富民枳微滴玻璃化法超低温保存方法

摘要

本发明提供了富民枳微滴玻璃化超低温保存方法。包括材料获取，加载处理，植物玻璃化溶液处理，超低温保存，解冻和卸载处理，恢复培养步骤。本发明方法简便易行、稳定性高、高效可靠；超低温保存茎尖解冻后再生率达到90％以上；超低温保存茎尖再生的植株生根状况良好，移栽后生长状态稳定。

说明书

技术领域：

本发明属于植物细胞工程学领域。具体涉及富民枳微滴玻璃化法超低温保存方法。

背景技术：

富民枳为芸香科枳属植物。芸香科枳属包括两种，即枳和富民枳。富民枳于1984年由丁素琴等在云南富民县进行柑桔资源调查时发现和描述。富民枳的野生种群基本灭绝。少数富民枳的植株在昆明植物园，富民县农业局茶桑果站种植园得到迁地保护。另外，在美国National Plant Germplasm System中收集和保存了两份(http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/taxon.pl？411341)。富民枳是柑橘育种的重要种质资源。一项对富民枳生物学特性的研究表明富民枳在做砧木嫁接柑橘时结果早，株型矮化，是柑橘优良的矮化砧。富民枳在其原生地以果实入药，被当地人称为“止咳树”。在一项专利中提到，富民枳的抽提物具有抗氧化和抗炎的作用(http://ip.com/patfam/en/39396292)。富民枳除现有的活体植株保存以外，可以通过种子保存而在种质资源库长期保存。此类植物由于种子表现为顽拗性或者中间性，一般以活体植株的形式在资源圃或植物园保存。富民枳的种子储藏类型没有见研究报到。参考其它citrus属和Poncirus属植物的情况，富民枳的种子可能也表现为中间性的(intermediate)储藏类型。因而无法进行脱水和在常规种子库(15％含水量，-20℃)中保存。

超低温保存一般是指使用液氮(-196℃)或液氮蒸汽保存生物材料的技术和方法。在液氮温度下，细胞中所有的生化反应都被暂时停止，从而可以使细胞在理论上进行无限期保存。超低温保存技术广泛应用于微生物、动物和植物种质资源的长期保存。超低温保存是生产非正常性种子的植物和需要以营养体繁殖的农作物长期安全保存的唯一途径，是珍稀濒危植物长期保存的重要手段。由于柑橘产业的重要性，对于Citrus属和Poncirus属的超低温保存研究很多。超低温保存的外植体主要包括胚轴和茎尖。由于富民枳现有植株数量很少，果实和种子数量非常有限。离体茎尖是目前进行富民枳超低温保存的唯一可行的外植体类型。

迄今，未见有富民枳微滴玻璃化法超低温保存方法的报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种富民枳微滴玻璃化法超低温保存方法。包括富民枳试管苗的节段培养、离体茎尖的超低温保存和再生试管苗的生根和移栽技术。本发明为富民枳种质资源的长期安全保存提供了一种简单、高效和稳定的方法。

为实现本发明的上述目的，本发明采用如下的技术方案：

富民枳微滴玻璃化超低温保存方法，包括下述步骤：

(1)材料获取，取富民枳茎尖，通过茎尖培养获得试管苗，然后通过节段培养获得扩繁富民枳试管苗，在解剖镜下进行茎尖切割；在解剖镜下切割茎尖；

(2)加载处理，将茎尖在加载溶液中，25℃下处理20分钟；

(3)植物微滴玻璃化处理，将茎尖转入预冷的PVS2溶液，在冰上处理20-40分钟；

(4)超低温保存，将经过PVS2处理的茎尖转移到无菌铝箔条上并插入液氮，待降温过程完成后转入冻存管并进入液氮罐保存；

(5)解冻和卸载处理，将铝箔条从液氮中移出并直接转入卸载溶液，在25℃下处理20分钟；

(6)恢复培养，将解冻后的茎尖转移到恢复培养基上进行恢复培养。

如所述的富民枳微滴玻璃化超低温保存方法，其中所述节段培养是将试管苗节段接种在添加0.5mgL^-1BA、0.2mgL^-1IBA和30gL^-1蔗糖的WPM培养基上进行扩繁，在以上培养基中富民枳节段在4周内形成试管苗。

如所述的富民枳微滴玻璃化超低温保存方法，其中所述茎尖切割是选高度5cm的富民枳试管苗，在体视显微镜下切割长度为2mm的茎尖，转入添加30gL-1蔗糖的WPM培养基上待用。

如所述的富民枳微滴玻璃化超低温保存方法，其中所述加载处理和微滴玻璃化是将茎尖转入冻存管中加入加载溶液，在25℃下处理20分钟，所述加载溶液的组成为WPM基础培养基添加2M甘油和0.4M蔗糖，在加载溶液处理结束以后，用冰上预冷的PVS2溶液替换加载溶液，并在冰上处理20-40分钟，PVS2溶液的组成是WPM基础培养基添加30％(w/v)甘油、15％(w/v)乙二醇、15％(w/v)DMSO和0.4M蔗糖。

如所述的富民枳微滴玻璃化超低温保存方法，其中所述超低温保存是在PVS2处理结束前1分钟，将茎尖和一滴PVS2溶液转到无菌铝箔条上，在PVS2处理结束后，将铝箔条直接插入液氮，待不再有气泡产生时，将铝箔条转入放置在液氮中的冻存管，并保持在液氮中30分钟。

如所述的富民枳微滴玻璃化超低温保存方法，其中所述解冻和卸载处理是将铝箔条从液氮中取出，快速插入卸载溶液里，在25℃下处理20分钟，卸载溶液的组成是WPM基础培养基添加1.2M蔗糖。

如所述的富民枳微滴玻璃化超低温保存方法，其中所述恢复培养是将在卸载溶液处理结束后，将茎尖转入恢复培养基，恢复培养基的组成为WPM基础培养基添加30gL-1蔗糖、1.0mgL^-1BA和3gL^–1Phytagel，恢复培养的前7天为暗培养。

与传统的Citrus属和Poncirus属植物玻璃化超低温保存方法相比，本发明的技术方案中超低温保存茎尖的存活率和再生率更高，解冻后的茎尖在恢复培养阶段生长更为迅速。在保持高再生率的情况下，去掉了传统方法中必须的预培养阶段。本发明方法简便易行、稳定性高、高效可靠；超低温保存茎尖解冻后再生率达到90％以上；超低温保存茎尖再生的植株生根状况良好，移栽后生长状态稳定。

附图说明：

图1PVS2处理时间对超低温保存富民枳茎尖再生率的影响。

图2玻璃化途径中PVS2处理时间对存活率和再生率的影响。

图3富民枳超低温保存茎尖的再生情况。(a1)微滴玻璃化超低温保存茎尖存活但不再生长(标尺为0.5mm)。(a2-3)微滴玻璃化超低温保存茎尖再生为试管苗(标尺为0.5mm)。(b1)玻璃化超低温保存茎尖存活但不再生长(标尺为0.5mm)。(b2-3)

玻璃化超低温保存茎尖再生为试管苗(标尺为0.5mm)。

图4IBA浓度对富民枳试管苗生根的影响。将长度约3厘米的富民枳试管苗转入添加添加30gL^-1蔗糖、3gL^-1活性炭、3g l^–1Phytagel和不同浓度IBA的WPM培养基中进行生根诱导，生根培养6周时统计生根率。

图5超低温保存富民枳茎尖再生和移栽情况。a由超低温保存茎尖重新建立起来的试管苗(标尺为1cm)。b试管苗生根情况(标尺为1cm)。C生根植株移栽后1年(标尺为2cm)。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

实施例1：

1、试管苗的节段培养。

取富民枳(Poncirus polyandra)茎尖，通过茎尖培养获得试管苗，然后将试管苗节段接种在添加0.5mgL^-1BA、0.2mgL^-1IBA和30gL^-1蔗糖的WPM培养基上进行扩繁。在以上培养基中富民枳节段可在4周内形成试管苗。

2、茎尖切割。

选取高度约5cm的富民枳试管苗，在体视显微镜下切割长度约为2mm的茎尖，转入添加30gL^-1蔗糖的WPM培养基上待用。

3、微滴玻璃化超低温保存。

将10个茎尖转入冻存管中加入1mL loading solution溶液，在25℃下处理20分钟。Loading solution溶液的组成为WPM基础培养基添加2M甘油和0.4M蔗糖。在loadingsolution溶液处理结束以后，用1mL冰上预冷的PVS2溶液替换loading solution溶液，并在冰上处理一定的时间。PVS2溶液的组成是WPM基础培养基添加30％(w/v)甘油、15％(w/v)乙二醇、15％(w/v)DMSO和0.4M蔗糖。在PVS2处理结束前1分钟，将茎尖和一滴PVS2溶液(15μL)转到一个8×25mm的无菌铝箔条上。在PVS2处理结束后，用一把细镊子将铝箔条直接插入液氮，待不再有气泡产生时，将铝箔条转入放置在液氮中的冻存管，并保持在液氮中至少30分钟。解冻时，将铝箔条从液氮中取出，并快速插入6厘米直径培养皿中的10mL unloading solution溶液里，并在25℃下处理20分钟。Unloading solution溶液的组成是WPM基础培养基添加1.2M蔗糖。在unloadingsolution溶液处理结束后，将茎尖转入恢复培养基。恢复培养基的组成为WPM基础培养基添加30gL^-1蔗糖、1.0mgL^-1BA和3gL^–1Phytagel。恢复培养的前7天为暗培养。

本发明中，测试了微滴玻璃化途径中PVS2在0℃分别处理20、30和40分钟对超低温保存茎尖的存活率和再生率的影响。结果表明20、30和40分钟PVS2对应的存活率分别为88.3％、90.0％和83.3％(图1)；再生率分别为75.0％、78.3％和73.3％(图1)。可见超低温保存茎尖在20-40分钟PVS2处理下都保持了非常高的存活率。

图1显示了PVS2处理时间对超低温保存富民枳茎尖再生率的影响。茎尖切割后在WPM半固体培养基上过夜。将装载处理后的茎尖转入PVS2在冰上处理一定的时间，PVS2处理结束后将茎尖转入铝箔条进行液氮处理，解冻时直接将铝箔天转入卸载溶液进行处理。

4、微滴玻璃化法和玻璃化法的比较。

玻璃化法的处理程序如下所述。将10个茎尖转入冻存管中加入1mL loadingsolution溶液，在25℃下处理20分钟。Loading solution溶液的组成为WPM基础培养基添加2M甘油和0.4M蔗糖。在loading solution溶液处理结束以后，用1mL冰上预冷的PVS2溶液替换loading solution溶液，并在冰上处理30分钟。PVS2溶液的组成是WPM基础培养基添加30％(w/v)甘油、15％(w/v)乙二醇、15％(w/v)DMSO和0.4M蔗糖。在PVS2处理结束后，将冻存管直接插入液氮保存。解冻时，将冻存管从液氮中取出，在40℃水浴中解冻2分钟。解冻完成后，用移液枪移掉冻存管中的PVS2并加入1mLunloading solution溶液，并在25℃下处理20分钟。Unloading solution溶液的组成是WPM基础培养基添加1.2M蔗糖。在unloading solution溶液处理结束后，将茎尖转入恢复培养基。恢复培养基的组成为WPM基础培养基添加30gL^-1蔗糖、1.0mgL^-1BA和3gL^–1Phytagel。恢复培养的前7天为暗培养。

本发明测试了玻璃化途径(vitrificaiton using Cryotubes)中PVS2在0℃分别处理20、30和40分钟对超低温保存茎尖的存活率和再生率的影响。结果表明20、30和40分钟PVS2对应的存活率分别为91.7％、96％和91.7％(图2)；再生率分别为50.0％、54.0％和50.0％(图2)。在玻璃化超低温保存中，PVS2处理时间在20-40分钟之间时茎尖的存活率都高于90％，且相互之间没有显著差异。茎尖的再生率在20-40分钟之间也没有显著差异，但都显著性的低于存活率。可见在玻璃化超低温保存中，有接近50％的茎尖能够存活下来，但不能再生为试管苗。这一结果与微滴玻璃化的结果差异较大。

图2显示了玻璃化途径中PVS2处理时间对存活率和再生率的影响的。茎尖切割后在WPM半固体培养基上过夜。对渗透保护后的茎尖转入PVS2在0℃下处理30分钟。PVS2

处理结束后，茎尖分别按照玻璃化程序进行液氮处理和解冻。

5、富民枳超低温保存茎尖存活和再生情况

液氮处理以后，存活的茎尖表现为顶端分生组织存活和生长；茎尖其他部分细胞死亡并变为白色(图3)。茎尖存活以恢复培养6周时茎尖表现绿色为标志。茎尖再生以恢复培养6周时茎尖表现明显伸长为标志。微滴玻璃化和玻璃化超低温保存的茎尖都有存活但不再生长的情况(图3a1，b1)。超低温保存茎尖再生的植株经过继代培养可以重新建立试管苗培养体系(图5a)。

6、富民枳试管苗生根情况。

从继代4周的试管苗中选取生长良好，长度约3厘米的试管苗(in vitro shoots)用于生根实验。将其基部用手术刀切割，保持切面整齐；转入不同的培养基中进行生根实验。每个组培瓶中添加50mL生根培养基，转入2株试管苗。生根培养基：1.添加30gL^-1蔗糖、3gL^-1活性炭和3gL^–1Phytagel的WPM培养基。2.添加30gL^-1蔗糖、3gL^-1活性炭、0.5mgL^-1IBA和3gL^–1Phytagel的WPM培养基。3.添加30gL^-1蔗糖、3gL^-1活性炭、5.0mgL^-1IBA和3gL^–1Phytagel的WPM培养基。

不同浓度IBA的生根培养基对试管苗生根的影响。所有的生根培养基都添加了活性炭。在不添加IBA的基础培养基中，大约7.5％的试管苗生根(图4)。当在生根培养基中添加了2.46μM IBA时，生根率上升到了15％。而当IBA浓度进一步提高到24.6μM时，生根率进一步提高到了37.5％(图4)。试管苗在通常情况下产生1-2条根(图5b)，随在生根培养基的时间推移，生根率逐渐增高。生根植株在高度约为10cm可以移栽入温室环境，移栽成功率接近100％。移栽入温室的植株生长正常，旺盛(图5c)。