一种用于防治肾型传染性支气管炎的复合物及其制备方法

摘要

本发明提供了一种用于防治肾型传染性支气管炎的复合物及其制备方法，所述复合物由纯化好的灭活抗原和血凝抑制效价大于1：512的高免蛋黄抗体组成，所述灭活抗原和高免蛋黄抗体的体积比为2～4：8～6；制备方法为：取灭活的纯化抗原和血凝抑制效价大于1：512的高免蛋黄抗体按体积比2～4：8～6进行配比，混合后进行灭活，即得；所述复合物具有性能稳定、安全性好、动物免疫后产生免疫作用快、免疫力强、治愈率高等特点，其制备方法简单，适合规模化工业生产的需要。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗原抗体复合物及其制备方法，尤其是一种用于防治肾 型传染性支气管炎的复合物及其制备方法。

背景技术

肾型传染性支气管炎(IB嗜肾型)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)嗜 肾型引起的一种高度接触性传染病，主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统 和消化系统。雏鸡发病后通常表现流鼻液、呼吸困难、腹泻等呼吸道症状， 甚至发生死亡，剖检发现，除呼吸系统发生出血性变化外，还伴有肾脏肿大、 消化系统出血等病变。该病还可以导致蛋鸡产蛋率下降和蛋的品质下降，是 目前严重危害世界养禽业的重大传染病之一，给养禽业造成了巨大的经济损 失。

对于肾型传染性支气管炎目前尚无特殊疗法，主要采用接种疫苗的方式。 由于传染性支气管炎病毒血清型复杂且相互之间交叉保护力弱，而且新的血 清型和变异株不断出现，所以用疫苗前必须掌握当地疾病流行的病毒血清型， 并使用与当地流行毒株抗原性一致的疫苗品系，才能达到有效的免疫预防目 的。目前市场上还是主要以弱毒苗预防为主，但在疾病发生时作为紧急接种 免疫，效果往往达不到预期效果，因此，针对目前这种状况，研制出一种安 全、快速、高效、经济、稳定的，专门针对肾型传染性支气管炎疾病发生的 生物制剂就显得尤为重要和迫在眉睫。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于防治肾型传染性支气管炎 的复合物。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述用于防治肾型传染性支气 管炎的复合物的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种用于防治肾型传染性支气管炎的复合物，由纯化好的灭活抗原和血 凝抑制效价大于1：512的高免蛋黄抗体组成，所述纯化好的灭活抗原和血凝 抑制效价大于1：512的高免蛋黄抗体的体积比为2～4：8～6。

优选的，上述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物，所述纯化好的灭 活抗原和血凝抑制效价大于1：512的高免蛋黄抗体的体积比为3：7。

优选的，上述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物，所述复合物的病 毒价EID₅₀≥10⁷/0.1ml.

优选的，上述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物，所述复合物为淡 黄色稍带乳白色颗粒的透明液体，PH值5.5～6.5，HI试验检测所述复合物的 抗体效价≥1：64。

上述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物的制备方法，具体制备步骤 如下：

(1)取灭活的纯化抗原和血凝抑制效价大于1：512的高免蛋黄抗体按体 积比2～4：8～6进行配比；

(2)混合后进行灭活，即得。

优选的，上述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物的制备方法，所述 步骤(2)中混合后，在其混合体中加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，充分搅 拌均匀，37℃保温密封8～12小时，用0.22um微孔滤膜过滤除菌，灭活即得 抗体效价≥1:64的鸡肾型传染性支气管炎灭活抗原与高免蛋黄抗体复合物。

本发明的有益效果是：

上述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物，具有性能稳定、安全性好、 动物免疫后产生免疫作用快、免疫力强、治愈率高等特点，其制备方法简单， 适合规模化工业生产的需要。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。

实施例1

一种用于防治肾型传染性支气管炎的复合物，由纯化好的灭活抗原和血 凝抑制效价为1：1024的高免蛋黄抗体组成，所述纯化好的灭活抗原和血凝抑 制效价为1：1024的高免蛋黄抗体的体积比为3：7。

上述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物的制备方法，具体制备步骤 如下：

(1)取灭活的纯化抗原和血凝抑制效价为1：1024的高免蛋黄抗体按体 积比3：7进行配比；

(2)混合后，在其混合体中加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，充分搅拌 均匀，37℃保温密封10小时，用0.22um微孔滤膜过滤除菌，灭活即得抗体效 价为1：1024的鸡肾型传染性支气管炎灭活抗原与高免蛋黄抗体复合物，该复 合物的病毒价EID₅₀＝10⁹/0.1ml。

实施例1所述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物，用HI试验检测复 合物的抗体效价为1：1024，并按药典方法做物理性状检查，所得复合物为淡 黄色稍带乳白色的颗粒的透明液体，PH值6.2，且无菌检验、安全性试验、

抗体效力检验等均合格。

实施例2

一种用于防治肾型传染性支气管炎的复合物，由纯化好的灭活抗原和血 凝抑制效价为1：512的高免蛋黄抗体组成，所述纯化好的灭活抗原和血凝抑 制效价大为1：512的高免蛋黄抗体的体积比为2：8。

上述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物的制备方法，具体制备步骤 如下：

(1)取灭活的纯化抗原和血凝抑制效价大于1：512的高免蛋黄抗体按体 积比2：8进行配比；

(2)混合后，在其混合体中加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，充分搅拌 均匀，37℃保温密封12小时，用0.22um微孔滤膜过滤除菌，灭活即得抗体效 价为1:512的鸡肾型传染性支气管炎灭活抗原与高免蛋黄抗体复合物，该复合 物的病毒价EID₅₀＝10⁸/0.1ml。

实施例2所述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物，用HI试验检测复 合物的抗体效价为1：512，并按药典方法做物理性状检查，观察其溶解度， 稳定性。所得复合物为淡黄色稍带乳白色的颗粒的透明液体，PH值6.1且无 菌检验、安全性试验、抗体效力检验等均合格。

实施例3

一种用于防治肾型传染性支气管炎的复合物，由纯化好的灭活抗原和血 凝抑制效价为1：512的高免蛋黄抗体组成，所述纯化好的灭活抗原和血凝抑 制效价为1：512的高免蛋黄抗体的体积比为4：6。

上述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物的制备方法，具体制备步骤 如下：

(1)取灭活的纯化抗原和血凝抑制效价为1：512的高免蛋黄抗体按体积 比4：6进行配比；

(2)混合后，在其混合体中加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，充分搅拌 均匀，37℃保温密封8小时，用0.22um微孔滤膜过滤除菌，灭活即得抗体效 价为1:512的鸡肾型传染性支气管炎灭活抗原与高免蛋黄抗体复合物，该复合 物的病毒价EID₅₀＝10⁷/0.1ml。

实施例3所述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物，用HI试验检测复 合物的抗体效价为1：512，并按药典方法做物理性状检查，所得复合物为淡 黄色稍带乳白色的颗粒的透明液体，PH值6.0，且无菌检验、安全性试验、 抗体效力检验等均合格。

实施例4

一种用于防治肾型传染性支气管炎的复合物，由纯化好的灭活抗原和血 凝抑制效价为1：1024的高免蛋黄抗体组成，所述纯化好的灭活抗原和血凝抑 制效价为1：1024的高免蛋黄抗体的体积比为3：6。

上述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物的制备方法，具体制备步骤 如下：

(1)取灭活的纯化抗原和血凝抑制效价为1：1024的高免蛋黄抗体按体 积比3：6进行配比；

(2)混合后，在其混合体中加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，充分搅拌 均匀，37℃保温密封11小时，用0.22um微孔滤膜过滤除菌，灭活即得抗体效 价为1:512的鸡肾型传染性支气管炎灭活抗原与高免蛋黄抗体复合物，该复合 物的病毒价EID₅₀＝10⁸/0.1ml。

实施例4所述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物，用HI试验检测复 合物的抗体效价为1：512，并按药典标准做物理性状检查，所得复合物为淡 黄色稍带乳白色的颗粒的透明液体，PH值6.1，且无菌检验、安全性试验、 抗体效力检验等均合格。

上述实施例1-4中，所述抗原按照常规方法制备得到，而后在按照常规方 法获得抗体即可。具体来说，可以是：

(1)病毒的繁殖：传染性支气管炎病毒株(肾型强毒株HB-1)接种鸡胚， 繁殖温度为35～37℃，每天照蛋两次，收获24～72h死亡的鸡胚尿囊液；对 于72h的活胚需置2～8℃过夜，然后收获尿囊液，收获尿囊液时，需弃去24h 之前死亡的鸡胚；对收获的病毒尿囊液进行检验，凡菌检为阴性，病毒价EID₅₀≥10⁹/0.1ml,作为制备疫苗的部分抗原液；

(2)病毒液的浓缩、纯化：用醋酸锌沉淀法浓缩病毒液，用Sepharose 4FF 凝胶层析柱纯化病毒液，并进一步进行灭活，检验无菌后作为复配抗原及配 制灭活苗应用；

(3)灭活抗原的处理：经无菌检验并灭活的抗原进行白油乳化处理，处 理好后备用；

(4)使用上述灭活抗原配制油乳剂灭活苗(按1ml/羽肌内注射接种)与 W93弱毒株(按5头份/羽肌内注射接种)同时强化免疫180日龄高产蛋鸡， 每7天免疫一次，连续强化免疫三次，最后一次免疫两周后开始收蛋，并检 测抗体效价，收集抗体效价≥1:512的高免蛋的蛋黄作为制备高免的蛋黄抗体， 备用。

测试例：

实验一：

实施例1所述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物对肾型传支的预防 与治疗实验情况：

250只1日龄AA+商品肉仔鸡，随机分成三组，每组50只，分别为1组、 2组、3组和对照1组、对照2组。其中1组、2组和3组分别在2日龄时， 每只鸡注射抗原抗体复合物0.5ml。1组于注射抗体后2天(48小时)后，在 实验室条件下人工感染肾传支病毒；2组和对照1组分别于注射实施例1所述 复合物后3天，在实验室条件下人工感染肾传支病毒；3组和对照2组分别在 8日龄时攻毒。各组按照常规饲养方法进行隔离饲养，并观察各组的发病及死 亡情况并记录直至攻毒后10天，同时对各组血液进行抗体检测。各组结果如 下表1：

表1

组别 攻毒时间 攻毒后发病数 攻毒后死亡数 攻毒后存活数 预防保护率 1 2天 0 0 50 100％(50/50) 2 3天 2   50 100％(50/50) 3 8天 8 2 48 96％(48/50) 对照1组 3天 5 1 49 98％(49/50) 对照2组 8天 50 38 12  

预防试验结果表明：

1组在注射抗体2天后攻毒，预防保护率为100％(50/50)；

2组在注射抗体3天后攻毒，预防保护率为100％(50/50)。

3组在注射抗体8天后攻毒，预防保护率为96％，而对照2组死亡较高。

对照1组在注射抗体3天后攻毒，预防保护率为98％，而对照2组死亡 较高。

对照2组在于8天后攻毒，发病率为100％，死亡率较高76％(38/50)。

实施例2所述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物对肾型传支的预防 与治疗实验情况：

250只1日龄AA+商品肉仔鸡，随机分成三组，每组50只，分别为1组、 2组、3组和对照1组、对照2组。其中1组、2组和3组分别在2日龄时， 每只鸡注射实施例1所述复合物0.5ml。1组于注射抗体后2天(48小时)后， 在实验室条件下人工感染肾传支病毒；2组和对照1组分别于注射抗原抗体复 合物后3天，在实验室条件下人工感染肾传支病毒；3组和对照2组分别在8 日龄时攻毒。各组按照常规饲养方法进行隔离饲养，并观察各组的发病及死 亡情况并记录直至攻毒后10天，同时对各组血液进行抗体检测。各组结果如 下表2：

表2

组别 攻毒时间 攻毒后发病数 攻毒后死亡数 攻毒后存活数 预防保护率 1 2天 0 0 50 100％(50/50) 2 3天 3   50 100％(50/50) 3 8天 7 2 48 96％(48/50) 对照1组 3天 6 1 49 98％(49/50) 对照2组 8天 50 40 10  

预防试验结果表明：

1组在注射抗体2天后攻毒，预防保护率为100％(50/50)；

2组在注射抗体3天后攻毒，预防保护率为100％(50/50)。

3组在注射抗体8天后攻毒，预防保护率为96％，而对照2组死亡较高。

对照1组在注射抗体3天后攻毒，预防保护率为98％，而对照2组死亡 较高。

对照2组在于8天后攻毒，发病率为100％，死亡率较高80％(40/50)。

实施例3所述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物对肾型传支的预防 与治疗实验情况：

250只1日龄AA+商品肉仔鸡，随机分成三组，每组50只，分别为1组、 2组、3组和对照1组、对照2组。其中1组、2组和3组分别在2日龄时， 每只鸡注射实施例1所述复合物0.5ml。1组于注射抗体后2天(48小时)后， 在实验室条件下人工感染肾传支病毒；2组和对照1组分别于注射抗原抗体复 合物后3天，在实验室条件下人工感染肾传支病毒；3组和对照2组分别在8 日龄时攻毒。各组按照常规饲养方法进行隔离饲养，并观察各组的发病及死 亡情况并记录直至攻毒后10天，同时对各组血液进行抗体检测。各组结果如 下表3：

表3

组别 攻毒时间 攻毒后发病数 攻毒后死亡数 攻毒后存活数 预防保护率 1 2天 0 0 50 100％(50/50) 2 3天 10 1 49 98％(49/50) 3 8天 8 2 48 96％(48/50) 对照1组 3天 7 1 49 98％(49/50) 对照2组 8天   41 9  

预防试验结果表明：

1组在注射抗体2天后攻毒，预防保护率为100％(50/50)；

2组在注射抗体3天后攻毒，预防保护率为98％(49/50)。

3组在注射抗体8天后攻毒，预防保护率为96％，而对照2组死亡较高。

对照1组在注射抗体3天后攻毒，预防保护率为98％，而对照2组死亡 较高。

对照2组在于8天后攻毒，发病率为100％，死亡率较高82％(41/50)。

实验二：

300只1日龄AA+商品肉仔鸡，随机分成6组，每组50只。进行攻毒保 护性试验，各组结果如下表4。其中，

1组灭活抗原与高免蛋黄抗体的比例2：10；

2组灭活抗原与高免蛋黄抗体的比例2：8；

3组灭活抗原与高免蛋黄抗体的比例2：6；

4组灭活抗原与高免蛋黄抗体的比例2：4；

5组阳性对照；

6组阴性对照；

1-4组的制备方法同实施例1。

表4

组别 攻毒后发病数 攻毒后死亡数 攻毒后存活数 预防保护率 1 30 14 36 72％(36/50)

2 10 1 49 98％(49/50) 3 10 2 48 96％(48/50) 4 15 18 32 64％(32/50) 5 50 50 0 0％(0/50) 6 0 0 50 100％(50/50)

可见，本发明所述用于防治肾型传染性支气管炎的复合物的HA效价在 灭活抗原与高免蛋黄抗体的比例在2～4：8～6时效价最大，免疫力效果最好。

上述参照实施例对该一种用于防治肾型传染性支气管炎的复合物及其制 备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列 举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本 发明的保护范围之内。