miRNA-188作为标记分子在制备诊断试剂中的用途

摘要

本发明提供了一种miRNA-188作为标记分子在制备诊断对比剂诱导的急性肾损伤试剂中的用途。本发明还提供了miRNA-188联合miRNA-30a、miRNA-e中任意一种或者两种作为标记分子在制备诊断对比剂诱导的急性肾损伤试剂中的用途。本发明还提供了一种试剂盒，含有miRNA-188。本发明经实验验证miRNA-188可以用于早期诊断CI-AKI。miR-188单独用于诊断CI-AKI的敏感性为52.11%，特异性为92.96%；与miR-30a和miR-30e联合诊断CI-AKI的敏感性为71.8%，特异性为88.7%。采用上述标记物早期诊断CI-AKI具有极大的应用前景和市场前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种分子标记物，具体来说是miRNA-188作 为标记分子在制备诊断试剂中的用途。

背景技术

对比剂诱导的急性肾损伤(Contrast Induced Acute Kidney Injury,CI-AKI)是指除外 其他因素，对比剂给药后新发生急性肾功能损伤或肾功能不全加重。CI-AKI是医源性 急性肾功能衰竭的第3位病因，占医源性急性肾功能衰竭的11％，目前临床上主要见 于接受冠状动脉介入诊疗手术的患者。近年来随着我国冠心病发病率的增加和冠脉介 入技术的广泛开展，CI-AKI的发病率、发病绝对人数有逐年升高趋势。

虽然大多数CI-AKI患者表现为一过性血肌酐水平升高，真正导致肾功能衰竭需要 透析治疗的比例还不到1％，但CI-AKI患者住院期间死亡、中风及各种心血管事件的 发生率均显著升高，长期生存率也明显低于无肾脏损伤表现的患者。CI-AKI的防治对 改善患者临床预后有重要意义。

研究表明，早期干预能够提高肾功能障碍改善的机会，是防治CI-AKI的关键。而 早期干预的前提是早期诊断。目前CI-AKI诊断的难点在于缺乏类似急性心肌梗死中肌 钙蛋白一样的敏感性高、特异性好的早期诊断生物标志物。临床上正在使用的诊断标 准是以血肌酐为依据，规定接受对比剂48-72h血肌酐绝对值增加0.5mg/dL以上或相 对值升高25％以上确诊CI-AKI。但血肌酐不是一个反映肾功能急性改变的可靠指标， 它在肾功能损失50％以前浓度不会改变，升高通常在对比剂暴露后48-72小时，严重 滞后，且受患者体重、种族、年龄、性别、身体体积、药物、肌肉代谢和蛋白质摄入 等许多非肾性因素影响(Thomsen HS,et al.,Br J Radiol 76(2003)513-518；Tomlanovich S, et al.,Am J Kidney Dis 8(1986)332-337；Van Biesen W,et al.,Clin J Am Soc Nephrol 1 (2006)1314-1319)。

最近10年的一些研究探讨了NAGL、IL-18、KIM-1等新型标记物作为CI-AKI早 期诊断指标的可靠性及可行性(Ferguson MA,et al.,Toxicology 245(2008)182-193； Devarajan P,et al.,Contrib Nephrol 156(2007)203-212)。这些诊断标记物中，血NAGL 相关研究最多，评价相对较好。Bachorzewska Gajewska等发现PCI术后患者血NGAL 在4h明显升高(Bachorzewska-Gajewska H,et al.,Kidney Blood Press Res 30(2007)408-415)。其灵敏度和特异度分别为0.9和0.74(Bachorzewska-Gajewska H,et  al.Int J Cardiol 127(2008)290-291)。但NAGL稳定性和特异性较差，易受许多已存 的可变因素的影响，如基础肾脏疾病和尿路感染，且不能进一步鉴别不同因素导致的 急性肾功能损伤，因此不能代替血肌酐作为临床CI-AKI的诊断标记物。

目前迫切需要寻找到一个敏感性好、特异性强、易于测量、稳定不受其他可变生 物因素影响的、可评价对比剂引起急性肾功能损伤的早期生物标志物。

miRNAs是一类23-25个核苷酸大小的、进化上高度保守、内源性单链非编码RNA。 同时，miRNA是一类具有生物活性的小RNA。miRNA通过与mRNA的配对结合，降解 mRNA或干扰其翻译，起到生物调节作用(Saal S,et al.,Curr Opin Nephrol Hypertens 18(2009)317-323)。

研究发现，miRNA表达具有组织特异性。Yu Liang、Pablo Landgraf等分别对不同 物种、不同组织miRNA表达谱进行研究。发现部分miRNAs在特定的组织特异性表达或 富集。例如，miR-122在肝脏特异性表达，而miR-133a、miR-499在骨骼肌、心肌特异 性表达(Liang Y,et al.,BMC Genomics 166(2007)8)。

同时，miRNAs表达具有疾病特异性。研究发现不同种类的癌症细胞miRNA表达特 点各不相同。Calin等首先发现miRNA-15、miRNA-16在慢性淋巴细胞性白血病中表达 下调(Barbarotto E,et al.,Curr Pharm Des 14(2008)2040-2050)。而Nozomu Yahaihara等的 观察到肺腺癌中miR-155高表达、let-7a-2低表达(Yanaihara N,et al.,Cancer Cell 9(2006)189-198)。证明了miRNAs的表达具有疾病特异性。miRNA表达还具有时相性， miRNA表达谱随疾病病程动态改变。Jonathan Godwin等对肾脏缺陷再灌注小鼠模型不 同时间点肾脏miRNA表达谱进行对比发现，miRNAs呈现出不同的变化趋势。例如， miRNA-21在再灌注早期迅速升高，达到平台期。而miRNA-146a在再灌注第3-7天才开 始逐渐升高(Godwin JG,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 107(2010)14339-14344)。

部分研究发现miRNA在病变组织、器官的表达改变能反应在血浆中。研究发现前 列腺癌组织高表达的miR-141在前列腺癌患者血清中也明显高于健康人群，且具有较高 的敏感性和特异性(Mitchell PS,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 105(2008)10513-10518)。 药物性肝损模型小鼠中，肝脏特异的miRNA-122在小鼠肝脏中表达下调，但在血浆中 表达明显上调,并具有剂量/时间相关性。血浆中miRNA还具有很好的稳定性(Wang K,et  al.,Proc Natl Acad Sci U S A 106(2009)4402-4407)。虽然血浆中存在大量降解RNA的酶， 血浆中基本不存在长段的RNA，但miRNA在血浆中可以以某种形式稳定存在。研究发 现血浆中的miRNAs在室温(24小时)和反复冻融(8次)的情况下均保持稳定(Chen X,et al., Cell Res 18(2008)997-1006)。

正是由于miRNA的组织、疾病特异性，与疾病病理生理状态密切相关的特性决定 了miRNA作为诊断标记物具有较高的特异性。同时血浆或血清中miRNA能反映病变组 织miRNA表达的改变。因此血浆miRNA作为一种无创的、特异的疾病诊断标记物越来 越得到重视和认可。

已有大量研究探讨了miRNA在慢性肾脏疾病中的地位,其中包括多囊性肾病、糖尿 病肾病、肾脏肿瘤等(Sun H,et al.,Mol Biol Rep 37(2011)2951-2958；Kato M,et al.,Proc  Natl Acad Sci U S A 104(2007)3432-3437；Zhang Z,et al.,FEBS Lett 583(2009)2009-2014； Hanke M,et al.,Urol Oncol 28(2009)655-661)。但目前国内外无相关研究关注血浆 miRNA作为CI-AKI的诊断标记物。

全血、血清或血浆是最广泛使用的临床途径样品源。寻找到提供早期诊断信息的 对比剂诱导急性肾损伤血浆标记物，可产生一种诊断性实验，极大地帮助诊断和处理 该疾病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种miRNA-188作为标记分子在制备诊断试剂中的用途，所 述的这种用途解决了现有技术中诊断对比剂诱导的急性肾损伤的分子标记物稳定性和 特异性较差，易受许多已存的可变因素影响的技术问题。

本发明提供了miRNA-188作为标记分子在制备诊断对比剂诱导的急性肾损伤试剂 中的用途，所述的miRNA-188的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供了miRNA-188作为标记分子在制备早期诊断对比剂诱导的急性肾损 伤试剂中的用途，所述的miRNA-188的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

进一步的，其中所述早期诊断是指对比剂暴露后的4-6小时。

本发明还提供了miRNA-188联合miRNA-30a、miRNA-30e中任意一种或者两种作为 标记分子在制备诊断对比剂诱导的急性肾损伤试剂中的用途，所述的miRNA-188的碱 基序列如SEQ ID NO：3所示，所述的miRNA-30a的碱基序列如SEQ ID NO：1所示， 所述的miRNA-30e的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了miRNA-188联合miRNA-30a、miRNA-30e中任意一种或者两种作为 标记分子在制备早期诊断对比剂诱导的急性肾损伤试剂中的用途，所述的miRNA-188 的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，所述的miRNA-30a的碱基序列如SEQ ID NO：1所 示，所述的miRNA-30e的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种试剂盒，含有miRNA-188，所述的miRNA-188的碱基序列如 SEQ ID NO：3所示。

本发明提供了涉及对比剂诱导的急性肾损伤诊断方法，该方法包括以下步骤：a) 提供由个体获得的血浆样品；b)测量对比剂暴露前后血浆样品中miR-188浓度变化倍 数，和c)将(b)与CI-AKI诊断相关联。

本发明还提供了涉及对比剂诱导的急性肾损伤的另一个优选实施方案诊断方法， 该方法包括以下步骤：a)测量对比剂暴露前后血浆样品中miR-188浓度变化倍数，b) 任选地测量血浆样品中CI-AKI的一种或多种其他miRNA标记的浓度变化倍数；和c)使 用在步骤(a)和任选的步骤(b)中测定的浓度变化倍数，诊断CI-AKI。

如本文所使用的，下面术语的每一个在本部分中具有与它相关的含义。

术语“个体”在本文中用于指接受冠脉介入诊疗手术的患者，这些患者未接受普通 肝素抗凝治疗，或给予普通肝素抗凝治疗超过4小时。

术语“测量”在本文中用于指包括microRNA芯片、Solexa测序、Taqman低密度阵列、 实时荧光定量PCR或基于微球的各种microRNA检测方法。

术语“血浆样品”在本文中用于指为体外评价目的而得到的患者血浆，该血浆自经 EDTA(工作浓度为1.8mg/ml)抗凝的个体全血离心后获得。

在优选的实施方案中，本发明涉及通过各种microRNA检测方法体外检测血浆 miR-30a、miR-188和miR-30e浓度变化，和使用测定的浓度变化诊断CI-AKI。

本发明提出了一种miR-188的新用途。本发明经实验验证miR-188可以用于早期(对 比剂暴露后4-6小时)诊断CI-AKI。miR-188单独用于诊断CI-AKI的敏感性为52.11％， 特异性为92.96％；与miR-30a和miR-30e联合诊断CI-AKI的敏感性为71.8％，特异性为 88.7％。采用上述标记物早期诊断CI-AKI具有极大的应用前景和市场前景。

上述本发明内容已经对本发明做了详细的描述，为了使本领域技术人员更清楚本 发明的发明内容和技术效果，下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说 明。

附图说明

图1说明通过miRNA芯片方法筛选对比剂诱导的急性肾损伤标记物流程。

图2A为用real-time PCR方法检测证明miR-188在大鼠肾脏组织特异表达。

图2B为检索已发表的人组织miRNAs表达谱文献显示miR-188在人体肾脏组织特异 性表达。

图3用real-time PCR方法验证芯片结果，CI-AKI大鼠血浆miR-188表达上调。

图4用real-time PCR方法验证芯片结果，CI-AKI大鼠血浆miR-188在对比剂暴露后 4h上升达峰值。

图5用real-time PCR方法证明，CI-AKI大鼠血浆miR-188升高与对比剂诱导的肾损 伤特异相关。

图6用real-time PCR方法比较miR-188在CI-AKI和非CI-AKI患者血浆中的水平，证 明CI-AKI患者显著升高。

图7miR-188作为CI-AKI诊断标志物的ROC评价。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。

实施例1  芯片筛选人肾脏特异性表达的目标miRNA

1.构建CI-AKI大鼠模型

本发明通过在禁水3天、利尿“预处理”的基础上经尾静脉注射低渗对比剂的方法 建立CI-AKI大鼠模型。这是本发明人建立的一种新型CI-AKI大鼠模型，具体方案见相 关文献(Sun SQ,et al.Int Journal of Cardiol 172(2014)e48-50)。

2.miRNA芯片差异表达谱分析

1)miRNA芯片制备

在采用上述方法成功造模的基础上，留取造模后8小时CI-AKI大鼠血浆、肾脏，用于芯 片上样。采用Agilent miRNAs 10.0version芯片技术，以血浆和肾脏总RNA进行上样， 以磷酸化Cyanine3-pCp进行标记，然后进行芯片杂交、洗涤和数据采集。

2)生物信息学分析

芯片荧光强度信号值采用AgilentG4450AA Feature Extraction Software 9.5以及Agilent  Scan Control Software version A7.0软件进行采集分析。样品信号值用原始数据经归一化 (normalization)后进行log2转换表示。样品信号Flag值A(Absent)代表信号与背景差异 不显著，P(Present)代表信号与背景差异显著。样品数据分析采用Agilent Gene Spring  software 9.0，通过对比CI-AKI和非CI-AKI大鼠的肾脏和血浆芯片数据，得到差异表达 的microRNA，结果如表1所示。

表1.miRNAs表达谱分析

3)根据芯片数据初步筛选目标miRNA

通过检索miRbase(release 16)数据库以及发表的人组织miRNAs表达谱文献(Liang  Y,et al.BMC Genomics.2007Jun 12；8:166.)，筛选CI-AKI大鼠血浆表达上调、人鼠同 源、肾脏特异或富集的miRNAs作为CI-AKI的早期候选诊断标记物，具体流程如图1 所示。经筛选之后确定的目标miRNA有miR-30a、miR-30e和miR-188三个。本发明 重点探究了miR-188能否作为CI-AKI早期诊断标志物，同时也评价了联合多种miRNAs 诊断CI-AKI的能力。

以上结果是是基于miRNA芯片技术得到的结果，下面我们采用更为精确的real-time  PCR方法进行验证。

实施例2  验证目标miRNA肾脏的特异性表达

用经典的Trizol法提取大鼠各组织的总RNA，real-time PCR检测目标miRNA在大鼠 各组织的表达水平，同时通过检索已发表的人组织miRNAs表达谱文献对比人各组织的 表达水平。图2为miR-188在大鼠(A)和人(B)各组织中的表达谱结果，miR-188在 大鼠和人的肾脏表达量均大于其他脏器2倍及2倍以上，因此认为该miRNA肾脏特异性 较高。

实施例3  血浆microRNA的抽提

本发明对血浆采用两步离心的方法，去除了血液中的血细胞以及细胞碎片，RNA 抽提采用mirVana PARIS Kit(Applied Biosystem,P/N AMl556)，这是一种适用于血浆或 血清中RNA的试剂盒。目前血浆中RNA定量并没有公认的内参可用，本发明在RNA抽 提过程中加入外源性的内参cel-miR-39(线虫表达的miRNA,在人体内并不表达该序 列)，用来校正目标miRNA的RT-PCR检测结果。

血浆样本预处理方法：全血收集于EDTA抗凝管(工作浓度为1.8mg/ml)内，先经 4℃，820g离心10min,去除血细胞，上清再经4℃，16000g离心10min,去除细胞碎片， 最后吸取上清于1.5ml RNase/DNase-free的离心管中，-80℃分装冻存备用。

RNA抽提的具体步骤如下：

1)取400μL血浆，加入等量的2×Denaturing Solution，涡旋混匀，冰上放置5分钟。

2)添加与总体积等量的acid-phenol:chloroform，涡旋混匀30-60秒，室温，最高转 速离心5分钟。

3)小心吸取上清到新的1.5ml离心管中，添加1.25倍体积的100％乙醇，涡旋混匀。

4)将洁净的离心柱放置到洁净的收集管中，吸取上一步的液体到离心柱中，10000 g，室温离心30秒，弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中。重复该步骤，直到所有 的液体过离心柱。

5)吸取700μL miRNA Wash Solution 1到离心柱中，10000g，室温离心15秒，弃流 过液，将离心柱重新放置到收集管中。

6)500μL Wash Solution 2/3过柱两次，空柱离心1分钟。

7)将离心柱放置到新的收集管中，柱中心加入100μL 95℃预热的nuclease-free水， 室温最高转速离心30秒，收集管中的液体即为提取的Total RNA，置在-80℃保存。

实施例4  血浆microRNA的real-time PCR检测

使用美国Ambion生物公司的miRNA检测试剂盒(包括逆转录试剂盒，特异性 miRNA引物和探针，荧光定量检测试剂盒等)检测miR-30e及内参cel-miR-39的相关水 平。

具体过程如下：

1.逆转录反应：使用Taqman microRNA Reverse Transcription kit(P/N:4366596)和目标 miRNA特异性逆转录引物进行逆转录反应，具体步骤如下：

1)配制反应体系：按照表2配制

表2.microRNA逆转录的反应体系

2)逆转录反应：在上进行逆转录反应，反应参数为：16℃，30分钟；42℃，30 分钟；85℃，5分钟。

2.real-time PCR反应：使用Taqman Universal PCR MasterMix(P/N:4324018)和目标 miRNA特异性探针和引物进行荧光定量PCR反应。具体步骤如下：

1)配制反应体系：每个目标miRNA每个模板设置三个复孔，反应体系如表3所示。

表3.Real time PCR反应体系

2)Real-time PCR反应：在Roche公司的LightCycler480实时荧光定量PCR仪器上进 行real-time PCR反应：95℃预变性10分钟，循环参数为95℃，15秒；60℃，1分钟， 循环次数为40。所以反应重复三次，每次取固定的荧光阈值，取得的平均值即为该样 品中目标miRNA的CT值。

3.real-time PCR结果的分析：用上述方法可测得样品血浆中目标miRNA和内参 miRNA的CT值。以cel-miR-39为内参，以PCR检测中经典的2-△CT求得目标miRNA在样品 血浆中的相对含量(△CT为目标miRNA与内参cel-miR-39的CT值之差)，然后以2^-△△CT求得目标miRNA的相对改变倍数(△△CT为术后△CT与基线△CT之差)。

实施例5  验证目标miRNA血浆表达水平的改变

采用上述的血浆miRNA的real time PCR方法对目标miRNA的芯片结果进行验证， 结果如图3，显示了两者结果的一致性。

以上是对芯片结果的验证，结果显示了芯片结果和real-time PCR结果的一致性，保 证了筛选结果的可靠性，对于miRNA是否可成为对比剂诱导急性肾损伤诊断的标志物， 仍需要进一步验证。

实施例6  大鼠CI-AKI模型血浆miRNA的变化

本发明首先在CI-AKI的动物模型上验证目标miRNA是否可成为对比剂诱导急性肾 损伤诊断的标志物。

1.首先本发明对造模后不同时间的血浆进行了收集并检测miR-188在血浆中的水平 变化，结果如图4。miR-188在造模后2小时，血浆水平明显升高，在4-6小时呈现最高 值，在8小时之后开始下降，24小时后降至基线水平。

2.因为在CI-AKI模型建立的过程中，涉及到了禁水、对比剂等处理因素，为排除这 些处理因素造成血浆miRNA非特异性升高的可能，本发明又分别在造模组(预处理+ 对比剂)、预处理组和对比剂组的大鼠血浆中检测了目标miRNA的水平，结果如图5。 miR-188在预处理组和对比剂组大鼠血浆中都没有明显的升高，而在造模组大鼠血浆中 明显升高，表明目标miRNA是因发生急性肾损伤导致学血浆水平升高，而不是因为处 理因素导致的非特异性升高。

实施例7  大样本临床CI-AKI患者验证目标miRNA的变化

上述动物验证部分显示了目标miRNA可以作为CI-AKI的诊断标志物，在术后4-6 小时达到峰值，下面我们将在人体上进行验证。

1.患者病例收集

血浆样本共计392例，其中71例CI-AKI患者血浆，321例非CI-AKI患者血浆。血样 来自上海交通大学医学院附属仁济医院心内科，血样在患者入院后和造影术后4-6小时 各收取一次，收取时间自2013年7月至2014年6月。根据患者年龄(<50、50-70、>70)、 糖尿病(Yes、No)、肾功能分期(Stage1、2、3期)将71例CI-AKI患者进行1：1配 对，共计142例患者纳入。患者临床病例特征如表4所示。

表4.患者临床特征

2)目标miRNA的表达分布

作为一个理想的疾病诊断标志物，在血浆中的本底水平应该较低，保证检测指标的敏 感性高，并且表达水平相对均一，保证检测结果的稳定性。本发明通过real-time PCR 方法检测了目标miR-188在血浆中的水平，结果如表5。结果显示miR-188在造影术前的 CT值约32-34，说明miR-188在非CI-AKI患者中的血浆中的水平较低。另外可以看到 miR-188在不同临床危险因素下血浆中的CT值相近，说明了miR-188在血浆中的稳定表 达。

表5.miR-188的基线水平

3)CI-AKI患者血浆中miRNA的变化

本发明分析了目标miRNA在CI-AKI和非CI-AKI组中血浆的表达情况，如图6所示， CI-AKI患者中miR-188的表达水平显著高于非CI-AKI组。

4)miRNA作为CI-AKI诊断的ROC评价

根据所得数据进行ROC分析，结果如图7。miR-188能较好的区分CI-AKI与非CI-AKI， AUC下面积是0.784，诊断准确度较高。在诊断界值的条件下，miR-188诊断CI-AKI的 灵敏度、特异度分别为52.11％、92.96％，表示miR-188作为CI-AKI的早期诊断标志物具 有较高的灵敏度和特异度，可以作为一种新的可用于诊断CI-AKI的潜在标志物。

5)miR-188水平诊断CI-AKI的范围

根据所得数据，血浆中miR-188的诊断临界值为2^-△△CT>1.343。患者造影术后4-6小时血 浆中miR-188的水平与诊断临界值比较，高于临界值则诊断为CI-AKI，低于临界值则诊 断为非CI-AKI。

6)血浆miRNA联合诊断CI-AKI的评价

为避免单一miRNA诊断CI-AKI的局限性，本发明优选方案中同时检测了血浆 miR-30a和miR-30e的浓度变化，结果显示CI-AKI患者中的表达水平显著高于非CI-AKI 组，AUC下面积分别是0.802、0.805，诊断准确度较高。根据目前数据得到，血浆中 miR-30a的诊断临界值为2^-△△CT>1.405，miR-30e的诊断临界值为2^-△△CT>1.428。本发明在 此基础上提出了一个联合诊断模型，即患者血浆中任一miRNA的浓度改变超过上述界 值即可诊断为CI-AKI，此时诊断CI-AKI的灵敏度、特异度分别为71.83％、88.73％，综 合诊断能力较单独使用miR-188时有所提高。

结论：作为一个新型的诊断标志物，血浆miR-188能够在肾损伤早期就可以检测到 表达水平的变化，能够用于CI-AKI的早期诊断，优于血肌酐，联合其他miRNA诊断效 果更好。