胰岛素样生长因子结合蛋白5在促进牙周组织再生中的应用

摘要

本发明公开了IGFBP5在促进间充质干细胞介导的牙周组织再生中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及胰岛素样生长因子结合蛋白5在促进牙周组织再生中的应用。 

背景技术

牙周炎是一种多因素相关慢性炎症性疾病，临床表现为牙周支持组织的丧失，包括牙周韧带、牙骨质、牙槽骨的丧失，随着对牙周病发病机制的深入了解，发现宿主免疫反应、环境因素和细菌微生物因素间相互作用在牙周炎的发生、发展及牙周组织的愈合中至关重要。由牙周炎造成的牙槽骨丧失、牙周组织破坏是成年人牙齿脱落的首要原因，严重影响患者的咀嚼功能、美观及身心健康。传统牙周治疗方法主要包括机械的清除方法包括龈上洁治、龈下刮治术清除牙菌斑及牙石是牙周炎的基础治疗方法，但传统牙周治疗方法尚不能使丧失的牙周组织获得理想的再生。因此牙周组织缺损修复是口腔领域的重点研究内容之一。近年来，牙周骨移植术、引导组织再生、引导骨再生及生长因子局部缓释技术的临床应用在一定程度上提高牙槽骨及牙周再生能力，但这些骨引导和骨诱导方式也需依赖于剩余间充质干细胞的数量及功能。对于慢性牙周炎患者，长期的慢性炎症使宿主自身间充质干细胞数量减少，功能受损，很难满足骨再生手术的要求。随着干细胞、组织工程技术的发展及应用为牙周炎的治疗、牙周组织的生物性再生提供了更为有效的手段。组织工程技术是利用可降解生物材料、各种类型的种子细胞及细胞因子相互复合，移植后可在宿主体内的重建具有正常结构及功能的组织器官。 

目前在牙周组织再生种子细胞的研究中，发现间充质干细胞具有自我更新、多向分化等能力，可以分化为组织修复所需的各种组织如骨组织，软骨组织，牙本质，牙周组织等，与生物材料复合应用具有良好的修复自身缺损和改建周围组织的功能。近年来越来越多的研究报道表明，间充质干细胞除免疫原性低、具备再生和修复功能外，还有较强的免疫抑制及调节作用，并已安全和 成功地用于临床，或结合组织工程技术进行组织再生，或直接应用间充质干细胞对自身免疫疾病进行细胞治疗^[新9-20]。近年来越来越多的研究报道表明，间充质干细胞除免疫原性低、具备再生和修复功能外，还有较强的免疫调节、抗炎等作用，并已安全和成功地用于临床，是牙周组织再生的良好的种子细胞。已有研究表明，成年牙的牙髓中，脱落乳牙及正常牙周组织中存在干细胞，这些干细胞首先具有向牙齿各种组织分化的能力，如牙髓牙本质复合体、牙骨质细胞和成纤维细胞等。在特殊的诱导条件下还可以向脂肪、神经等细胞分化^[新6-8]。与牙齿有关的干细胞主要存在于牙髓和牙周膜等结缔组织中，这些组织都有修复自身缺损和改建周围组织的功能。其中牙周膜干细胞于2004年分离鉴定，可在体外分化成成牙骨质细胞样细胞和胶原形成细胞，并能被矿化和成脂诱导，将其与特定生物材料植入体内6-8周可形成牙周膜牙骨质复合样结构，这对牙周组织再生具有重要的意义。Kato T通过对骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙周膜间充质干细胞的比较，发现牙周膜间充质干细胞具有最高水平的骨分化的标记物，表明牙周膜干细胞是最理想的牙槽骨再生的细胞。同时，牙周膜干细胞也具有合成胶原的能力，并且其胶原形成能力比脂肪间充质干细胞较强。在此基础上，Liu等在小型猪建立了牙周炎的动物模型，进行了基于自体牙周干细胞为基础的牙周组织再生研究，发现将小型猪的自体牙周膜干细胞与生物材料HA/TCP混合后，回植到牙周缺损部位，可以良好地形成骨组织、牙骨质以及牙周韧带，成功地再生了牙周炎导致的牙周组织缺损。随后Ding等又利用异体牙周膜干细胞与生物材料HA/TCP混合后回植到牙周炎导致的牙周缺损部位，发现异体移植的牙周膜干细胞具有良好的免疫调节作用，异体牙周膜干细胞复合生物支架材料也能够成功修复再生牙周炎导致的牙周组织缺损。Wei等用维生素C刺激牙周膜干细胞使细胞基质增高，从而形成细胞膜片，能够明显改善牙周组织再生。国外学者也利用多层的牙周干细胞膜片技术成功再生了牙周组织^[新22]。有研究发现还发现牙周膜干细胞在牙周组织再生中与骨形成蛋白的有相互促进作用从而促进组织再生。据此，Chen等将甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐/明胶混合凝胶作为支架材料复合，然后将材料与牙周膜干细胞混合后进行牙周组织再生研究，发现复合骨形成蛋白的牙周膜干细胞组有更明显的新骨形成和牙周韧带再生能力。 

除了牙周膜干细胞外，其他牙源性及非牙源性间充质干细胞也可以作为牙周组织再生的种子细胞。牙囊细胞可以从阻生智齿分离、培养获得。研究表明牙囊细胞混合生物陶瓷材料能够再生出牙周膜牙骨质复合体，可以作为牙周组织再生的良好的种子细胞。也有学者将骨髓间充质细胞与纤维蛋白凝胶混合后回植到创伤性牙槽骨缺损的部位，发现骨髓间充质细胞具有良好的牙周骨组织修复功能。另外Xie等将牙周膜干细胞与骨髓间充质细胞混合，以陶瓷和牛骨粉末混合形成膜片诱导成骨。该种细胞混合物可以使碱性磷酸酶增强，同时胶原酶、骨钙素、血管内皮生长因子表达增高。体内实验表明这种混合细胞膜片可以形成牙骨质/含有新生血管的牙周膜样组织，表明牙周膜干细胞与骨髓间充质细胞可以模仿牙周膜的微环境，增强牙骨质/牙周膜复合体生理结构的重建修复功能。 

除间充质干细胞在牙周组织再生中起着重要的功能外，细胞因子例如生长因子等也在组织工程化的牙周组织再生过程中发挥着重要的作用。生长因子可以复合到支架材料内以提高细胞的增殖或分化等某些反应能力。这些生长因子可以作为信号分子对组织的形成进行精细调节。有研究表明，生长因子能够刺激牙周缺损区细胞再聚集，这既能促进组织细胞生长发育的正向调节，又有抑制组织细胞生长的负向调节，共同参与组织细胞的增殖、分化和基质代谢，从而明显促进牙周组织的再生和修复^[4]。目前研究表明与牙周组织再生相关的单一生长因子有：碱性成纤维细胞生长因子，转化生长因子β，釉基质蛋白衍生物等以及复合生长因子：富血小板血浆。 

碱性成纤维细胞生长因子是一种肝素联合多肽类生长因子，有促进血管生成、创伤愈合、骨骼修复、胚胎的发育与分化有着重要的生物学作用。碱性成纤维细胞生长因子能够促进细胞在生物材料和细胞外基质的粘附，提高牙周膜成纤维细胞活力，从而有效修复牙周组织缺损。另外有研究表明，碱性成纤维细胞生长因子能够促进人牙周膜细胞增殖，刺激牙周膜细胞形成矿化结节，并且能通过促进牙周膜血管的生成，为新生的牙周组织创造良好的条件。有学者将碱性成纤维细胞生长因子与多聚三磷酸钙膜混合，回植到缺损部位，发现有大量的新生骨组织形成，并且引起的炎性浸润反应非常微弱。 

转化生长因子β是一类多肽生长因子。以往的研究表明，转化生长因子在 牙齿早期发育以及牙周软硬组织的再生有着重要的调节作用^[8]。转化生长因子β对细胞增殖活性的影响依赖于细胞的类型、组织的来源、以及与其他生长因子的互相影响。Fujii使用外源性的转化生长因子β刺激人牙周膜干细胞以及人牙周膜祖细胞系，发现人牙周膜祖细胞系中a平滑肌肌动蛋白、I型胶原蛋白，以及原纤维蛋白1在mRNA水平表达增高，但增殖减弱；而牙周膜干细胞则表现出了相反的情况：细胞大量增殖，而a平滑肌肌动蛋白、I型胶原蛋白、原纤维蛋白1表达降低；说明了转化生长因子β能够诱导牙周膜干细胞系的成纤维化并能保持牙周膜干细胞的干细胞活性。也有研究表明，转化生长因子β的作用有双向性：低剂量刺激成骨细胞增殖，高剂量抑制骨组织形成 

釉基质蛋白及其衍生物衍生物是釉质发育过程中未矿化釉质中含有的蛋白成分，可以刺激牙囊细胞产生成牙骨质细胞。研究发现釉基质蛋白能够促进牙周膜细胞的增殖以及蛋白合成，提高牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性。另有研究发现釉基质蛋白衍生物能够刺激根面牙周组织的再生，并且促进了无细胞牙骨质以及新牙槽骨的形成^[13]。同时还发现釉基质蛋白有可能作为一种关键的上游细胞因子启动牙周组织细胞分泌各种下游因子，从而调控牙周组织按牙周组织胚胎发育的进程推进，例如国内有学者发现釉基质蛋白成浓度和时间依赖性的诱导牙周膜细胞产生转化生长因子β。因此认为利用釉基质蛋白衍生物进行牙周组织的再生重建，将完全重复了牙齿发育每个阶段，可以在牙根表面形成基质以促进牙骨质、牙周膜以及牙槽骨的生长，是最接近牙周组织生物学发育过程的一种修复再生方式。 

尽管采用单一生长因子的组织工程方法进行牙周组织再生取得了一些成果，但在多年的不断探索中，科研人员发现在功能、结构上还是难以实现完善的牙周组织再生，主要原因是牙周组织局部环境中缺乏足量的、相互协调的细胞因子。因此将一种或几种外源性多肽生长因子用于牙周组织再生的研究，尽管取得了一定疗效，但效果并不十分理想。因此有学者提出了使用复合生长因子，例如富血小板血浆。富血小板血浆中的血小板可以释放丰富的生长因子，因此可能会对牙周组织再生有重要的影响作用。以往研究表明牙周外科手术后，首先是血凝块充满伤口区，并启动各种软硬组织的修复和再生。正常的血凝块有大约5％的血小板，然而正是这些少量的血小板通过血凝块的回缩、生长因 子的释放，从而在伤口愈合中起了主要的作用。同时国内学者研究报道，在体外富血小板血浆可以成剂量依赖性刺激牙周成纤维细胞、牙周膜细胞的细胞增殖。目前已经有学者将富血小板血浆应用于牙周骨缺损修复的治疗，发现将羟基磷灰石与富血小板血浆混合回植到牙周骨缺损的部位，并使用患者自身骨膜细胞膜片覆盖混合体，通过临床及影像学检查，可以看到骨缺损部位有良好的骨组织再生。另外富血小板血浆还可以做为内源性材料，构成有利于牙周骨组织修复再生的微环境。 

虽然上述研究表明这些生长因子可以调节牙周组织缺损的局部细胞应答，促进牙周组织的缺损修复，但由于生长因子具有双向性，其效应与生长因子的来源、浓度、剂量和及有无其他生长因子参与等多种因素有关。因此寻找到上游调控以及下游应答的生长因子，以期发挥生长因子最佳作用，从而获得形态、功能均满意的骨组织和理想的牙周附着是未来牙周组织再生的研究方向。 

尽管干细胞结合组织工程修复再生牙周组织取得了一些研究成果，但还需要进行深入研究，为临床上治疗牙周炎，进行牙周软硬组织的组织再生和功能重建寻找更多、更理想的种子细胞和细胞因子；同时研究如何将间充质干细胞、生长因子与生物材料有机地结合在一起复合应用，形成改性的生物活性材料，使其具有更好的调控机体免疫、再生、防御功能的能力，从而更好地修复再生牙周炎导致的牙周组织缺损。 

胰岛素样生长因子结合蛋白作为胰岛素样生长因子轴的重要组成，共有6条单链多肽，在组织和细胞中广泛表达，参与机体诸多病生理过程。IGFBP5(胰岛素样生长因子结合蛋白5)在骨组织中大量存在，有研究表明注射rhIGFBP5刺激成骨细胞活性可显著提高卵巢切除小鼠骨组织重建，同时发现血清中骨钙素和碱性磷酸酶水平升高。IGFBP5可通过MAPK途径促进单核细胞、自然杀伤细胞和CD4+T细胞的迁移，参与炎症反应的调节。且相对于成牙骨质细胞，IGFBP5在牙槽骨成骨细胞中高表达。但IGFBP5对间充质干细胞的成骨/成牙分化及介导的牙周组织再生作用及机制不清楚。因此本发明欲通过研究IGFBP5是否具有促进间充质干细胞成骨/成牙分化及再生牙周组织的作用和机制，进而利用IGFBP5增强间充质干细胞再生牙周组织的能力，并应用于治疗牙周炎。 

发明内容

针对现有技术不足，本发明所要解决的问题是提出一种治疗牙周炎的新方法，为了实现本发明的目的，拟进行如下技术方案： 

本发明涉及IGFBP5在促进间充质干细胞介导的牙周组织再生中的应用。 

在本发明的另一方面，涉及IGFBP5在制备促进间充质干细胞介导的牙周组织再生的药物中的应用。 

在本发明的另一方面，涉及IGFBP5过表达的间充质干细胞在制备治疗牙周组织再生的药物中的应用。 

附图说明

图1与健康者相比，IGFBP5在牙周炎患者龈沟液中的表达降低。ELISA结果显示与健康者比较，IGFBP5在牙周炎患者龈沟液中表达降低。 

图2建立IGFBP5基因敲除的稳定转染细胞。用IGFBP5 shRNA转染牙周膜干细胞，对照使用Scramble shRNA，转染48小时后，用嘌呤霉素筛选得到IGFBP5和对照Scramble基因敲除的稳定转染细胞，在mRNA(A)和蛋白水平(B)检测shRNA的敲除效果。结果显示在牙周膜干细胞IGFBP5 shRNA可以将IGFBP5基因有效的敲除。 

图3建立IGFBP5过表达的稳定转染细胞。Flag-IGFBP5和对照质粒的病毒转染脐带干细胞，转染48小时后，用G418筛选得到稳定转染细胞，在mRNA(A)和蛋白水平(B)检测外源性IGFBP5的表达。结果表明IGFBP5可以在脐带干细胞有效的过表达。 

图4IGFBP5过表达促进脐带干细胞体外成骨/成牙分化。用成骨诱导培养液将脐带干细胞在体外向成骨/成牙本质分化诱导。发现与对照组相比，过表达IGFBP5的脐带干细胞成骨/成牙分化早期指标-碱性磷酸酶活性明显升高(A)。铅素红染色(B)及钙离子定量分析结果(C)显示过表达IGFBP5脐带干细 胞体外矿化能力增强。定量聚合酶联反应结果显示过表达IGFBP5促进脐带干细胞成骨/成牙本质分化指标-骨粘连蛋白ON(D)、I型胶原蛋白COL1A2(E)、骨桥蛋白OPN(F)、牙本质涎蛋白DSP(G)、牙本质基质酸性磷酸化蛋白1DMP1(H)、成骨相关核心转录因子OSX(I)的表达。 

图5基因敲除IGFBP5抑制牙周膜干细胞体外成骨/成牙分化。用成骨诱导培养液将牙周膜干细胞在体外向成骨/成牙本质分化诱导。发现与对照组相比，基因敲除IGFBP5抑制牙周膜干细胞碱性磷酸酶活性(A)。铅素红染色(B)及测定钙离子定量分析结果(C)显示基因敲除IGFBP5抑制牙周膜干细胞体外矿化能力。定量聚合酶联反应结果显示基因敲除IGFBP5抑制牙周膜干细胞成骨/成牙本质分化指标-骨粘连蛋白ON(D)、I型胶原蛋白COL1A2(E)、骨桥蛋白OPN(F)、牙本质涎蛋白DSP(G)、牙本质基质酸性磷酸化蛋白1DMP1(H)、成骨相关核心转录因子OSX(I)的表达。 

图6IGFBP5在干细胞抑制炎症因子的表达。(A)定量聚合酶链反应检测结果显示与正常牙周膜干细胞相比，IGFBP5在炎症牙周膜干细胞中表达降低。定量聚合酶链反应结果显示基因敲除IGFBP5促进牙周膜干细胞炎性因子白介素6(IL 6)(B)和白介素8(IL 8)(C)的表达。定量聚合酶链反应结果显示过表达IGFBP5能够重新抑制基因敲除IGFBP5后牙周膜干细胞白介素6(D)和白介素8(E)的表达。 

图7小型猪牙周炎骨缺损模型的建立模型及干细胞治疗后的CT影像学结果。采用制造骨缺损、结扎丝线的方法建立小型猪实验性牙周炎模型，在下颌第一恒磨牙近中邻面形成3mm×5mm×7mm缺损。手术后4周可成功形成牙周炎骨缺损模型(图7ABC)；干细胞治疗后3个月(12w)的CT影像学检查(图7CDE)；图7AD为对照组；图7BE为Vector组；图7CF为Flag-IGFBP5组；图7G为Geomagic Studio 12三维计算新生骨量的统计结果。观察IGFBP5对干细胞介导的小型猪牙周炎缺损组织再生修复能力的影响，CT结果表明IGFBP5促进脐带间充质干细胞介导的小型猪牙周组织再生。 

图8小型猪牙周炎骨缺损模型，脐带干细胞回植后的临床检查结果。脐带干细胞回植前4周和0周，探诊深度、龈退缩、附着丧失在两组之间没有差异；在回植后12周，龈退缩指标无明显差异，探诊深度、附着丧失两个检测指标在Flag-IGFBP5干细胞回植组明显改善。结果表明IGFBP5基因修饰的脐带干细胞能够促进牙周组织再生。 

图9小型猪牙周炎模型，干细胞再生后的组织病理结果。脐带干细胞回植后12周的HE染色组织病理结果图；图9A为对照组；图9B为Vector组；图9C为Flag-IGFBP5组；观察IGFBP5对干细胞介导的小型猪牙周炎缺损组织再生修复能力的影响，组织病理结果表明IGFBP5促进脐带间充质干细胞介导的小型猪牙周组织再生，并具有抑制局部炎症的作用。深色箭头代表釉牙骨质界，浅色箭头代表新生牙槽骨高度；标尺为1mm。 

图10酶联免疫吸附试验检测局部炎性因子。干细胞回植后12周，收集小型猪下颌第一恒磨牙龈沟液，酶联免疫吸附试验法检测炎性因子白介素8(IL8)，肿瘤坏死因子a(TNFa)，白介素1b(IL1b)，干扰素r(IFNr)的表达，发现炎性因子干扰素r(A)、肿瘤坏死因子a(B)、白介素1b(C)、白介素8(D)在IGFBP5基因修饰脐带干细胞组龈沟液中表达降低。结果表明IGFBP5能够有效控制牙周炎症反应。 

图11小型猪血常规检测指标。结果表明IGFBP5对全身血常规指标白细胞(图11A)、血红蛋白(图11B)、血小板(图11C)和红细胞(图11D)无影响。 

具体实施方案

下面结合实例对本发明做进一步详细说明，但是此说明不会构成对本发明的限制。 

实施例1 

(1)IGFBP5在牙周炎患者龈沟液中表达降低 

临床收集正常及牙周炎患者龈沟液，酶联免疫吸附试验法检测IGFBP5的表达，发现IGFBP5在牙周炎患者龈沟液中表达降低。 

慢性牙周炎组纳入标准为①诊断为慢性牙周炎的患者探诊深度≥4mm，附着丧失≥1mm；②体重指数18.5≤体重指数≤24的正常范围。排除标准：①患有相关系统疾病，包括高血压、糖尿病、心血管疾病及其他免疫疾病；②吸烟者；③六个月内有牙周系统治疗史，包括龈上洁治术、根面平整术、牙周手术等；④妊娠期妇女、已绝经妇女及服用避孕药者；⑤三个月内曾使用抗生素者；⑥错颌畸形或正畸后1年以内。 

正常对照组纳入标准：①牙龈色形质正常，菌斑指数＝0，牙龈指数＝0，出血指数＝0～1，探诊深度≤3mm，附着丧失＝0mm；②体重指数在18.5≤体重指数≤24的正常范围。排除标准：①患有相关系统疾病，包括高血压、糖尿病、心血管疾病及其他免疫疾病；②吸烟者；③六个月内未行牙周系统治疗，包括龈上洁治术、根面平整术、牙周手术等；④妊娠期妇女、已绝经妇女及服用避孕药者；⑤三个月内曾使用抗生素者；⑥错颌畸形或正畸后1年以内。 

龈沟液采集：从左右上颌第一磨牙的颊侧龈沟的近颊，颊侧，远颊，舌侧龈沟四个位点采取龈沟液。去除龈沟液收集部位的龈上菌斑，棉球格式并吹干待测牙面，1min后将滤纸条(2mm×8mm)插入龈沟，遇阻力时停止，停留30s取出。取出后，8张滤纸条合并用电子天平称重，减去原重量，即为龈沟液重量，按比重(约1mg/ul)换算成体积。样本保存于-80℃冰箱，待测。实验结果表明IGFBP5在牙周炎患者龈沟液中表达降低(图1)。 

酶联免疫吸附试验法检测龈沟液中IGFBP5的含量 

a.试剂平衡至室温(18℃-25℃)。 

b.加样：分别设标准品孔、待测品孔、空白孔。除空白孔外，余孔分别加标准液或代测样品100μL，轻轻混匀。酶标板加上盖，室温下放置1h。 

c.弃去溶液，使用洗涤缓冲液(300μL)洗板5次。 

d.每孔加入100μL抗体，室温摇床下1h。 

e.弃去溶液，重复步骤c。 

f.每孔加入100μL链霉亲和素溶液，室温摇床下1min。 

g.弃去溶液，重复步骤c。 

h.每孔加入100μL底物液，室温下放置30min。 

i.每孔加入100μL终止溶液，终止反应(此时蓝色立转黄色)。 

J.用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的吸光度值，在加终止液后立即进行检测。 

以标准品的浓度为纵坐标、吸光度值为横坐标，根据标准品吸光度值制作标准曲线。计算出相应的待测样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度，进行统计学分析。 

(2)干细胞的分离、培养与鉴定 

人体组织的利用得到首都医科大学伦理委员会的批准，志愿者均知情同意术前签订知情同意书。获取了人恒牙牙周组织和恒牙炎性牙周组织，按照以往文献报道的方法分离和培养牙周膜干细胞，简述如下：将拔除的牙齿立即放入无菌装有预冷磷酸盐缓冲液的离心管，移送进细胞室，在24h内分离培养牙周膜干细胞。轻轻剥离牙齿周围的牙周组织，取中段的牙周组织，用磷酸盐缓冲液反复清洗，剪碎，置于含I型胶原酶(3g/L)和分离酶(4g/L)的消化液，37℃下消化1小时，过70μm细胞筛收集细胞，1000rpm离心10min，用培养液重新悬浮成单细胞悬液。将细胞接种于25cm2细胞培养瓶中，在α-MEM培养基(含15％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中37℃、5％CO2培养，每2～3天换液1次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况。当细胞生长至80％汇合状态时，用0.25％胰蛋白酶按1∶2消化传代。通过检测间充质干细胞的表面标志物CD44、CD90、CD146、STRO-1和干细胞的多向分化能力、克隆形成能力等方法鉴定间充质干细胞。购买脐带间充质干细胞。 

(3)构建病毒质粒 

通过NCBI数据库查询IGFBP5的基因序列，应用Whitehead提供的程序设计IGFBP5的SiRNA，将其插入慢病毒的shRNA载体上，测序鉴定，最终构建成IGFBP5shRNA的质粒。设计IGFBP5基因全长的聚合酶链反应引物，用聚合酶链反应的方法得到IGFBP5的全长并加表面标记Flag Tag，将其连接到逆转录病毒的表达载体上，测序鉴定，最终构建成Flag-IGFBP5的质粒。然 后进行病毒包装、收集，病毒滴度鉴定，分装后保存在-80度冰箱。 

(4)稳定转染细胞系的建立 

对照Scramble的shRNA，IGFBP5的shRNA转染牙周膜干细胞，转染48小时后，用嘌呤霉素筛选7天后得到对照Scramble和IGFBP5基因敲除的稳定转染牙周膜干细胞，提取细胞的mRNA和蛋白，在mRNA水平(图2A)和蛋白水平(图2B)检测shRNA的敲除效果。对照质粒及Flag-IGFBP5的病毒转染脐带干细胞，转染48小时后，用G418筛选10天得到IGFBP5过表达的稳定转染脐带干细胞，在mRNA(图3A)和蛋白水平(图3B)检测Flag的表达鉴定外源性IGFBP5的表达。结果表明IGFBP5基因敲除及过表达稳定转染细胞的建立。 

实时反转录聚合酶链反应： 

1.引物设计，Primer 3及oligo 6等生物软件。 

2.反转录聚合酶链式反应引物序列： 

IGFBP5-F：GCACCTGAGATGAGACAGGA 

IGFBP5-R：TGTAGAATCCTTTGCGGTCA 

3.RNA提取 

1)培养皿细胞弃上清，PBS冲洗2遍，加700ul Trizol，吹打混匀，收于ep管，室温孵育5min，加140ul氯仿，强力震荡混匀15s，室温孵育3min，4℃ 12000g离心15min，收上清于新EP管； 

2)取700ul样本至微型柱子，4℃ 8000g离心15s，弃下层液体； 

3)加700ul RWT缓冲液至微型柱子，4℃ 8000g离心15s，弃下层液体； 

4)加500ul RPE缓冲液至微型柱子，4℃ 8000g离心15s，弃下层液体； 

5)重复步骤4 

6)转移微型柱子至一新2ml收集管，4℃ 1000g离心1min，弃下层液体； 

7)转移微型柱子至一新2ml收集管，加30-50ul无RNA酶水，4℃ 8000g离心15s，收集下层液体于新EP管，测RNA浓度，-80℃保存； 

4.反转录聚合酶链反应 

1)微型管中配制下列模板RNA/引物混合液； 

2)65℃保温5分钟后迅速在冰上冷冻1分钟以上； 

3)离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于微型管底部； 

4)在上述微型管中配制加入下列反转录反应液； 

5)混匀各组分，37℃保温2分钟后冰上冷却； 

6)加入1ul逆转录酶，轻轻吹打混匀； 

7)37℃保温2分钟，70℃保温15分钟，4℃保温，样本收于-20℃。 

5.实时聚合酶链反应 

配置实时聚合酶链反应反应体系如下： 

实时聚合酶链反应体系如下： 

蛋白质印记 

1.细胞总蛋白的提取 

1)弃培养基，用4℃预冷的5ml磷酸盐缓冲液漂洗细胞两次，加入5ml磷酸盐缓冲液后，用细胞刮下培养皿中的细胞，收于15ml离心管，1100rpm离心6min；弃上清，加入1ml磷酸盐缓冲液重悬细胞，收于EP管，7200rpm离心2min； 

2)弃上清，以1∶5(细胞：裂解液)体积比加裂解液，冰上15min，每2-3min混悬一次； 

3)4℃，14,000rpm离心15min，收集上清液于新EP管中，-80℃保存。 

2.考马斯亮蓝法测定蛋白浓度 

1)牛血清白蛋白标准品按说明依次用双蒸水稀释，使终浓度分别为1000μg/ml，750μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，62.5μg/ml，0μg/ml； 

2)根据样品和标准品数量，按每孔加200ul 1X考马斯亮蓝液，取1ul样品和标准品加入96孔板中，室温孵育5min，设副孔和空白孔； 

3)测定595nm波长的吸光度。根据标准曲线计算蛋白浓度； 

4)根据蛋白浓度计算上样体积，每组蛋白的上样量为25μg。 

3.聚丙烯酰胺凝胶电泳 

1)准备预成胶； 

2)变性：每孔25μg蛋白量上样，用蒸馏水将待测样本体积稀释至20ul，每样本加入5ul溴酚蓝，95℃加热10min； 

3)上样，以80V电压电泳至溴酚蓝电泳至分离胶，将电压调到100V，直至溴酚蓝到达分离胶底部，终止电泳。 

4.转膜 

1)准备预成膜； 

2)将电泳胶转移至预成膜中，使用伯乐半干转进行转膜； 

3)取出聚偏氟乙烯膜，TBST缓冲液漂洗5min。 

5.蛋白质印记滤膜杂交 

1)将转印后的聚偏氟乙烯膜用5％脱脂奶粉室温摇床封闭1小时； 

2)TBST缓冲液漂洗10min×3次； 

3)将滤膜取出，放入5％脱脂奶粉稀释的一抗稀释液中，4℃摇床过夜； 

4)TBST缓冲液洗膜，10min×3次； 

5)将滤膜放入5％脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗中，室温摇床孵育1小时； 

6)TBST缓冲液洗膜，10min×3次。 

6.显色 

将聚偏氟乙烯膜胶面朝上放在保鲜膜上，加入1∶1混合的显影液，使其均匀覆盖膜，暗室曝光，扫描。 

(5)IGFBP5对间充质干细胞成骨/成牙分化功能影响的体外研究，发现IGFBP5促进间充质干细胞成骨/成牙分化 

取脐带干细胞以2×10³/cm²的浓度接种于6孔板中，待细胞生长至80％融合后，用成骨诱导培养液将脐带干细胞在体外向成骨/成牙本质方向分化诱导，每2天换1次液，在光镜下观察钙结节形成情况。4天后测定碱性磷酸酶活性(图4A)来检测早期成骨分化指标-碱性磷酸酶，3周后检测铅素红染色(图4B)及测定钙离子浓度(图4C)来检测晚期成骨指标-细胞矿化能力。并在诱导1周、2周、3周的不同时间点收获细胞，在mRNA水平检测成骨/成牙本质的分化指标：骨粘连蛋白(图4D)、I型胶原蛋白(图4E)、骨桥蛋白(图4F)、牙本质涎蛋白(图4G)、牙本质基质酸性磷酸化蛋白1(图4H)、成骨相关核心转录因子OSX(图4I)。结果表明过表达IGFBP5促进脐带间充质干细胞体外成骨/成牙分化； 

取第3-4代牙周膜干细胞以2×10³/cm²的浓度接种于6孔板中，待细胞生长至80％融合后，用成骨诱导培养液将脐带干细胞在体外向成骨/成牙本质方向分化诱导，每2天换1次液，在光镜下观察钙结节形成情况。4天、8天后测定碱性磷酸酶活性(图5A)来检测早期成骨分化指标-碱性磷酸酶，3周后检测铅素红染色(图5B)及测定钙离子浓度(图5C)来检测晚期成骨指标-细胞矿化能力。诱导1周、2周、3周的不同时间点收获细胞，在mRNA水平检测成骨/成牙本质分化指标：骨粘连蛋白(图5D)、I型胶原蛋白(图5E)、骨桥蛋白(图5F)、牙本质涎蛋白(图5G)、牙本质基质酸性磷酸化蛋白1((图5 H)、成骨相关核心转录因子OSX(图5I)。结果表明基因敲除IGFBP5抑制牙周膜干细胞体外成骨/成牙分化。 

碱性磷酸酶染色： 

固定液：130ml丙酮，50ml柠檬酸盐，16ml甲醛，4℃保存； 

碱性磷酸酶染色液： 

1)溶液A1ml硝酸钠，1ml FRV/FBB液，振荡混匀，静置2min； 

2)离心管中加入45ml纯水； 

3)把溶液A加入2)中； 

4)把1ml Napthol As-BI ALK液加入3)中，振荡混匀； 

以上试剂要现用现配，根据实验需要按比例配制相应体积 

染色步骤： 

1)室温预热固定液； 

2)去培养基，PBS洗2次； 

3)加入2ml固定液，30s； 

4)弃固定液，纯水洗2次； 

5)加入2ml碱磷酶染色液，常温染色15min，避光； 

6)纯水洗2次，复染(必要时)； 

7)拍摄 

碱性磷酸酶活性测定： 

配制缓冲液： 

裂解液 

储存底物缓冲液：1胶囊5ml纯水(4℃储存) 

操作步骤： 

1)用标准品制作标准曲线； 

2)去培养基，磷酸盐缓冲液洗2次； 

3)加300μl裂解液，37℃摇床，15min； 

4)将细胞轻轻刮下，移至1.5ml EP管，4℃离心5min； 

5)取上清，移至另一EP管； 

6)取胶囊，加入5ml纯水溶解储存底物； 

7)取50μl碱性磷酸酶缓冲液加入50μl已溶解的储存底物，充分混匀； 

8)置于96孔板中，加入100μl(7)液，10μl上清液，37℃孵育15min； 

9)加入110μl 0.5N氢氧化钠终止反应； 

10)酶标仪上读取405nm波长吸光度值； 

茜素红染色： 

1)弃掉培养基，PBS洗2次； 

2)70％乙醇固定，4℃，1h； 

3)双蒸水洗2次； 

4)40mM茜素红溶液(pH4.2)室温染色1-10min，肉眼观察着色情况； 

5)双蒸水洗5次，轻轻吹打； 

6)扫描仪透摄模式采集图像 

Ca²⁺浓度检测： 

1)茜素红染色后，加入10％w/v CPC，室温放置30min； 

2)以1∶10稀释溶液，在酶标仪中以562nm波长测定其吸光度值 

3)标准曲线计算Ca²⁺的相对浓度 

实时反转录聚合酶链反应：(步骤如上) 

1.反转录聚合酶链反应引物序列： 

OSX-F：CCTCCTCAGCTCACCTTCTC 

OSX-R：GTTGGGAGCCCAAATAGAAA 

RUNX2-F：TCTTAGAACAAATTCTGCCCTTT 

RUNX2-R：TGCTTTGGTCTTGAAATCACA 

ALP-F：GACCTCCTCGGAAGACACTC 

ALP-R：TGAAGGGCTTCTTGTCTGTG 

COL1-F：ACAGGGCTCTAATGATGTTGAA 

COL1-R：AGGCGTGATGGCTTATTTGT 

ON-F：TCCCTGTACACTGGCAGTTC 

ON-R：TTGTCCAGGTCACAGGTCTC 

OPN-F：ATGATGGCCGAGGTGATAGT 

OPN-R：ACCATTCAACTCCTCGCTTT 

BSP-F：CAGGCCACGATATTATCTTTACA 

BSP-R：CTCCTCTTCTTCCTCCTCCTC 

DSPP-F：CGACATAGGTCACAATGAGGATGTcG 

DSPP-R：TTGCTTCCAGCTACTTGAGGTC 

OCN-F：AGCAAAGGTGCAGCCTTTGT 

OCN-R：GCGCCTGGGTCTCTTCACT 

GAPDH-F：CGGACCAATACGACCAAATCCG 

GAPDH-R：AGCCACATCGCTCAGACACC 

(6)研究IGFBP5对干细胞炎性因子的影响，发现IGFBP5抑制干细胞炎性因子的表达。 

临床收集正常及牙周炎患者牙周膜组织，牙周膜干细胞的分离、培养，提取RNA，反转录聚合酶链反应方法检测IGFBP5在正常及牙周炎患者牙周膜组织中的表达，发现IGFBP5在炎症牙周膜干细胞中表达降低(图6A)；检测基因敲除IGFBP5的牙周膜干细胞中炎性因子(白介素6，白介素8)的表达；发现IGFBP5沉默的牙周膜干细胞，炎性因子白介素6(图6B)和白介素8(图6C)表达升高；利用Transwell共培养技术，上室为转染IGFBP5的脐带干细胞，下室为基因敲除IGFBP5的牙周膜干细胞，在共培养48h后，收集下室细胞，提取mRNA，在RNA水平检测炎性因子白介素6和白介素8的表达，发现过表达IGFBP5能够挽救下室基因敲除IGFBP5牙周干细胞白介素6、白介素8的表达(图6D、E)。结果表明IGFBP5能够抑制干细胞炎性因子的表达。 

反转录聚合酶链反应引物序列： 

IL6-F：CGCAACAACTCATCTCATTCTGCG 

IL6-R：CATGCTACATTTGCCGAAGAGC 

IL8-F：CGGATAAAGGGCCAAGAGAATATCCG 

IL8-R：TCACATTCTAGCAAACCCATTCAA 

(7)建立小型猪牙周炎动物模型，发现IGFBP5促进脐带干细胞介导的牙周组织再生。 

建立小型猪牙周炎动物模型：采用制造骨缺损、结扎丝线的方法建立小型猪实验性牙周炎模型，在下颌第一恒磨牙近中邻面形成3mm×5mm×7mm缺损。手术后4周可成功形成牙周炎骨缺损模型(图7A-C)。 

7只五指山小型猪建立牙周炎模型，共14侧，分为3组，每侧回植干细胞量为5×10⁶：第1组.对照组：在建模后做翻瓣刮治；第2组：在建模后做翻瓣刮治+Vector空载体转染的脐带干细胞；第3组：在建模后做翻瓣刮治+过表达IGFBP5脐带干细胞。 

在干细胞治疗后0天、3天、5天、7天、4周和12周各时间点，抽取各组小型猪血液，进行血常规、血生化免疫检测，12周时提取牙龈沟液检测炎性细胞因子干扰素r，白介素8，肿瘤坏死因子α等。观察IGFBP5过表达后干细胞对小型猪机体的影响。通过比较造模后(-4w)，干细胞回植时(0w)及干细胞治疗后3个月(12w)的临床指标检查、影像学检查和组织学检查，观察IGFBP5对干细胞介导的小型猪牙周炎缺损组织再生修复能力的影响。 

CT影像学(图7A-F)、Geomagic Studio 12骨计量分析(图7G)、临床检查结果(图8)、组织病理结果(图9)表明IGFBP5促进脐带间充质干细胞介导的牙周组织再生，酶联免疫吸附试验(图10)检测结果表明IGFBP5抑制局部炎性因子干扰素r(图10A)，肿瘤坏死因子α(图10B)，白介素1b(图10C)，白介素8(图10D)，的表达，而且对全身血常规(图11)、血生化免疫球蛋白等指标无影响。 

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。