一种高龙脑含量的龙脑樟组培繁育方法

摘要

本发明公开一种高龙脑含量的龙脑樟组培繁育方法。本发明从龙脑樟天然变异中选育出龙脑含量达90％以上的龙脑樟个体，采集当年抽梢的半木质化茎段作为外植体，经消毒处理后，建立无菌系，再通过芽的初生诱导、增殖培养、生根培养等，形成再生植株。本发明筛选出了高龙脑含量的龙脑樟组培繁殖各个环节的适宜配方及培养条件，成功的获得了高龙脑含量的龙脑樟再生植株。因此本发明有效的解决了龙脑含量90％以上的龙脑樟组培繁育中出现褐化和死苗的技术难题，将为优良龙脑樟原料林基地的建设提供种苗保障。

说明书

技术领域：

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种高龙脑含量的龙脑樟组培繁育方法。 

背景技术：

龙脑樟是从樟树(Cinnamonun Camphora(I)Presl)中发现的枝叶中富含天然右旋龙脑(天然冰片)的一种化学类型，可从龙脑樟新鲜叶片中提取精油后加工成天然右旋龙脑。天然龙脑是一种名贵中药和高级香料，具有抗菌、消炎、收敛、生肌、抗妊娠、止痛等作用，在医药和香料产业具有广泛的应用前景。 

由龙脑樟自由授粉种子繁育的半同胞后代，分化现象极其严重。其中可以发现叶精油含量高、精油中主成分龙脑含量达到90％～97％以上的优良个体。在优良个体发现后，大力扩大繁殖以便在生产上应用，则是必须首先需决的关键技术问题。组培繁殖就是高龙脑含量龙脑樟的高效快速繁殖途径之一。 

目前，有关龙脑樟组培繁殖技术方面没有公开专利申请，仅有2篇公开发表的论文：一是2010年由陈美兰，叶正良，欧阳少林等发表在《中国中药》杂志35卷第5期上的“龙脑樟愈伤组织的诱导及龙脑的产生”，该论文采用龙脑樟嫩叶、茎做外植体，目的旨在比较取材部位不同的外植体诱导的愈伤组织是否能生产出龙脑，而未进行植株再生研究。二是2011年刘秀芳、林文革、苏明华等发表在《植物研究》杂志31卷第5期上的“龙脑樟组培育苗及苗木工厂化生产技术研究”，该论文以树干基部萌芽条为外植体开展了龙脑樟组培快繁技术研究，其关键技术在于以降低MS培养中铵盐的含量(NH₄NO3降为825mg/L)作为基本培养基，在附加6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L(增殖)和1/2改良MS+IBA 0.5mg/L+IAA 0.4mg/L (生根)的外源激素调控下获得了增殖培养条件和再生植株。该论文没有明确外植体材料的龙脑含量。而事实上，龙脑樟不同基因型或龙脑含量的高低不同，在组培繁殖条件筛选中起关键作用。龙脑含量越高，增殖培养过程中化感效应越明显，极易导致增殖苗因培养基中龙脑含量过高而褐化或死亡。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种高龙脑含量的龙脑樟组培繁育方法，利用该方法能够在尽可能短的时间内快速大量获得高龙脑含量的龙脑樟的优质种苗。 

本发明的高龙脑含量的龙脑樟组培繁育方法，其特征在于，包括以下步骤： 

a、无菌系的建立：以叶精油中龙脑含量90％～97％的高龙脑含量龙脑樟母树当年生枝条作为外植体，经灭菌后，接种于诱导培养基中，在光照强度2000～3000Lux，12h/天，温度20～30℃下培养，直到长出初生芽，所述的诱导培养基每升含有：6-BA 5.0～7.0mg、IBA2.0～3.0mg、白糖30g、卡拉胶5.0g，其余为改良MS培养基，pH5.6～5.8；在初代增殖培养过程中，以芽生芽的方式及丛生芽的方式进行增殖，削弱从愈伤组织中分化芽的能力。此方法能最大限度地保持亲本遗传特性。 

b、增殖培养：将初生芽接种到第一增殖培养基上，在光照强度2500Lux～3000Lux，温度23～28℃下增殖培养，继代若干个周期后，待芽基部分化出不定芽并有白色愈伤组织产生时，再接种到第二增殖培养基上，在光照强度2500Lux～3000Lux，温度23～28℃下增殖培养，获得增殖苗，所述的第一增殖培养基每升含有：6-BA 5.0～7.0mg、IBA2.0～3.0mg、卡拉胶3.0g，其余为改良MS培养基，pH6.8～7.0；所述的第二增殖培养基每升含有：6-BA 0.5～3.5mg、IBA2.0～3.0mg、VB₂10～30mg、卡拉胶3.0g，余量为改良MS培养基，pH6.8～7.0；增殖培养 基可使增殖培养过程中产生的不定芽数和有效苗数(高3～4cm，叶宽1～2cm)得到均衡发展，既减少愈伤组织产生，又减缓愈伤组织褐化变黑。 

c、生根培养：剪取增殖苗中具有4～5片叶且叶面完全展开、光滑发亮的无根小苗，接入生根培养基中，在光照强度2000～3000Lux，12h/d，温度20～30℃下进行生根培养，得到生根苗，所述的生根培养基每升含有：NAA0.5～1.5mg、IBA0.1～1.0mg、白糖30g、卡拉胶5.0g，其余为改良MS培养基，pH5.6～5.8；一般培养12～15天后，能产生4～5条根系，小苗长成完整植株。 

d、组培苗移栽：将生根苗洗去基部培养基后再移植到基质中，移植后浇足定根水，常规育苗管理，满足水肥供应，长出高龙脑含量的龙脑樟幼苗，所述的基质是由红壤心土和草木灰按照质量比3:1的比例混合搅拌均匀而成，该基质配方取材方便，价格低廉，保水性强，病虫害少，利于应用； 

上述培养基都是将除改良MS培养基之外的组份加入到改良MS培养基中，混合均匀后再灭菌备用。 

所述的改良MS培养基，每升含有：(1)大量元素：硝酸钾1900mg，硝酸铵800mg，硫酸镁﹒7H₂O 370mg，硝酸钙﹒4H₂O 200mg，氯化钙﹒2H₂O 437mg，磷酸二氢钾170mg，(2)铁盐：硫酸亚铁﹒7H₂O 27.8mg，乙二胺四乙酸二钠37.3mg；(3)微量元素：硼酸10mg，硫酸锰﹒H₂O 25mg，硫酸锌﹒7H₂O 10mg，钼酸钠﹒2H₂O 0.25mg，硫酸铜﹒5H₂O 0.025mg；(4)有机成分：肌醇100mg，抗坏血酸10mg，盐酸硫胺素0.5mg，烟酸5mg，盐酸吡哆辛0.5mg，甘氨酸2mg，余量为水，其是将除水之外的成分加入到水中，搅拌均匀，溶解完全后即为改良MS培养基。该配方在高龙脑含量的龙脑樟增殖培养过程中，能满足其基本生长需要，提 高大量元素中钙的含量可加强芽体木质化程度，且对减少不定芽玻璃化现象效果明显；增加有机成分的含量，可有效缓解愈伤组织褐化。此配方是减少龙脑樟组培苗生长过程玻化、褐化现象发生的关键因素之一。 

所述的步骤b的增殖培养中的继代若干个周期，优选为继代1～2个周期。 

龙脑樟是樟树中叶精油富含天然右旋龙脑(天然冰片)的一种特异化学类型，在医药和香料产业中具有广泛应用前景。但龙脑樟资源稀少，而个体间差异却极大，因此，筛选出叶精油含量高、精油中主成分龙脑含量高的优良品系，并建立其高效无性繁育技术体系，是最大限度保持母本特性并能快速、大量获得优质种苗的有效途径，而组培繁殖技术当首先。前人对龙脑樟的组培繁殖技术有过尝试，一是直接诱导愈伤组织生产龙脑，二是在组织培养过程中未解决基部褐化问题，最终导致在增殖培养过程中死苗的现象发生。事实上，母本材料的龙脑含量越高，越容易出现褐化和死苗现象。本发明从龙脑樟天然变异中选育出龙脑含量达90％以上的龙脑樟个体，采集当年抽梢的半木质化茎段作为外植体，经消毒处理后，建立无菌系，再通过芽的初生诱导、增殖培养、生根培养等，形成再生植株。本发明筛选出了高龙脑含量的龙脑樟组培繁殖各个环节的适宜配方及培养条件，成功的获得了高龙脑含量的龙脑樟再生植株。因此本发明有效的解决了龙脑含量90％以上的龙脑樟组培繁育中出现褐化和死苗的技术难题，将为优良龙脑樟原料林基地的建设提供种苗保障。 

附图说明：

图1是龙脑樟初生芽； 

图2是龙脑樟增殖瓶苗； 

图3是龙脑樟组培生根苗； 

图4是龙脑樟组培移栽苗。 

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。 

实施例1： 

a、无菌系的建立：以叶精油中龙脑含量90％～97％的高含量龙脑樟母树当年生枝条作为外植体，剪去叶片及顶芽，取顶芽下部含有4～5个腋芽的茎段，用洗涤剂清洗表面，在超净工作台上用酒精浸过30s后，先用5％次氯酸钠溶液灭菌6min后，再用0.1％的升汞消毒5～6min，之后用无菌水冲洗5～6遍，剪去茎段两端约0.5cm，视节间长短，将茎段剪成带1～2个腋芽的小段，接种于诱导培养基中，在光照强度2000～3000Lux，12h/天，温度20～30℃下培养，培养约1周后，茎段上的腋芽开始膨大，继而慢慢长出叶片，未被污染的外植体即可作为进一步培养，直到长出初生芽(图1)，所述的诱导培养基每升含有：6-BA 5.0mg、IBA2.0mg、白糖30g、卡拉胶5.0g，其余为改良MS培养基，pH5.6～5.8；初芽诱导率可达85％～90％。 

b、增殖培养：将初生芽接种到第一增殖培养基上，在光照强度2500Lux～3000Lux，温度23～28℃下增殖培养，培养周期40d，继代2周期后，待芽基部分化出多个不定芽并有少量白色愈伤组织产生时，再接种到第二增殖培养基上，在光照强度2500Lux～3000Lux，温度23～28℃下增殖培养，获得增殖苗(图2)，所述的第一增殖培养基每升含有：6-BA 5.0mg、IBA2.0mg、卡拉胶3.0g，其余为改良MS培养基，pH6.8～7.0；所述的第二增殖培养基每升含有：6-BA0.5mg、IBA2.0mg、VB₂10mg、卡拉胶3.0g，余量为改良MS培养基，pH6.8～7.0；增殖培养基可使增殖培养过程中产生的不定芽数和有效苗数(高3～4cm，叶宽1～2cm)得到均衡发展，既减少 愈伤组织产生，又减缓愈伤组织褐化变黑；每生长周期增殖系数可达6以上； 

c、生根培养：剪取增殖苗中具有4～5片叶且叶面完全展开、光滑发亮的无根小苗，接入生根培养基中，在光照强度2000～3000Lux，12h/d，温度20～30℃下进行生根培养，得到生根苗(图3)，所述的生根培养基每升含有：NAA0.5mg、IBA0.1mg、白糖30g、卡拉胶5.0g，其余为改良MS培养基，pH5.6～5.8；一般培养12～15天后，生根率达95％以上，根系数量4～5条，小苗长成完整植株。 

d、组培苗移栽：用粉碎机把红壤心土粉碎成细小颗粒，按3质量份红壤心土和1质量份草木灰的比例混合搅拌均匀后，作为龙脑樟组培苗移栽的基质，用直径和高度为6cm×8cm左右的杯状营养袋装填基质。将生根苗洗去基部培养基后放到筛盘中滤干水，即可移栽到营养袋的基质中，栽完后浇足定根水，使基质与苗木根系紧密融合。一周内用雾状喷水器每天给叶面补充水分3～5次，之后每天补水1～2次。1个月后待叶片光滑平整时，可适时适量喷施叶面肥，进入常规育苗管理，得到高龙脑含量的龙脑樟的可用于移栽的幼苗(图4)。 

所述的改良MS培养基，每升含有：(1)大量元素：硝酸钾1900mg，硝酸铵800mg，硫酸镁﹒7H₂O 370mg，硝酸钙﹒4H₂O 200mg，氯化钙﹒2H₂O 437mg，磷酸二氢钾170mg，(2)铁盐：硫酸亚铁﹒7H₂O 27.8mg，乙二胺四乙酸二钠37.3mg；(3)微量元素：硼酸10mg，硫酸锰﹒H₂O 25mg，硫酸锌﹒7H₂O 10mg，钼酸钠﹒2H₂O 0.25mg，硫酸铜﹒5H₂O 0.025mg；(4)有机成分：肌醇100mg，抗坏血酸10mg，盐酸硫胺素0.5mg，烟酸5mg，盐酸吡哆辛0.5mg，甘氨酸2mg，余量为水。该配方在高龙脑含量的龙脑樟增殖培养过程中，能满足其基本生长需要，提高大量元素中钙的含量可加强芽体木质化程度，且对减少不定芽玻璃化现象效果明显；增加有机成分的含量，可有效缓解愈伤组织褐化。此配方是减少龙脑樟组培苗生长过程 玻化、褐化现象发生的关键因素之一。 

实施例2： 

a、无菌系的建立：以叶精油中龙脑含量90％～97％的高含量龙脑樟母树当年生枝条作为外植体，剪去叶片及顶芽，取顶芽下部含有4～5个腋芽的茎段，用洗涤剂清洗表面，在超净工作台上用酒精浸过30s后，先用5％次氯酸钠溶液灭菌6min后，再用0.1％的升汞消毒5～6min，之后用无菌水冲洗5～6遍，剪去茎段两端约0.5cm，视节间长短，将茎段剪成带1～2个腋芽的小段，接种于诱导培养基中，在光照强度2000～3000Lux，12h/天，温度20～30℃下培养，培养约1周后，茎段上的腋芽开始膨大，继而慢慢长出叶片，未被污染的外植体即可作为进一步培养，直到长出初生芽(图1)，所述的诱导培养基每升含有：6-BA 7.0mg、IBA3.0mg、白糖30g、卡拉胶5.0g，其余为改良MS培养基，pH5.6～5.8；初芽诱导率可达85％～90％。 

b、增殖培养：将初生芽接种到第一增殖培养基上，在光照强度2500Lux～3000Lux，温度23～28℃下增殖培养，培养周期40d，继代1周期后，待芽基部分化出多个不定芽并有少量白色愈伤组织产生时，再接种到第二增殖培养基上，在光照强度2500Lux～3000Lux，温度23～28℃下增殖培养，获得增殖苗(图2)，所述的第一增殖培养基每升含有：6-BA 7.0mg、IBA3.0mg、卡拉胶3.0g，其余为改良MS培养基，pH6.8～7.0；所述的第二增殖培养基每升含有：6-BA3.5mg、IBA3.0mg、VB₂30mg、卡拉胶3.0g，余量为改良MS培养基，pH6.8～7.0；增殖培养基可使增殖培养过程中产生的不定芽数和有效苗数(高3～4cm，叶宽1～2cm)得到均衡发展，既减少愈伤组织产生，又减缓愈伤组织褐化变黑；每生长周期增殖系数可达6以上； 

c、生根培养：剪取增殖苗中具有4～5片叶且叶面完全展开、光滑发亮的无根小苗，接入生根培养基中，在光照强度2000～3000Lux，12h/d，温度20～30℃下进行生根培养，得到生根苗(图3)，所述的生根培养基每升含有：NAA1.5mg、IBA 1mg、白糖30g、卡拉胶5.0g，其余为改良MS培养基，pH5.6～5.8；一般培养12～15天后，生根率达95％以上，根系数量4～5条，小苗长成完整植株。 

d、组培苗移栽：用粉碎机把红壤心土粉碎成细小颗粒，按3质量份红壤心土和1质量份草木灰的比例混合搅拌均匀后，作为龙脑樟组培苗移栽的基质，用直径和高度为6cm×8cm左右的杯状营养袋装填基质。将生根苗洗去基部培养基后放到筛盘中滤干水，即可移栽到营养袋的基质中，栽完后浇足定根水，使基质与苗木根系紧密融合。一周内用雾状喷水器每天给叶面补充水分3～5次，之后每天补水1～2次。1个月后待叶片光滑平整时，可适时适量喷施叶面肥，进入常规育苗管理，得到高龙脑含量的龙脑樟的可用于移栽的幼苗(图4)。 

所述的改良MS培养基，每升含有：(1)大量元素：硝酸钾1900mg，硝酸铵800mg，硫酸镁﹒7H₂O 370mg，硝酸钙﹒4H₂O 200mg，氯化钙﹒2H₂O 437mg，磷酸二氢钾170mg，(2)铁盐：硫酸亚铁﹒7H₂O 27.8mg，乙二胺四乙酸二钠37.3mg；(3)微量元素：硼酸10mg，硫酸锰﹒H₂O 25mg，硫酸锌﹒7H₂O 10mg，钼酸钠﹒2H₂O 0.25mg，硫酸铜﹒5H₂O 0.025mg；(4)有机成分：肌醇100mg，抗坏血酸10mg，盐酸硫胺素0.5mg，烟酸5mg，盐酸吡哆辛0.5mg，甘氨酸2mg，余量为水。该配方在高龙脑含量的龙脑樟增殖培养过程中，能满足其基本生长需要，提高大量元素中钙的含量可加强芽体木质化程度，且对减少不定芽玻璃化现象效果明显；增加有机成分的含量，可有效缓解愈伤组织褐化。此配方是减少龙脑樟组培苗生长过程玻化、褐化现象发生的关键因素之一。 

本发明的改良MS培养基配方与常规的MS配方的用量对比如表1所示： 

表1：常规MS培养基各成分用量与本发明经过改良的MS各成分用量对比表 

成分>MS用量>改良MS用量(mg/L) >硝酸钾>1900>1900>硝酸铵>1650>800>硫酸镁﹒7H₂O>370>370>氯化钙﹒2H₂O>440>437>硝酸钙﹒4H₂O>_>200>磷酸二氢钾>170>170>硫酸亚铁﹒7H₂O>27.8>27.8>乙二胺四乙酸二钠>37.3>37.3>碘化钾>0.83>_>氯化钴﹒6H₂O>0.025>_>硼酸>6.2>10>硫酸锰﹒H₂O>16.5>25>硫酸锌﹒7H₂O>8.6>10>硫酸铜﹒5H₂O>0.025>0.025>钼酸钠﹒2H₂O>0.25>0.25>肌醇>100>100>抗坏血酸>—>10>甘氨酸>2>2>烟酸>0.5>5>盐酸吡哆辛>0.5>0.5>盐酸硫胺素>0.1>0.5>