一种基于磁珠富集法高通量开发基因组SSR标记的方法

摘要

本发明公开了一种基于磁珠富集法高通量开发基因组SSR标记的方法，包括下列步骤：（1）提取目标基因组DNA；（2）将所得基因组DNA随机片段化；（3）构建基因组随机片段化DNA文库；（4）对DNA文库进行扩增；（5）利用生物素标记的SSR探针与文库中的目的片段杂交；（6）对含有SSR序列的DNA文库片段进行链霉亲和素磁珠富集；（7）对富集的DNA文库片段扩增并纯化；（8）将纯化的DNA片段进行乳液PCR扩增及测序；（9）在所得的序列中搜索含有SSR位点的序列。该方法降低了文库构建难度，缩短了实验周期，提高了测序通量，降低了测序成本，可作为高通量开发各物种SSR标记的有效方法广泛应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于磁珠富集法高通量开发基因组SSR标记的方法。

背景技术

SSR(Simple Sequence Repeat)，又叫微卫星DNA（Microsatellite DNA）。重复单元很短，只有1～6bp；重复数可变，总长度为几十个bp，分布于整个基因组的不同位置上。微卫星DNA两端的序列一般是相对比较保守的单拷贝序列，据此可设计特异引物进行PCR扩增。根据串联重复数不同，便可以揭示微卫星DNA长度的多态性，具长度多态性的片段可用作分子标记。微卫星标记因具多态性丰富、重复性好、共显性等优点广泛应用于遗传图谱构建、种群遗传学、指纹分析、系统发育等研究领域。

虽然SSR标记有诸多的优点，但影响SSR使用的一个关键点是SSR标记的开发。只有开发了一定量的多态性SSR标记，才能对某一物种进行SSR标记的分析。特别是对没有参考基因组序列的物种（即该物种的基因组序列没有被全基因组测序），SSR标记的开发和利用就更困难。

SSR标记开发的方法有很多，之前的传统方法主要有：（1）从公共数据库或相关文献中查找微卫星位点；（2）参考近缘物种SSR位点的PCR引物进行交叉扩增；（3）从基因组DNA(gDNA)、cDNA、EST中筛选微卫星位点。第一种方法极大地受限于数据库中的数据量，不适于未知基因组序列的物种；第二种方法效果不稳定，具有较高的风险性和局限性；第三种方法又可分为多种策略，包括经典方法、富集法和省略筛库法。对于测序很少的物种，基本上只能选择第三种方法。

在从gDNA、cDNA、EST中筛选微卫星位点的传统方法中，富集法基于SSR探针和基因组DNA文库的液相杂交，提高了分离效率，是大规模筛选微卫星位点较为常用的一种方法。基于第一代测序平台的磁珠富集法需要经过富含微卫星的基因组文库构建、微卫星位点分离、阳性克隆测序、PCR引物设计、引物预扩增和多态性检测等一系列步骤，流程繁琐，成本高，通量也不足。

高通量测序技术是近年来快速发展的一项DNA序列分析技术，该技术相对于第一代测序技术，最大的优势是通量高，相对成本低，速度快。其中Roche GS FLX+测序平台的读长最长，较适合SSR标记开发中的特异性引物设计。该平台基于焦磷酸测序原理，焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并通过光学系统生成一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数据成正比，然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。

高通量测序技术的应用是SSR标记开发的一大趋势，应用方式包括：（1）直接的基因组测序；（2）转录组测序。直接的基因组测序会得到大量的无用序列，特别是对大型的或复杂的基因组来说，成本高，效率低；转录组测序仅能获得编码区的SSR标记信息，而编码区的SSR类型往往具有三和六碱基重复的偏好性。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题是针对目前开发SSR标记的方法流程繁琐，成本高，效率较低的缺陷，提供一种基于磁珠富集法高通量开发基因组SSR标记的方法。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种基于磁珠富集法高通量开发基因组SSR标记的方法，所述方法包括下列步骤：

（1）提取目标基因组DNA；

（2）将步骤（1）所得基因组DNA随机片段化；

（3）构建基因组随机片段化DNA文库；

（4）以步骤（3）所得DNA文库为模板，利用前引物，其序列如SEQID NO:1所示，和后引物，其序列如SEQ ID NO:2所示，进行PCR扩增，获得文库扩增片段；

（5）利用生物素标记的SSR探针与文库中含有SSR位点的目的片段进行杂交；

（6）利用链霉亲和素包被的磁珠对文库中结合了生物素标记的SSR探针的目的片段进行富集；

（7）以步骤（6）所得的目的片段为模板，利用前引物，其序列如SEQID NO:1所示，和后引物，其序列如SEQ ID NO:2所示，进行PCR扩增，纯化PCR扩增所得的DNA片段；

（8）以步骤（7）所得的纯化的DNA片段为模板进行乳液PCR扩增，将乳液PCR扩增所得序列进行测序；

（9）在步骤（8）所得的序列中搜索含有SSR位点序列。

其中步骤（1）为提取目标基因组DNA。所述目标基因组DNA提取的方法为常规提取方法。较佳地为利用各种市售试剂盒或其他常规技术提取目标基因组DNA。所述目标基因组DNA较佳地是动物基因组DNA、植物基因组DNA或微生物基因组DNA；所述目标基因组DNA包括具有参考基因组序列的基因组DNA，或者不具有参考基因组序列的基因组DNA。

其中所述参考基因组是本领域常规概念，是指物种的基因组序列被全基因组测序。具有参考基因组序列的物种基因组DNA是指该物种已经被全基因测序；不具有参考基因组序列的基因组DNA是指该物种没有被全基因测序。

其中步骤（2）为将步骤（1）所得基因组DNA随机片段化。所述基因组DNA随机片段化的方法为本领域常规方法，较佳地为高压氮气法或利用片段化仪器进行片段化。其中所述的片段化仪器较佳地为：Bioruptor Plus或Covaris等片段化仪器，所述片段化仪器均市售可得。

所述高压氮气法较佳地包括以下步骤：取约4μg的基因组DNA（100μlgDNA），在600μl的片段化体系（gDNA：100μl；片段化缓冲液：500μl，片段化缓冲液的组分为：50%甘油，5mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH8.0）中，施加0.3～0.4MPa的高压氮气，持续50～70s。

所述片段化仪器较佳地为：Bioruptor Plus随机片段化仪器，所述随机片段化仪器的参数设置较佳地为：Cycle conditions(On/Off times in sec.):30/90，循环数：3～6cycles。随机片段化仪器较佳地为：Covaris M220microTUBE AFAFiber Screw-Cap；该仪器参数设置较佳地为：Peak Incident Power(W):50,Duty Factor:20%,Cycles per Burst:200,Treatment Time(s):25～50s,Temperature(℃):20,Sample volume(μl):50。

随机片段化结束后较佳地还包括对片段化产物进行纯化，所述纯化步骤较佳地为利用各种市售试剂盒对所得片段化产物进行纯化。所述Kit较佳地为Axygen AxyPrepTM PCR Clean-up Kit。利用所述试剂盒纯化片段的具体方法可参阅该试剂盒的使用说明书。对所有纯化的片段化产物进行1.5%（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳，120V，持续20min，切下400～700bp范围的片段，使用Axygen AxyPrep DNA Gel Extraction Kit对目的片段进行胶回收纯化，使用20～25μl的洗脱液进行洗脱，具体方法可参阅该试剂盒的使用说明书。

其中步骤（3）为构建基因组随机片段化DNA文库。所述构建基因组随机片段化DNA文库的方法为常规方法。较佳地为利用市售试剂盒进行文库构建。所述构建方法优选地为使用Roche GS Rapid Library Prep Kit（试剂盒）利用上述纯化所得的片段化产物进行基因组随机片段化DNA文库构建，具体方法可参阅罗氏公司该试剂盒最新的使用手册：《Rapid Library PreparationMethod Manual_XL+_May2011》。

其中步骤（4）为以步骤（3）所得DNA文库为模板，利用前引物，其序列如SEQ ID NO:1所示，和后引物，其序列如SEQ ID NO:2所示，进行PCR扩增，获得文库扩增片段。所述PCR扩增的反应体系较佳地为：基因组DNA文库：8～15ng；10×PCR缓冲液：5μl；dNTP（2.5mM ea.）：4μl；前引物(10μM)：2μl；后引物(10μM):2μl；DNA聚合酶：0.5μl；加水至50μl。

其中所述前引物为LibL-Primer-A：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACGACT-3’，其序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；

其中所述后引物为LibL-Primer-B：5’-CCTATCCCCTGTGTGCCTTG-3’，其序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

所述前引物和后引物的制备方法为本领域常规方法，较佳地为全序列合成即得。

其中PCR扩增反应程序较佳地为：开启热盖至100℃；（1）94℃变性4min；（2）94℃变性30s，（3）55～62℃退火45s，（4）72℃延伸1min，步骤（2）～（4）进行12～20个循环；（5）72℃延伸8min。PCR扩增结束后，较佳地还包括：取3μl扩增产物进行1%（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳，EB染色，检测产物分布范围。

其中步骤（5）为利用生物素标记的SSR探针与文库中含有SSR片段的目的片段进行杂交。其中所述SSR探针为常规探针，所述SSR探针较佳地为5’端修饰有生物素标记的SSR探针。当检测的目的基因组为黄盖鲽（Limanda aspera）基因组时，所述生物素标记的SSR探针较佳地为5’端修饰有生物素标记且序列如下的探针的混合物，所述的序列分别为序列表中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示，即分别为(AC)12、（AG）12、（AAT）8、（AGG）8、（AGC）8、（AGAT）6和（ACAG）6。

所述SSR探针优选地为5’端修饰有生物素标记且序列如下的探针的混合物，所述的序列分别为序列表中SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示，即分别为(AG)10、(AC)10、(AAC)8、(AGG)8、(ACG)8、(AAG)8、(ACAT)6和(ATCT)6。所述探针组合考虑到了各物种分类中各SSR位点类型的丰度情况和各SSR探针之间的兼容性，而且在磁珠富集体系和条件较优化状态下该探针组合性能表现更佳。所述SSR探针的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为人工合成制备。所述SSR探针合适用于灵长类、其它哺乳类、啮齿类、鱼类、其它脊椎动物、节肢动物、陆生植物以及真菌等广泛的物种。

所述SSR探针与文库中的目的片段杂交的方法为常规方法，所述杂交的反应体系：扩增后的基因组DNA文库50μl（100～500ng）；等摩尔混合的SSR探针（SSR探针的浓度为10μM）10μl；20×SSC30μl；10%SDS1μl，杂交体系总体积为100μl。所得杂交体系在PCR仪上运行杂交程序，该杂交程序较佳地包括以下步骤：开启热盖并预热至100℃，95℃变性10min，然后每个循环下降2℃，每个循环孵育1min，降至58℃过夜。1×SSC的配方为：柠檬酸钠15mM，NaCl150mM，pH7.0。

其中步骤（6）为利用链霉亲和素包被的磁珠对文库中结合了生物素标记的SSR探针的目的片段进行富集。所述磁珠富集的方法为本领域常规方法，所述磁珠为包被有链霉亲和素的磁珠。

所述磁珠富集的方法较佳地包括以下步骤：

（1）准备磁珠：漩涡混匀包被有链霉亲和素的磁珠，立即吸取100μl，使用200μl6×SSC with0.1%SDS洗涤三次，每次1～2min。每次洗涤完毕使用磁力架固定磁珠，吸除洗涤液，至磁珠光滑。洗涤完成后加入100μl6×SSC with0.1%SDS，重悬浮备用。

（2）SSR文库富集：将100μl杂交产物从PCR仪中取出，加入准备好的100μl磁珠，轻轻吹打混匀。室温（20～25℃，下同）孵育30min，每5min轻轻混匀一次，防止磁珠落至管底。

（3）SSR文库清洗：先将富集体系放至磁力架上，室温静置2～3min，吸除上清。使用200μl6×SSC with0.1%SDS洗涤三次，每次室温孵育10min，磁力架上静置2min。然后使用200μl58℃预热的3×SSC with0.1%SDS洗涤三次，每次58℃孵育15min，磁力架上静置2min。然后再使用200μl6×SSC with0.1%SDS洗涤三次，每次室温孵育10min，磁力架上静置2min。最后使用200μl超纯水或0.1×TE洗涤两次，直接混匀后在磁力架上静置2min，吸除上清。（4）SSR富集文库洗脱：向清洗后的磁珠中加入25μl洗脱缓冲液（10mM Tris-HCl,pH8.5），混匀后95℃变性5min，立即放置在磁力架上2min至溶液澄清，吸出上清留用，重复一次，将两次洗脱液混合，得到共约50μl的洗脱产物。

其中步骤（7）为以步骤（6）所得的目的片段为模板，利用前引物，其序列如SEQ ID NO:1所示，和后引物，其序列如SEQ ID NO:2所示，进行PCR扩增，纯化PCR扩增所得的DNA片段。

其中所述PCR扩增的体系为本领域常规PCR体系，所述PCR扩增的体系较佳地包括：基因组DNA文库10～15ng；10×PCR缓冲液5μl；dNTP（2.5mM ea.）4μl；前引物（10μM）2μl；后引物（10μM）2μl；DNA聚合酶0.5μl；补充超纯水至50μl。其中所述前引物的序列如SEQ ID NO:1所示，后引物的序列如SEQ ID NO:2所示。

其中所述PCR扩增的反应程序较佳地为：首先开启热盖并预热至100℃，（1）94℃变性4min，（2）94℃变性30s，（3）58℃退火45s，（4）72℃延伸1min，其中步骤（2）～（4）共进行18个循环，(5)72℃延伸8min。

其中所述PCR产物纯化为本领域常规纯化方法，所述纯化较佳地为利用磁珠进行纯化。所述磁珠纯化的方法较佳地包括以下步骤：向PCR反应产物中加入90μl混匀的AMPure XP Beads（购自贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司），混匀后室温孵育15min，磁力架上静置5min后吸除上清。然后使用200μl新鲜配制的80%乙醇清洗两次，每次室温孵育30s，磁力架上静置至澄清，吸除上清。最后静置在磁力架上15min至磁珠干燥，加入25μl洗脱缓冲液（10mM Tris-HCl，pH8.5）洗脱两次，所得洗脱体系共约50μl。

其中步骤（8）为以步骤（7）所得的纯化的DNA片段为模板进行乳液PCR扩增，将乳液PCR扩增所得序列进行测序。其中所述乳液PCR扩增的方法较佳地可参阅Roche公司相关操作手册《emPCR Amp-Lib L SV MethodManual_XL+_May2011》。其中所述测序为本领域常规测序技术，较佳地为利用各种商用测序仪进行测序，所述测序仪优选地为：Roche GS FLX+测序仪。

其中步骤（9）为在步骤（8）所得的序列中搜索含有SSR位点序列。所述在搜索含有SSR位点序列的方法为本领域常规方法，较佳地为利用各种市售软件搜索SSR位点，更佳地为使用MISA软件在测序片段中搜索SSR位点，该软件的参数较佳地为：definition(unit_size,min_repeats):1-102-63-54-55-56-5；interruptions(max_difference_between_2_SSRs):100。

较佳地，该方法还包括在所得含有SSR位点序列的侧翼序列上设计特异性PCR扩增引物的步骤。其中所述特异性PCR扩增引物的设计方法为常规方法，较佳地为利用市售软件设计PCR扩增引物，更佳地为使用Primer3软件进行引物设计。使用该软件时，设计参数较佳地为：引物设计区域为重复序列前一个碱基之前和后五个碱基之后，扩增产物长度在100～400bp之间，其余采用默认设置。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：经过本发明所述磁珠富集方法处理过的文库，其中不含重复序列位点的文库片段大大下降，从而使重复序列位点的检测效率大大提高。在此基础上，结合高通量测序平台的文库构建方式和测序通量，大幅降低了文库构建难度，降低了实验成本，缩短了实验周期，同时由于了测序通量大幅提高，从而降低了测序成本。本方法应用范围广泛，可作为高通量开发多种物种SSR位点标记的有效方法进行应用。

附图说明

图1为基因组DNA文库扩增产物示意图。其中“1”为样本，“C”为阴性对照，“M”为ladder marker，条带大小从下到上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。

图2为SSR富集文库扩增产物示意图。其中“1”为样本，“C”为阴性对照，“M”为ladder marker，条带大小从下到上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1500bp。

图3为一种GT重复序列。该序列为完美型SSR序列，重复次数共12次，微卫星序列位于测序片段的315bp～318bp之间。

图4为一种GT重复序列的测序峰形。其中测序序列总长为459bp，重复序列位于315bp～338bp之间，测序信号正常，序列质量好。

图5为一种GT重复序列及引物设计序列。该序列中微卫星序列位于测序片段的315bp～338bp之间，在它两侧可以设计特异性PCR扩增引物，其中前引物位于150bp～169bp之间，后引物位于428bp～447bp之间，PCR扩增产物长度为298bp。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1一种基于磁珠富集法高通量开发黄盖鲽SSR标记的方法

1、实验材料：黄盖鲽（Limanda aspera）肝脏组织样品4份。取3条黄盖鲽，处死后取肝脏组织，保存于无水乙醇溶液中，室温存放。其中混合样1份，为三个黄盖鲽个体的等量的肝脏组织混合物，该物种无参考基因组序列。

2、基因组DNA提取：基因组DNA的提取使用天根TIANamp GenomicDNA Kit试剂盒，具体提取方法参照该试剂盒的使用说明书操作。

3、基因组DNA随机片段化：具体方法包括以下步骤：

（1）利用高压氮气对基因组DNA进行片段化：取4μg的基因组DNA，加入TE缓冲液至100μl，加入片段化杯中，然后加入500μl的片段化溶液（50%甘油，5mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH8.0），吹打混匀，安装好片段化装置。连接高压氮气瓶和片段化装置，施加0.35MPa的压力，持续50s。

（2）收集片段化装置中的溶液，使用Axygen AxyPrep PCR Clean-up Kit对片段化溶液进行过柱纯化，具体纯化方法参照该试剂盒的使用说明书。使用20μl的洗脱液洗脱两次。

（3）对片段化DNA洗脱液进行1.5%（质量体积比）的琼脂糖凝胶电泳，120V电泳20min。切下400～700bp范围的目的片段，使用AxygenAxyPrep DNA Gel Extraction Kit对目的片段进行胶回收纯化，具体纯化方法参照该试剂盒的使用说明书。使用20μl的洗脱液洗脱。

4、构建基因组随机片段化DNA文库：吸取16μl片段化洗脱液，使用Roche GS Rapid Library Prep Kit进行基因组DNA文库构建，具体文库构建方法参照该试剂盒的使用手册——《Rapid Library Preparation MethodManual_XL+_May2011》。

5、基因组DNA文库的扩增及检测，具体方法为：

（1）配制PCR体系，如表1所示：

表1PCR体系

成分体积基因组DNA文库10ng10×PCR缓冲液5μldNTP（2.5mM ea.）4μl前引物（10μM）2μl后引物（10μM）2μlDNA聚合酶0.5μl补充超纯水至50μl

其中所述前引物为LibL-Primer-A：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACGACT-3’，其序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；

其中所述后引物为LibL-Primer-B：5’-CCTATCCCCTGTGTGCCTTG-3’，其序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

（2）运行PCR程序：开启热盖至100℃；（1）94℃变性4min；（2）94℃变性30s，（3）58℃退火45s，（4）72℃延伸1min，步骤（2）～（4）进行18个循环；（5）72℃延伸8min。

（3）从文库的扩增产物中取3μl进行1%（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳，EB染色，检测产物分布范围，结果如图1所示。

6、DNA文库与SSR探针杂交，具体方法为：

（1）首先合成7种5’端修饰有生物素标记的SSR探针，所述生物素标记的SSR探针的序列分别为序列表中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示，即为(AC)12、（AG）12、（AAT）8、（AGG）8、（AGC）8、（AGAT）6和（ACAG）6（由上海桑尼生物科技有限公司合成），将上述7种SSR探针溶解后稀释至10μM等体积混合。

（2）配制探针杂交反应体系，如表2所示：

表2探针杂交反应体系

成分体积基因组DNA文库200ngSSR探针（10μM）10μl20×SSC30μl10%SDS1μl补充超纯水至100μl

（3）运行杂交反应程序：开启PCR仪热盖至100℃，首先95℃变性10min，然后每个循环下降2℃，并孵育1min，下降至58℃保持过夜。

7、SSR文库富集、清洗、洗脱，具体方法为：

（1）准备磁珠：漩涡混匀包被有链霉亲和素的磁珠（购自上海英骏生物技术有限公司），立即吸取100μl，使用200μl6×SSC with0.1%SDS洗涤三次，每次2min。每次洗涤完毕使用磁力架固定磁珠，吸除洗涤液，至磁珠光滑，洗涤完成后加入100μl6×SSC with0.1%SDS，重悬浮备用。

（2）SSR文库富集：将100μl杂交产物从PCR仪中取出，加入准备好的100μl磁珠，轻轻吹打混匀。室温（20～25℃，下同）孵育30min，每5min轻轻混匀一次，防止磁珠落至管底。

（3）SSR文库清洗：先将富集体系放至磁力架上，室温静置2min，吸除上清。使用200μl6×SSC with0.1%SDS洗涤三次，每次室温孵育10min，磁力架上静置2min。然后使用200μl58℃预热的3×SSC with0.1%SDS洗涤三次，每次58℃孵育15min，磁力架上静置2min。然后再使用200μl6×SSC with0.1%SDS洗涤三次，每次室温孵育10min，磁力架上静置2min。最后使用200μl超纯水或0.1×TE洗涤两次，直接混匀后在磁力架上静置2min，吸除上清。

（4）SSR富集文库洗脱：向清洗后的磁珠中加入25μl洗脱缓冲液（10mM Tris-HCl,pH8.5），混匀后95℃变性5min，立即放置在磁力架上2min至溶液澄清，吸出上清留用，重复一次，将两次洗脱液混合，得到共约50μl的洗脱产物。

8、SSR富集文库扩增及纯化，具体方法为：

（1）配制PCR反应体系，如表3所示：

表3PCR反应体系

成分体积SSR富集文库10μl10×PCR缓冲液5μldNTP（2.5mM ea.）4μl前引物（10μM）2μl后引物（10μM）2μl

DNA聚合酶0.5μl补充超纯水至50μl

其中所述前引物的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；其中所述后引物的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

（2）运行PCR反应程序：首先开启热盖并预热至100℃，（1）94℃变性4min，（2）94℃变性30s，（3）58℃退火45s，（4）72℃延伸1min，其中步骤（2）～（4）共进行18个循环，(5)72℃延伸8min。

（3）PCR产物纯化：向PCR反应产物中加入90μl混匀的AMPure XPBeads（购自贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司），混匀后室温孵育15min，磁力架上静置5min后吸除上清。然后使用200μl新鲜配制的80%乙醇清洗两次，每次室温孵育30s，磁力架上静置至澄清，吸除上清。最后静置在磁力架上15min至磁珠干燥，加入25μl洗脱缓冲液（10mM Tris-HCl，pH8.5）洗脱两次，共约50μl。

（4）从文库的扩增产物中取3μl进行1%（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳，EB染色，检测产物分布范围，结果如图2所示。

9、SSR富集文库乳液PCR扩增及Roche GS FLX+测序仪上机测序。具体方法参阅Roche公司相关操作手册——《emPCR Amp-Lib L SV MethodManual_XL+_May2011》和《GS FLX+_Sequencing_Method Manual_XL+Kit_May2011》。

10、使用MISA软件在测序序列中搜索SSR位点，使用参数为：definition(unit_size,min_repeats):1-102-63-54-55-56-5；interruptions(max_difference_between_2_SSRs):100。测序序列产出和SSR位点搜索结果如表4所示：

表4测序序列产出和SSR位点搜索结果

样品readsNo.SSRSSR开发效率114,0565,45338.79%

238,95721,20254.42%328,79910,34935.94%429,80114,48248.60%

其中“reads”为各样品测序所得到的片段数，“No.SSR”为各样品含有SSR位点的测序片段数。图3显示了一个理想的微卫星位点的测序序列，图4显示了其测序峰形图。

从上述表格中可以看出，采用本发明所述方法可在单次实验中开发出非常多的SSR位点数，而且文库构建流程快、技术难度低、实验成本低，测序数据通量高，SSR检测效率高达35～55%，在SSR相关的多种遗传学应用中，对各物种全基因组范围内SSR标记的高通量开发起到了巨大的促进作用。

11、使用Primer3软件对检测到的含有SSR位点的序列进行特异性引物设计，使用参数为：引物设计区域为重复序列前一个碱基之前和后五个碱基之后，扩增产物长度在100～400bp之间，其余采用默认设置。可设计引物序列的SSR位点数如表5所示：

表5可设计引物序列的SSR位点数

图5显示了其中一个理想的微卫星位点的测序序列及其引物设计位点。

从上述表格中可以看出，采用本发明所述方法开发的SSR位点数量不仅多，而且序列长度长，利于特异性PCR扩增引物的设计，可设计引物的SSR位点比例高达40～60%。

对比实施例1

按照实施例1所述方法分别提取蓝鸭（Hymenolaimus malacorhynchos），吸虫（Maritrema novaezealandensis），沙螽（Motuweta isolata）和蜗牛（Powelliphanta augusta）四种样品的基因组DNA，并按照实施例1所述方法对提取的基因组DNA构建随机片段化DNA文库，然后直接按照实施例1所述方法进行emPCR扩增和Roche GS FLX测序仪上机测序（省略了其中的文库扩增，标记生物素的SSR探针杂交、磁珠富集、清洗、洗脱等步骤），所得测序序列产出和SSR位点搜索结果如表6所示：

表6测序序列产出和SSR位点搜索结果

样品readsNo.SSRSSR开发效率蓝鸭（Hymenolaimus malacorhynchos）17,2152311.34%吸虫（Maritrema novaezealandensis）31,1206762.17%沙螽（Motuweta isolata）52,0594720.91%蜗牛（Powelliphanta augusta）35,1962,5417.22%

上述四种述样品的制备方法，请参考文献：Abdelkrim J,Robertson B C,Stanton J A L,et al.Fast,cost-effective development of species-specificmicrosatellite markers by genomic sequencing[J].Biotechniques,2009,46(3):185.

其中“reads”为各样品测序所得到的片段数，“No.SSR”为各样品含有SSR位点的测序片段数。

从表6的数据可以看出，该方法由于没有对基因组随机片段文库中具有SSR位点的核酸片段进行富集，因此测序序列中包含大量的非SSR序列（不含SSR位点的序列），SSR标记开发效率极低。

对比实施例2

对比实施例2采用的方法是对高地棉花品种(Gossypium hirsutum L)植株幼嫩叶片提取基因组DNA，使用高压氮气将10μg的基因组DNA随机片段化至450-900bp范围，然后进行乙醇沉淀纯化和重新溶解（上述样品的制备方法，请参考文献：Connell J P,Pammi S,Iqbal M J,et al.A high through-putprocedure for capturing microsatellites from complex plant genomes[J].PlantMolecular Biology Reporter,1998,16(4):341-349.）。使用T4DNA聚合酶和Klenow片段室温孵育30min将DNA末端补平，再使用T4连接酶16℃过夜连接双链接头，构建基因组DNA文库。然后将100ngDNA文库和6种生物素标记的SSR探针（所述探针的序列分别是：(GA)₂₀、(CA)₂₀、(AGA)₁₅、(ACA)₁₅、(CAT)₁₅和(CTA)₁₅）混合，95℃变性5min，每分钟2℃降至60℃，保持1h，将SSR探针与含有SSR位点的文库片段杂交。利用能与SSR探针上的生物素标记特异结合的链霉亲和素磁珠和磁力架进行SSR杂交片段的富集、清洗和洗脱等步骤，具体实验方法请见实施例1。再然后使用与双链接头相对应的通用引物对洗脱下来的单链DNA进行PCR扩增。之后选择质粒载体pCRII(Invitrogen)，使用EcoR I限制性内切酶切割，利用连接酶16℃过夜将DNA片段与质粒载体的两粘性末端特异性连接，再使用电穿孔技术将质粒载体转化到大肠杆菌中。制备YT-琼脂培养基（YT-琼脂培养基的配方为：蛋白胨10.0g酵母膏5.0g，葡萄糖1.0g，NaCl5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml，pH7.0），并加入氨苄青霉Amp（0.1%体积百分比）、X-GAL（终浓度40μg/ml）和IPTG（终浓度0.5mmol/L），将大肠杆菌于37℃过夜培养，挑取转化成功的白色菌落。再进行继代培养，从中挑取一些白色菌落进行质粒抽提和纯化，对其中的DNA插入片段进行PCR扩增，利用一代Sanger测序平台ABI377上机测序，对测序结果进行处理并搜索SSR位点序列。本案例中，构建SSR富集文库耗时大约一周，而对文库进行筛选并利用测序仪测序则需要一个月才能完成。检测结果表明，在严格筛选之后，开发出的SSR富集文库中SSR位点含量超过20%，共测序和鉴定了超过500个SSR位点。

该方法与本发明所述方法相比有以下几大缺点：1）实验流程长，操作繁琐，具体表现为：在SSR富集之后要进行重组文库构建、阳性克隆筛选与鉴定、质粒抽提与纯化等步骤，流程繁琐，而且在样本质量较差情况下阳性克隆检出比例低，操作复杂；2）反应时间较长：该实验流程相比本发明所述方法至少要多出3～5天的时间；3）该方法测序的通量较低：第一代Sanger测序平台每次运行只能同时检测96个阳性克隆，即产生96条测序序列，而本发明基于二代测序平台GS Roche FLX+，一次运行可测序达百万条序列，测序通量有了极大的提高，因而SSR标记检测效率也大大提升；4）实验成本较高：由于增加了重组文库构建、质粒抽提等步骤对每个克隆增加了约100元的成本，每个克隆的测序成本约2元。而本发明所述方法由于通量极大的提高，每个克隆的序列成本不足0.2元。此外，需要特别说明的是，本方法具有较高的物种普适性，不同SSR探针类型的准确设计与使用不影响该方法开发SSR标记的高效性。

此外，还应理解，本领域技术人员在此方法流程中做部分的改动或改进，都应落入本申请所附权利要求书所限定的范围。