密码子进行串联，获得重组囊膜 基因序列998bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述基因序列5’端含Nco Ⅰ酶切位点， 3’端含Xho Ⅰ酶切位点。

上述基因序列由上海生工生物工程有限公司合成，合成产物cENV连接至pUC57载体。

合成产物测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

将该基因片段连接至pET30a载体，得到了重组载体pET30a-cENV，使用1-1.5mmol/L IPTG 诱导表达得到带有HIS标签的重组蛋白His-cENV，进而利用该蛋白联合弗氏佐剂制备表位疫 苗。

本发明的这种表位疫苗安全高效，成本低易于大规模批量生产，可抵抗45％ALV-J毒株 的感染，二免后抗体维持时间达到11周，可以实现对种鸡开产前的保护，从而切断病毒的垂 直传播途径，对于我国J亚群禽白血病的防控净化具有重要意义，且特异性强可以实现对禽 J亚群禽白血病的保护；同时由于其含有广谱的表位信息，可以避免由于病毒变异而造成的 免疫失败，为J亚群禽白血病的防治提供更完全和更有针对性、更为高效安全的疫苗保护。

附图说明

图1为重组质粒双酶切鉴定结果电泳图，

图中M为DL10000Marker，1为使用限制性内切酶EcoR I、Xho I双酶切pUC57-cENV后 获得的基因片段；

图2为重组表达菌表达结果及蛋白纯化前后SDS-PAGE分析结果，

图中M为170KD Protein Ladder；1为诱导表达菌液沉淀，2为上清，3为大量表达蛋白 沉淀，4为大量表达蛋白纯化后结果；

图3为Western Blot法检测重组蛋白，

图中A使用HR1多抗，B使用HR2多抗，C使用His标签抗体，D使用鸡抗SU多抗，E使 用鼠抗gp85多抗，验证结果。

具体实施方式

本实施例中所采用的具体试剂和仪器为：

(1)主要试剂

HRP酶标二抗为博奥森生物有限公司产品；

TMB单组份底物显色溶液，DAB显色试剂盒，PCR产物胶回收试剂盒为天根公司产品；

蛋白预染Marker，Taq聚合酶，限制性内切酶EcoR I、Xho I为Thermo公司产品；

T4连接酶、pMD18-T载体、DNA Marker为大连宝生物有限公司产品；

质粒抽提试剂盒为OMEGA公司产品；

His标签抗体为北京全式金生物技术有限公司产品；

胰蛋白胨(Tryptone)及酵母抽提物(Yeast Extract)为Oxiod公司产品；

其余试剂为国产分析纯试剂。

(2)主要仪器

移液器、分光光度计为Eppendorf公司产品；

低温高速离心机为湖北湘仪公司产品；

凝胶成像系统为北京君意公司产品；

酶标仪为Thermo公司产品；

恒温摇床为上海申能博彩公司产品；

恒温培养箱、超净工作台为上海博迅公司产品；

电泳仪、SDS-PAGE电泳槽、Western-blot膜转印装置为北京六一公司产品；

细胞超声波粉碎机为宁波新芝生物有限公司产品。

除上述列出内容外，本发明未提及的部分均采用现有技术。

实施例1ALV-J多表位基因的筛选合成

查找NCBI上发表的ALV-J囊膜基因序列，运用生物信息学方法分析获得囊膜抗原表位 22段，筛选出代表近几年中国流行毒株囊膜抗原表位基因序列，采用编码甘氨酸、丝氨酸密 码子进行串联，获得重组囊膜基因序列998bp，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。所述基因 序列5’端含Nco Ⅰ酶切位点，3’端含Xho Ⅰ酶切位点。

上述基因序列由上海生工生物工程有限公司合成，并由其进一步将合成产物cENV利用 常规工艺连接至pUC57载体。

合成产物测序，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；

将pET30a和上述连接了目的基因的pUC-57克隆载体分别用限制性内切酶Nco Ⅰ和Xho  Ⅰ在37℃水浴条件下进行双酶切60min，用1％琼脂糖凝胶电泳后按照胶回收试剂盒说明书 的要求分别回收大片段和目的基因片段；

双酶切结果如图1，

将上述获得的目标物22℃过夜连接，其中连接体系为:pET30a载体0.5μl，cENV基因 片段1μl，ddH2O20μl，T4DNA连接酶1μl，10×Green Buffer2.5μl，总体积共25μl， 获得连接产物pET30a-cENV重组质粒。

将连接产物pET30a-cENV重组质粒按照常规方法转入0.1％CaCl2制备的感受态细菌BL21 中，涂布于含有卡那霉素的LB平板中，37℃过夜培养，次日挑取单菌落，摇菌，提取质粒进 行双酶切鉴定后送去测序，确认其中具有如SEQ ID NO.1所示的序列，可见获得的重组囊膜 基因998bp的片段已经成功克隆入pET30a-cENV重组质粒中。

实施例2重组囊膜蛋白的表达和纯化

将测序后含有重组质粒的阳性BL21菌接种于含卡那霉素(终浓度为10μg/ml)的LB液体 培养基中(市购常规培养基，其中含有1％(w/v)Tryptone，0.5％(w/v)Yeast Extract，1％(w/v) NaCl，0.1mg/ml Kanamycin)，37℃振荡(200rpm)，培养至OD600＝1.0，加入浓度为500mMol 的IPTG至整个培养基中IPTG的终浓度为1mmol/L，37℃继续培养4h，同时设未诱导的重组 质粒转化BL21菌作为对照。

经SDS-PAGE分析显示，检测步骤如下：收集培养的工程菌菌液，5000rpm，离心5min， 弃上清，沉淀利用标准的PBS重悬获得重悬液；按照100ml初始培养基加入标准PBS3ml的 比例，向沉淀中加入标准的PBS获得重悬液。重悬后分装与5ml离心管中每管3ml。将离心 管置于冰水混合物的烧杯内，用超声破碎仪超声破菌，120W，工作1s，间歇2s，超声90个 循环，重复一次；将超声破菌液转入50ml离心管中，配平，放入高速冷却离心机中，8000rpm， 4℃，离心10min，然后用SDS-PAGE电泳检测；结果上清中无蛋白(未显示)，蛋白存在于沉 淀中，说明重组蛋白His-cENV以包涵体形式表达，如图2所示，目的蛋白大小约为33KD。

重组蛋白的纯化步骤如下：

将上述离心获得的沉淀用9倍体积的洗涤液I重悬沉淀，静置5min后，8000rpm，4℃， 15min，弃上清。用9倍体积的洗涤液II重悬沉淀，静置5min后，8000rpm，4℃，15min弃 上清，保留沉淀。用9倍体积的洗涤液III重悬沉淀，静置5min后，8000rpm，4℃，15min， 弃上清，保留沉淀。按100ml菌液加4-10ml溶解液，4℃过夜。8000rpm，4℃，15min。取上 清，即为纯化蛋白。

包涵体纯化所述试剂配制方法：

(1)细菌重悬液(250ml):PBS(NaCl2g,KCl0.05g,Na₂HPO₄0.36gKH₂PO₄0.06g),1 mmol/L EDTA.

(3)溶液I(500ml)：500mmol/L Tris-Cl(pH＝6.0)，50mmol/L NaCl，50mmol/L EDTA

(3)溶液II(250ml)：溶液I，1M尿素

(4)溶液III(250ml)：溶液I，2M尿素

(5)包涵体溶解液(250ml)：溶液I，8M尿素

SDS-PAGE法与Western Blot法检测纯化后的蛋白(图2和3所示)。得到的蛋白经过 Bradford法测定蛋白含量，2ml离心管分装-80℃保存备用。

上述使用的SDS-PAGE法为常规方法，未提及的试剂为常规方法规定使用的试剂，其具 体操作步骤如下：

1)将玻璃板洗干净，用夹子固定，垂直放置，配置12％分离胶，快速注入到两玻璃板之 间，胶上部加蒸馏水封口，以保持胶面平整。待分离胶凝固后，倒去分离胶表面的蒸馏水， 用滤纸吸去残留水。注入浓缩胶，快速插入梳子，并注意防止气泡的产生。

2)取纯化后的重组蛋白加入15-20μl4×SDS上样buffer，煮沸10min。

3)往电泳槽加入1×Tris-甘氨酸缓冲液，待浓缩胶凝固，小心拔掉梳子，用缓冲液冲 洗加样孔，用微量进样器上样，20μl/孔，正确连接电泳槽正负极，打开电源。120V电压电 泳，电泳至溴酚蓝到达胶的底部时停止电泳。

4)染色：取下凝胶，用蒸馏水冲洗，放入考马斯亮蓝染色液中，染色4h以上。

5)脱色：将凝胶放入脱色液中，置于摇床上脱色，期间更换3次以上脱色液，待凝胶 蓝色背景全部脱去停止，将凝胶放入蒸馏水中终止脱色。拍照保存，如图2所示，出现了大 小约为33KD的目的重组蛋白条带。

6)剪一张与Western Blot凝胶大小相同的NC膜，用去离子水浸透，同时将与凝胶大 小相同的两张滤纸及纤维垫用转印缓冲液浸透。

7)按三明治法安装转印装置，即负极夹-纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-纤维垫-正极 夹，使NC膜位于转印的正极面，凝胶位于负极面，其间无任何气泡间隙。将转印装置放入转 移电泳仪中，加入转移缓冲液，140mA电泳2h。

8)转印结束后，将转移后的NC膜用去离子水漂洗一遍，将NC膜浸泡于封闭液中，4℃ 封闭过夜。

9)用PBST洗涤NC膜三遍，每次10min。

10)使用His标签抗体为一抗，NC膜与一抗37℃反应1h，用PBST洗膜三次，10min/ 次。

11)NC膜置于HRP标记的羊抗鼠IgG中，37℃反应1h，用PBST洗膜三次，10min/次。

12)使用DAB显色试剂盒避光显色；此时应密切观察显色过程，并在较浅本底且达到适 当显色强度时流水终止显色。拍照保存，如图3所示，出现了大小约为33KD的目的重组蛋白 条带。

实施例3重组蛋白的活性检测

使用上述纯化得到的His-cENV蛋白包被ELISA板，使用酶联免疫吸附试验检测该蛋白 的生物学活性。以gp85蛋白免疫鼠阳性血清、HR1多肽、HR2多肽免疫鸡阳性血清以及IDEXX 检测试剂盒检测为阳性的鸡血清为阳性对照，健康SPF鸡血清为阴性对照，HRP标记羊抗鼠 IgG、羊抗鸡IgG酶标二抗按说明书使用。结果显示阳性对照与阴性对照的OD值比值大于2.1， 说明该蛋白有良好的生物学活性和抗原性。

ELISA具体步骤如下：

1)包被：取纯化的重组蛋白，以生理盐水稀释至最佳浓度，包被反应板，100μl/孔， 4℃过夜。

2)洗涤：甩去酶标板中的包被液，用PBST(PBS，0.05％Tween-20)加满各孔，摇床震 荡3min，弃去PBST，洗涤3次，3min/次，拍干。

3)封闭：各孔加入封闭液(3％脱脂乳)，350μl/孔，置37℃培养箱孵育0.5h，洗涤3 次，3min/次，拍干。

4)加样：将待待检血清按梯度稀释后加入包被板，100μl/孔，同时设立阴阳性血清对 照。置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，3min/次，拍干。

5)用封闭液将HRP标记羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgG酶标二抗按1:5000稀释，100μl/孔， 置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，3min/次，拍干。

6)显色：使用TMB单组份显色试剂盒(TIANGEN公司产品)按100μl/孔加入包被板， 37℃条件下避光显色20min加终止液，2M H2SO4终止显色。

7)用酶联免疫检测仪测其在波长450nm检测各个孔的OD值，阴性对照OD450值为N， 阳性对照OD450值为P。若P/N>2.1判为阳性。

实施例4抗J亚群禽白血病病毒感染表位疫苗的制备

1)从东岳种禽有限公司购买1日龄海兰褐雏鸡50只，隔离罩条件下分组饲养，分别采 集血清及棉拭子，使用IDEXX试剂盒检测ALV-J抗体和ALV抗原均为阴性；

其中所述的分组为空白对照组—O组10只，免疫His-cENV组—1组20只，免疫His-cENV +弗氏佐剂组—2组20只。

2)将上述获得的纯化蛋白进行浓度测定，当测定浓度达到7.6mg/ml后，即可使用PBS 将其稀释至1mg/ml，将稀释后的蛋白溶液与弗氏佐剂按照体积比1:1的比例配制，在振荡器 上混匀后用1ml的注射器分装，每管0.2ml；

其中所述的1mg/ml的重组蛋白溶液用pH为7.4，1×PBS缓冲液稀释获得的；

7日龄通过肌肉注射的方式对腿肌进行多点免疫，免疫组每只鸡免疫蛋白0.1g，对照组 注射相同剂量灭菌PBS，两周后加强免疫一次。

3)抗体消长规律监测，首次免疫后10天、二免10天后每周采集血清测定抗体效价；

其中所述的抗体效价测定，主要将待检血清以10倍倍比稀释，其他操作步骤同ELISA 检测重组蛋白活性过程。

实施例5体外病毒中和效果检测

病毒中和试验例1

发明人采用加强免疫制备的高效价血清进行病毒中和实验；

ALV-J NX0101毒株是2001年从我国宁夏地区肉鸡中分离到的一株纯的J亚群禽白血病 毒株，背景清晰；

实验前将血清样品56℃，30min灭活，除去非特异性物质，将ALV-J NX0101病毒液用 无菌的DMEM培养液稀释至1TCID50/0.1ml、10TCID50/0.1ml、100TCID50/0.1ml，取250μl 稀释的病毒液与等量的灭活血清充分混匀后37℃孵育1小时，接种于长满单层DF-1细胞的 24孔板中，每孔200μl，并设立只加病毒液和只加血清的对照，接种1小时后换含1％肽牛 血清的DMEN培养液维持7天，取细胞上清用ALV抗原检测试剂盒检测上清中病毒含量，结果 显示100TCID50/0.1ml组、病毒液对照组为阳性，其余为阴性，并且100TCID50/0.1ml组阳 性值明显低于病毒液对照组，说明重组蛋白His-cENV联合弗氏佐剂制备的表位疫苗诱导机体 产生的抗体能够在体外条件下与ALV-JNX0101毒株发生中和反应，且效果显著，证明本发明 所提供的表位疫苗能够保护鸡群抵抗J亚群禽白血病的感染。

病毒中和试验例2

ALV-J WS0705毒株是2007年从山东蛋鸡分离到的一株纯的J亚群禽白血病毒株，背景 清晰；

发明人采用试验例1相同方法进行病毒中和实验，操作过程一致，结果显示 100TCID50/0.1ml组、病毒液对照组为阳性，其余为阴性，并且100TCID50/0.1ml组阳性值 明显低于病毒液对照组，说明明重组蛋白His-cENV联合弗氏佐剂制备的表位疫苗诱导机体产 生的抗体能够在体外条件下与ALV-J WS0705毒株发生中和反应，且效果显著，证明本发明所 提供的表位疫苗能够保护鸡群抵抗J亚群禽白血病的感染。

病毒中和试验例3

ALV-J DZ1022毒株是2011年从山东蛋鸡分离到的一株纯的J亚群禽白血病毒株，背景 清晰；

发明人采用试验例1相同方法进行病毒中和实验，操作过程一致，结果显示 100TCID50/0.1ml组、病毒液对照组为阳性，其余为阴性，并且100TCID50/0.1ml组阳性值 明显低于病毒液对照组，说明明重组蛋白His-cENV联合弗氏佐剂制备的表位疫苗诱导机体产 生的抗体能够在体外条件下与ALV-J DZ1022毒株发生中和反应，且效果显著，证明本发明所 提供的表位疫苗能够保护鸡群抵抗J亚群禽白血病的感染。

实施例6体内试验检测

重组蛋白联合弗氏佐剂免疫7日龄种禽雏鸡，19日龄加强免疫一次，10天后进行攻毒 观察免疫保护效果，同时设ALV-J感染阳性对照组及阴性对照组。

饲养至14周龄，全部剖杀，期间每周进行血液学、组织病理学观察以及病原学检测抗 病毒效果；

结果显示免疫保护组鸡群生长良好，血液各项指标未见明显变化，ALV抗原检测阴性， 无排毒现象，病理组织学检测未见组织损伤及炎症反应。而ALV-J阳性对照组出现严重的病 毒血症，肝脏及肾脏等重要脏器出现明显的损伤和炎症。实验证明该表位疫苗可以保护鸡群 抵抗ALV-J的感染。

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