黄连水提物及其单体在制备抑制猪链球菌或干预猪链球菌生物被膜药物中的用途

摘要

本发明公开了黄连水提物及其单体在制备抑制猪链球菌或干预猪链球菌生物被膜药物中的用途，属于黄连水提物及其单体的新医药用途领域。本发明采用猪链球菌BF体外模型研究黄连水提物及其单体对猪链球菌生物被膜的体外干预作用。通过结晶紫法及扫描电镜观察发现黄连水提物及其单体对猪链球菌生物被膜的形成有显著抑制作用。荧光实时定量PCR结果发现黄连水提物及其单体使生物被膜信号分子的mRNA表达量显著下降，显著降低猪链球菌生物被膜中毒力基因mRNA表达量。实验结果表明，黄连水提物或者黄连单体化合物对于抑制猪链球菌或干预猪链球菌生物被膜有确切的功效，能应用于制备抑制猪链球菌或干预消除猪链球菌生物被膜的形成的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及黄连水提物及其单体的新医药用途，尤其涉及黄连水提物 及其单体化合物在制备抑制猪链球菌或干预猪链球菌生物被膜药物中的 用途，属于黄连水提物及其单体的新医药用途领域。

背景技术

猪链球菌是引起猪包括脑膜炎、败血症、心内膜炎、关节炎、肺炎等 威胁生命疾病的重要病原。根据多糖荚膜成分的不同，猪链球菌分为35 个血清型(1-34，1/2)，其中猪链球菌2型是最常见、毒力最强的血清型菌 株。目前国内外学者认为，猪链球菌在动物体内外可以形成生物被膜 (biofilm，BF)，BF作为细菌的一种重要生存方式，受多种因素的影响 和调节。其中，密度感应(quorum sensing，QS)现象就是近年来发现的 对BF产生重要作用的影响因素之一。QS即细菌通过自身产生的信号分 子进行交流和协调群体行为的过程，与QS现象有关的种间QS信号系统 是由luxS基因编码的AI-2信号分子介导完成的。luxS/AI-2不仅影响猪链 球菌BF的形成，而且影响细菌毒力因子的表达，通过干预猪链球菌的 QS系统，有可能成为未来研发抗微生物药物的策略之一。

黄连，属毛茛科、黄连属多年生草本植物，具有抗菌、抗病毒、抗炎、 抗腹泻、降血糖、降血脂、抗氧化等作用。迄今，尚无关于黄连水提物及 其单体抑制猪链球菌或干预猪链球菌生物被膜的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供黄连水提物及其单体化合物在制 备抑制猪链球菌或干预猪链球菌生物被膜药物中的新用途，黄连水提物及 其单体化合物通过作用于QS系统，有效抑制猪链球菌或干预猪链球菌生 物被膜的形成。

本发明所要解决的上述技术问题是通过以下技术方案实现的：

本发明通过建立猪链球菌BF体外模型，研究黄连水提物及其单体化 合物对猪链球菌生物被膜的体外干预作用。

通过结晶紫法研究黄连水提物、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀及盐酸药根 碱对猪链球菌生物被膜形成的影响，结果表明，猪链球菌经31.25μg·mL^-1盐酸小檗碱作用3d后测得的OD值(0.538±0.027)与阴性对照组 (0.825±0.087)相比，差异有统计学意义(P<0.01)，提示该浓度的盐酸小檗 碱对猪链球菌生物被膜形成有显著抑制作用。猪链球菌经50μg·mL^-1黄连 水提物、62.5μg·mL^-1盐酸巴马汀作用3d后测得的OD值分别为 0.589±0.042、0.597±0.043与阴性对照组相比差异也有统计学意义 (P<0.05)。

通过猪链球菌生物被膜内的活菌计数分析黄连水提物、盐酸小檗碱、 盐酸巴马汀及盐酸药根碱对猪链球菌生物被膜内细菌的影响，结果显示 31.25μg·mL^-1盐酸小檗碱、62.5μg·mL^-1盐酸巴马汀对生物被膜内细菌具有 清除作用，菌落计数分别为6.71±0.11cfu/mL、7.28±0.20cfu/mL，与阴性 对照组菌落数9.16±0.90cfu/mL相比，生物被膜内存活细菌数明显减少， 有统计学意义(P<0.05)。黄连水提物及盐酸药根碱对生物被膜内细菌也具 有清除作用，菌落计数分别为7.87±0.58cfu/mL、8.09±0.23cfu/mL，比较 差异没有统计学意义(P>0.05)。

扫描电镜观察显示，50μg·mL^-1黄连水提物、31.25μg·mL^-1盐酸小檗 碱、62.5μg·mL^-1盐酸巴马汀和125μg·mL^-1盐酸药根碱实验组猪链球菌生 物被膜形态结构发生明显变化，仅有少许散在细菌。说明黄连水提物、盐 酸小檗碱、盐酸巴马汀和盐酸药根碱处理后生物被膜的结构遭到明显的破 坏。

本发明以16s RNA为内参基因，用荧光实时定量PCR对luxS因子 和7个毒力基因的表达进行相对定量。结果表明，与对照组相比，黄连 水提物组、盐酸小檗碱组、盐酸巴马汀组和盐酸药根碱组luxS表达量差 异显著(P<0.05)，mRNA表达量显著下降。cps、gdh毒力基因mRNA 表达量显著上升；与对照组相比，黄连水提物组、盐酸小檗碱组、盐酸巴 马汀组与盐酸药根碱组表达量差异显著(P<0.05)。fbps毒力基因mRNA 表达量显著下降，与对照组相比，黄连水提物组与盐酸巴马汀组fbps表 达量差异显著(P<0.05)。mrp毒力基因mRNA表达量显著上升；与对照 组相比，黄连水提物组、盐酸小檗碱组和盐酸药根碱组mrp表达量差异显 著(P<0.05)。ef毒力基因mRNA表达量显著下降；与对照组相比，盐 酸小檗碱组、盐酸巴马汀组与盐酸药根碱组ef表达量差异显著(P<0.05)。 sly毒力基因mRNA表达量显著下降；与对照组相比，黄连水提物组与盐 酸小檗碱组sly表达量差异显著(P<0.05)。gapdh毒力基因mRNA表达 量显著下降；与对照组相比，黄连水提物组、盐酸小檗碱组、盐酸巴马汀 组与盐酸药根碱组gapdh表达量差异显著(P<0.05)。

综上所述，黄连水提物及其单体有望成为QS信号系统抑制剂，通过 影响QS系统干预或者消除生物被膜的形成。

因此，黄连水提物或者黄连单体可以用于制备抑制猪链球菌的药物。

本发明公开了一种抑制猪链球菌的药物组合物，包括：有效量的黄连 水提物或者黄连单体化合物和药学上可接受的辅料或载体。

本发明还公开了一种干预猪链球菌生物被膜形成的药物组合物，包 括：有效量的黄连水提物或者黄连单体化合物和药学上可接受的辅料或载 体。

本发明进一步公开了一种干预猪链球菌生物被膜中毒力基因或生物 被膜信号分子基因表达的药物组合物，包括：有效量的黄连水提物或者黄 连单体化合物和药学上可接受的辅料或载体。

以上所述的黄连单体化合物为盐酸小檗碱、盐酸巴马汀或盐酸药根碱 中的一种或多种；优选为盐酸小檗碱或盐酸巴马汀中的任意一种。

本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：

本发明中黄连水提物或其单体化合物对猪链球菌生物被膜的形成有 显著抑制作用，使生物被膜信号分子LuxS/AI-2的mRNA表达量显著下降， 显著降低猪链球菌生物被膜中fbps、ef、sly和gapdh毒力基因mRNA表 达量，能够有效干预或消除猪链球菌生物被膜的形成。

附图说明

图1为1/2MIC黄连水提物及单体化合物对猪链球菌生物被膜形成 的影响

图2为1/2MIC黄连水提物及单体化合物对猪链球菌生物被膜内细 菌的影响

图3为扫描电镜下1/2MIC黄连水提物及单体化合物对猪链球菌生 物被膜形态学影响；其中，A为阴性对照；B为黄连水提物；C为盐酸小 檗碱；D为盐酸巴马汀；E为盐酸药根碱；F为阿奇霉素；

图4为黄连水提物及单体化合物对猪链球菌生物被膜luxS基因的影 响

图5为黄连水提物及其单体化合物对猪链球菌生物被膜毒力基因cps 的影响

图6为黄连水提物及其单体化合物对猪链球菌生物被膜毒力基因 gdh的影响

图7为黄连水提物及其单体化合物对猪链球菌生物被膜毒力基因 fbps的影响

图8为黄连水提物及其单体化合物对猪链球菌生物被膜毒力基因 mrp的影响

图9为黄连水提物及其单体化合物对猪链球菌生物被膜毒力基因ef 的影响

图10为黄连水提物及其单体化合物对猪链球菌生物被膜毒力基因 sly的影响

图11为黄连水提物及其单体化合物对猪链球菌生物被膜毒力基因 gapdh的影响

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会 随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明 的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的 精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这 些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、材料

1.1实验菌株

2型猪链球菌分离株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。

1.2药物及材料

1.2.1药物

盐酸小檗碱标准品(上海融禾医药科技发展有限公司，批号130329)；

盐酸巴马汀标准品(上海融禾医药科技发展有限公司，批号130120)；

盐酸药根碱标准品(上海融禾医药科技发展有限公司，批号130506)；

阿奇霉素标准品(石药集团欧意药业有限公司产品，批号100110101)；

黄连为生药，购自北京同仁堂大药房。

1.2.2培养基及试剂

胰蛋白胨、葡萄糖、牛肉粉、酵母粉、无水碳酸钠、氯化钠、戊二醛 (Sigma公司分析纯)；DMSO、无水乙醇和氯化钠为国产分析纯、脑心 浸液肉汤培养基、生理盐水、THB培养基、LB肉汤、PH7.4磷酸盐缓冲 溶液(PBS)为本发明人实验室配制。

实施例1黄连水提物及其单体化合物对猪链球菌生物被膜的体外干预作 用

1、实验方法

1.1黄连水提物的制备

取50g黄连粉末，用500mL蒸馏水在100℃下煎煮1h，过滤，收集 滤液，滤渣第2次和第3次均加300mL水，煮沸1h，合并滤液，浓缩至 0.25g/mL，保存在4℃下备用，用时按需要稀释。

1.2猪链球菌最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)的 确定

采用微量稀释法测定黄连水提物及单体化合物对猪链球菌的MIC。取 单个S.suis菌落接种于THB培养基中，37℃培养12h～16h。利用麦氏比 浊仪将菌液浓度先调整为0.5麦氏(1.0×10⁸cfu·mL^-1)，再用THB培养 基稀释为约1.0×10⁶cfu·mL^-1，备用。依次向无菌96孔细胞培养板加入THB 培养基，除第1孔加入160μL THB培养基外，其余每管加入100μL THB， 在第1孔加入药物40μL混匀，然后吸取100μL至第2孔，混匀后再吸 取100μL至第3孔，如此连续倍比稀释至第11孔，并从第11孔中吸取 100μL弃去，第12孔为不含药物的生长对照。然后在每孔内加入上述制 备好的细菌菌液各100μL。混匀后盖好，于37℃孵育24h。肉眼观察无细 菌生长的药物最低浓度孔为各药物对S.suis的MIC。

1.3猪链球菌BF体外模型的建立

取S.suis单个菌落接种于LB液体培养基中，37℃，180rpm过夜培养。 用比浊仪调至0.5麦氏单位，稀释100倍。吸取菌液200μL加入卡尔加里 生物被膜装置，37℃培养，连续培养3天后，即可形成稳定的BF。用消 毒的镊子小心将其取下，可用扫描电镜检测生物被膜形态结构。

1.4黄连水提物及其单体化合物对猪链球菌生物被膜的体外干预作用

在卡尔加里生物被膜装置中每孔加入100μL含MIC药物的THB培养 基，再加入100μL浓度调至约1.0×10⁶cfu/mL的菌液；阴性对照组加200μL 菌液，空白对照组加200μL THB培养基，每组重复5孔，37℃下培养3d 后，用灭菌生理盐水冲洗3次，自然干燥后用甲醇固定生物被膜30min， 弃去固定液待自然干燥后，室温下用200μL 0.1％的结晶紫对生物被膜染 色30min，弃去染色液，自来水冲洗直至无色、晾干；此时，若孔的两边 看到紫色的环形成即可判断形成了生物被膜，每孔加入200μL浓度为 33％的冰醋酸溶液，置于摇床振摇30min以释放生物被膜中的结晶紫，测 定其在595nm波长处的吸光度。

1.5猪链球菌生物被膜内的活菌计数

各组处理方法同1.4，每组重复5孔，37℃下培养3d。将形成生物被 膜的卡尔加里生物被膜装置密封后放入超声波清洗器中，在35℃、功率 为105W条件下进行超声波处理10min使膜内菌释放，所得的生物被膜菌 液以生理盐水进行梯度稀释后，在营养琼脂平板上37℃培养24h后计数， 每次测定均重复测3次计算平均值，结果以log(cfu/mL)表示，观察药物 对生物被膜内菌量影响。

1.6猪链球菌BF形态的SEM检测

各组处理方法同1.4，每组重复5孔，37℃下培养3d。

(1)打开卡尔加里生物被膜装置，将桩钉经无菌操作取下后，灭菌 PBS溶液多次充分漂洗；

(2)2.5％戊二醛PBS溶液固定过夜后，用灭菌PBS溶液冲洗数遍；

(3)50％、70％、90％系列浓度乙醇脱水各10min，100％乙醇脱水2 次，每次15min；

(4)50％、100％叔丁醇置换2次，每次15min；

(5)临界点干燥仪干燥，喷金；

(6)扫描电镜观察。

2、实验结果

2.1黄连水提物及其单体化合物对猪链球菌的MIC

通过微量稀释法分别测定了黄连水提物、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、 盐酸药根碱和阿奇霉素对猪链球菌的MIC。结果见表1。

表1黄连水提物及单体化合物对猪链球菌的MIC

2.2黄连水提物及其单体化合物对猪链球菌生物被膜的干预作用

黄连水提物、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀及盐酸药根碱对猪链球菌生物 被膜形成的影响，结果见图1。由图1可知，猪链球菌经31.25μg·mL^-1盐 酸小檗碱作用3d后测得的OD值(0.538±0.027)与阴性对照组(0.825±0.087) 相比，差异有统计学意义(P<0.01)，提示该浓度的盐酸小檗碱对猪链球菌 生物被膜形成有显著抑制作用。猪链球菌经50μg·mL^-1黄连水提物、 62.5μg·mL^-1盐酸巴马汀作用3d后测得的OD值分别为0.589±0.042、 0.597±0.043与阴性对照组相比差异也有统计学意义(P<0.05)，125μg·mL^-1盐酸药根碱作用3d后测得的OD值为0.671±0.044，与阴性对照组相比差 异没有统计学意义(P>0.05)。

2.3黄连水提物及其单体化合物对猪链球菌生物被膜内菌数的影响

黄连水提物、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀及盐酸药根碱对猪链球菌生物 被膜内细菌的影响，生物被膜内细菌的存活数如图2所示，实验结果显示 31.25μg·mL^-1盐酸小檗碱、62.5μg·mL^-1盐酸巴马汀对生物被膜内细菌具有 清除作用，菌落计数分别为6.71±0.11cfu/mL、7.28±0.20cfu/mL，与阴性 对照组菌落数9.16±0.90cfu/mL相比，生物被膜内存活细菌数明显减少， 有统计学意义(P<0.05)。黄连水提物及盐酸药根碱对生物被膜内细菌也具 有清除作用，菌落计数分别为7.87±0.58cfu/mL、8.09±0.23cfu/mL，比较 差异没有统计学意义(P>0.05)。

2.4黄连水提物及其单体化合物对猪链球菌生物被膜形态结构的影响

扫描电镜观察显示，阴性对照组猪链球菌体外培养3d后形成成熟生 物被膜，生物被膜细菌密集，相互黏连，形成一簇一簇类似“葡萄串”形状 的生物膜(图3A)。50μg·mL^-1黄连水提物、31.25μg·mL^-1盐酸小檗碱、 62.5μg·mL^-1盐酸巴马汀和125μg·mL^-1盐酸药根碱实验组猪链球菌生物被 膜形态结构发生明显变化，仅有少许散在细菌(图3B-E)。说明黄连水提物、 盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和盐酸药根碱处理后生物被膜的结构遭到明显的 破坏。

实施例2黄连水提物及其单体化合物对猪链球菌生物被膜信号分子和毒 力基因的影响

1、实验方法

1.1细菌RNA的提取

在卡尔加里生物被膜装置中每孔加入100μL含MIC药物(黄连水提 物及其单体化合物、阿奇霉素)的THB培养基，再加入100μL浓度调至 约1.0×10⁶cfu/mL的菌液，每组重复5孔，37℃下培养3d。以未加药的生 物被膜生长作为阳性对照。

(1)细菌的裂解：将细菌移入1.5mL离心管中，高速离心10min后， 彻底弃上清，加入1mL Trizol，并用移液器抽打以彻底混匀。

(2)加入0.2mL的氯仿，盖上帽，剧烈振荡混匀5min。混匀后，室 温静置10min。

(3)4℃，12,000r/min离心约10min，小心将上层液相移至另一个 EP管内(离心后溶液分3层)，小心吸取上清液。

(4)加入0.5mL的异丙醇，颠倒混匀。室温静置10min。

(5)4℃，12,000r/min离心10min，倒掉上清液，再加入75％乙醇 (去RNA酶，用DEPC水配制)500μL，轻轻振荡，使沉淀浮起。

(6)4℃，12,000r/min，离心5min。

(7)弃上清，自然干燥后加入50μL DEPC水于EP管中，-70℃保 存。

1.2cDNA的制备

逆转录反应体系：总RNA，加26μL ddH₂O，random primer 2μL，dNTP (10mmol)2μL，70℃水浴5min；加5×Buffer 8μL，Rnase inhibitor 1μL， M-MLV 1μL，42℃水浴1.5小时，70℃水浴15min，快速冷却。

1.3逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

以16s RNA为内参基因，用荧光实时定量PCR对luxS因子和7个 毒力基因的表达进行相对定量。荧光定量PCR的反应体系参照SYBR Premix Ex Taq(TAKARA)进行，20μL反应体系中加入：

PCR反应条件为：95℃，10min预变性；40×(95℃，15s；60℃， 1min；72℃，20s)，72℃，10min。

参考SS2已发表的毒力基因序列，运用Premier5.0和Primer Express 设计10对引物用于反转录和进行Real-time PCR。各基因的引物序列如下 表(表2)。

表2各基因引物序列

定量数据用Gene Scanning Software，用16sRNA作 为内参基因进行表达量差异分析(2-△△Ct数据分析法)。2-△△Ct＝2-[(待 测基因Ct-内参基因Ct)处理组－(待测基因Ct-内参基因Ct)未处理组]。

1.4数据处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学处理，数据以表示，采用 单因素方差分析和多重比较对各组进行比较分析，以P<0.05为差异性显 著，P<0.01为差异性极显著。

2、实验结果

2.1黄连水提物及其单体化合物对生物被膜QS系统中AI-2luxS因子的影 响

通过荧光定量PCR方法检测猪链球菌生物被膜信号分子luxS/AI-2的 mRNA表达量，结果见图4，与对照组相比，黄连水提物组、盐酸小檗碱 组、盐酸巴马汀组和盐酸药根碱组luxS表达量差异显著(P<0.05)，mRNA 表达量显著下降。

2.2黄连水提物及其单体化合物对生物被膜QS系统中毒力基因的影响

2.2.1对毒力基因cps的影响

通过荧光定量PCR方法检测猪链球菌生物被膜中cps毒力基因 mRNA表达量，结果见图5，cps毒力基因mRNA表达量显著上升。与对 照组相比，黄连水提物组、盐酸小檗碱组、盐酸巴马汀和盐酸药根碱组 cps表达量差异显著(P<0.05)。

2.2.2对毒力基因gdh的影响

通过荧光定量PCR方法检测猪链球菌生物被膜中gdh毒力基因 mRNA表达量，结果见图6，gdh毒力基因mRNA表达量显著上升。与对 照组相比，黄连水提物组、盐酸小檗碱组、盐酸巴马汀组与盐酸药根碱组 gdh表达量差异显著(P<0.05)。

2.2.3对毒力基因fbps的影响

通过荧光定量PCR方法检测猪链球菌生物被膜中fbps毒力基因 mRNA表达量，结果见图7，fbps毒力基因mRNA表达量显著下降。与对 照组相比，黄连水提物组与盐酸巴马汀组fbps表达量差异显著(P<0.05)， 盐酸小檗碱组和盐酸药根碱组fbps表达量差异不显著(P＞0.05)。

2.2.4对毒力基因mrp的影响

通过荧光定量PCR方法检测猪链球菌生物被膜中mrp毒力基因 mRNA表达量，结果见图8，mrp毒力基因mRNA表达量显著上升。与对 照组相比，黄连水提物组、盐酸小檗碱组和盐酸药根碱组mrp表达量差异 显著(P<0.05)，盐酸巴马汀组mrp表达量差异不显著(P＞0.05)。

2.2.5对毒力基因ef的影响

通过荧光定量PCR方法检测猪链球菌生物被膜中ef毒力基因mRNA 表达量，结果见图9，ef毒力基因mRNA表达量显著下降。与对照组相比， 盐酸小檗碱组、盐酸巴马汀组与盐酸药根碱组ef表达量差异显著 (P<0.05)，黄连水提物组ef表达量差异不显著(P＞0.05)。

2.2.6对毒力基因sly的影响

通过荧光定量PCR方法检测猪链球菌生物被膜中sly毒力基因mRNA 表达量，结果见图10，sly毒力基因mRNA表达量显著下降。与对照组相 比，黄连水提物组与盐酸小檗碱组sly表达量差异显著(P<0.05)，盐酸 巴马汀组和盐酸药根碱组sly表达量差异不显著(P＞0.05)。

2.2.7对毒力基因gapdh的影响

通过荧光定量PCR方法检测猪链球菌生物被膜中gapdh毒力基因 mRNA表达量，结果见图11，gapdh毒力基因mRNA表达量显著下降。 与对照组相比，黄连水提物组、盐酸小檗碱组、盐酸巴马汀组与盐酸药根 碱组gapdh表达量差异显著(P<0.05)。

综上所述，黄连水提物或其单体化合物有望成为QS信号系统抑制剂， 通过影响QS系统干预或者消除生物被膜的形成。