一种提高淡水贝类背角无齿蚌钩介幼虫存活率的方法

摘要

本发明涉及一种提高淡水贝类背角无齿蚌钩介幼虫存活率的方法，属于生物监测环境技术领域。其步骤包括：（1）背角无齿蚌钩介幼虫的获取；（2）背角无齿蚌钩介幼虫培养的存活检验和标准培养溶液的获取；（3）背角无齿蚌钩介幼虫受铜胁迫和添加钙离子提高其存活率的对比验证。本发明以标准培养溶液浓度组24小时成活率大于90%、铜+钙浓度组存活率大于铜浓度组存活率10%以上为有效依据，不仅提供了一种保证背角无齿蚌钩介幼虫正常情况下24小时存活率大于90%的标准培养溶液，还找到了减轻背角无齿蚌钩介幼虫受铜胁迫，提高其生存率的有效方法，为下一步开展淡水生物指示贝种-背角无齿蚌稚蚌、幼蚌等毒理学研究和其它淡水贝类的幼体保护提供了有力支持。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高淡水贝类背角无齿蚌钩介幼虫成活率的方法，具体地说就是运用一系列调节水化学指标的方式，最大限度减小环境中影响淡水生物指示贝种-背角无齿蚌（Anodonta woodiana）钩介幼虫成活率低的不利因素，提高其成活率，为下一步开展淡水生物指示贝种-背角无齿蚌稚蚌、幼蚌等毒理学研究提供有力支持，属于生物监测环境技术领域。

背景技术

近年来我国内陆渔业水域重金属污染现象日趋明显，防治重金属污染是我国加强环境保护的重点任务之一。2011年《中国渔业生态环境状况公报》指出我国长江、黄河中下游部分渔业水域Cu的超标较为严重，最高值已超过渔业水质标准（0.01 mg/L）的8倍，严重威胁水产生物特别是其幼体阶段的生长发育。研究表明，淡水贝类是水质优劣的灵敏指示物，尤其是钩介幼虫、稚蚌等早期生活史阶段对Cu的毒害极为敏感，其对铜的耐受性甚至低于国家渔业水质标准，在自然水域的钩介幼虫受Cu污染致死的危险充分存在。针对自然水域贝类种群数量日趋减少的趋势，特别是钩介幼虫阶段对环境污染敏感度较高，死亡率较大的现状，希望通过调节水化学指标的方式，开发出一种提高淡水贝类钩介幼虫存活率的方法，在最大可能保护钩介幼虫生存的同时，了解淡水贝类早期生活史阶段个体在污染监测和预警方面应用的价值，为今后的毒理学研究提供参考。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高背角无齿蚌钩介幼虫存活率的方法，通过调节其生活水环境中关键理化指标的含量，克服钩介幼虫对环境变化和污染物的低耐受性，保护钩介幼虫的生存，为后续的稚蚌、幼蚌等的毒理学研究和其它淡水贝类幼蚌的生存保护提供借鉴和参考。

按照本发明提供的技术方案，一种提高淡水贝类背角无齿蚌钩介幼虫存活率的方法，包括以下步骤：

（1）背角无齿蚌钩介幼虫的获取：

选取钩介幼虫发育成熟的背角无齿蚌母蚌2只，分别放入质量浓度为0-0.01%人工海水盐的去离子水培养溶液中暂养4-6小时；在此过程中，室内温度保持在20-25℃； 

用吸满加有质量浓度为0-0.01%人工海水盐的去离子水溶液注射器插入背角无齿蚌母蚌外鳃，缓慢冲洗蚌的外鳃；用加有150mL质量浓度为0-0.01%人工海水盐的去离子水溶液的玻璃培养皿收集冲洗流出的钩介幼虫，保留钩介幼虫周围的粘性分泌物，静置0.5h后检查钩介幼虫0h的成活率，保证成活率高于90%；

（2）背角无齿蚌钩介幼虫培养的存活检验和标准培养溶液的获取：

将步骤（1）所得的钩介幼虫在光照培养箱中进行培养；培养温度为25℃，光照条件模拟自然光；采用装有质量浓度为0-0.01%人工海水盐的去离子水、每个浓度梯度三个平行、每个玻璃培养皿加有150mL的培养液，其浓度梯度按2倍递增并用2mm直径塑料吸管吸出的900-1100个钩介幼虫进行培养，保留钩介幼虫周围的粘性分泌物，培养24小时后检查成活率，成活率大于90 %的浓度组确认为标准培养溶液；

以上述步骤（2）确定的成活率比值大于90%的浓度组溶液为标准培养溶液, 用步骤（1）的方法获取所需的钩介幼虫并置于标准培养溶液中待用；

（3）背角无齿蚌钩介幼虫受铜胁迫和添加钙离子提高其存活率的对比：

以质量浓度为0.01%的人工海水盐的去离子水溶液为标准溶液，配置1-3组150mL标准实验溶液中添有0.02-0.08 mg/L 铜浓度梯度溶液，再另外配置1-5组150mL标准实验溶液中同时添有0.02-0.08 mg/L铜浓度梯度，和15-170 mg/L钙离子浓度梯度的对比溶液，以及设置一个仅配有150 mL标准实验溶液的正常组；所述浓度梯度按2倍递增；每个浓度梯度均有三个平行、每个玻璃培养皿加有用吸管吸出的900-1100个钩介幼虫，以步骤（2）的光照条件进行对比实验；

培养24小时后用步骤（1）的方法检查成活率，先检查正常组，再检查铜浓度组和铜+钙浓度组，以验证加钙后对减弱铜胁迫，提高存活率的有效性，以此确定最佳的标准培养溶液中添加的铜离子和钙离子的量。

步骤（1）中钩介幼虫发育成熟的背角无齿蚌母蚌指的是外鳃成黄褐色的健康的3-4龄、壳长90-110mm的背角无齿蚌母蚌。

步骤（1）所述去离子水培养溶液中含有0-0.01%人工海水盐，具体如下：去离子水中离子浓度背景值为Cu: 0.000 mg/L, Na: 0.002 mg/L, Ca: 0.015 mg/L, Cl: 5 mg/L，在其中加入0-0.1 g人工海水盐。

步骤（1）和（2）中检测钩介幼虫成活率的方法：用2mm直径塑料吸管吸取90-110只钩介幼虫放入盛有20mL加有质量浓度为0-0.01%人工海水盐的去离子水的培养皿中，于解剖镜下记录钩介幼虫的总数和闭壳的数量，然后加一滴NaCl饱和溶液，并在1 min内记录开壳和闭壳钩介幼虫的数量；加入NaCl饱和溶液后，闭壳的钩介幼虫定义为存活的个体，而加入NaCl溶液前闭壳及加入NaCl溶液后开壳的钩介幼虫定义为死亡个体。

步骤（2）和步骤（3）中的光照条件模拟自然光，即16小时600 Lux白炽灯、8小时暗室培养。

步骤（2）中所述标准培养溶液为质量浓度为0.01%的人工海水盐的去离子水溶液。

步骤（3）所述标准培养溶液为质量浓度为0.01%的人工海水盐的去离子水溶液中添加15-170 mg/L钙离子、0.02-0.08 mg/L铜离子。

本发明的有益效果：本发明首先提出了标准实验用水的概念，添加一定浓度的人工海水盐于去离子水中，同时保留钩介幼虫周围的粘性分泌物，不仅能保证钩介幼虫24小时90%以上的存活率，更能有效保证毒理学实验的正常进行；针对部分渔业水域Cu严重超标的现状，用增加水中钙离子浓度的简单方式保护钩介幼虫的生存，可操作性强，不仅为进一步开展淡水生物指示贝种-背角无齿蚌稚蚌、幼蚌等的保护和毒理学研究提供有力支持，亦为其它淡水贝类幼体的生存保护提供借鉴。

具体实施方式

以下实施例中的人工海水盐商品名SEALIFE，由日本Marinetech有限公司生产；所述光照培养箱为PGX-350A型光照培养箱，由中国无锡的沃信仪器有限公司提供。

下面本发明将结合实施例作进一步描述：

实施例1

根据本发明提供的“一种提高淡水贝类背角无齿蚌钩介幼虫存活率的方法”，优选钩介幼虫24小时存活率90%以上的标准培养溶液，步骤如下：

1、背角无齿蚌钩介幼虫的实验室获取

选取钩介幼虫发育成熟即外鳃成黄褐色的健康的3-4龄、壳长90-110mm的背角无齿蚌母蚌2只，带回实验室分别放入0和0.01 % 盐度即1 L去离子水(各主要离子浓度背景值为Cu: 0.000 mg/L, Na: 0.002 mg/L, Ca: 0.015 mg/L, Cl: 5 mg/L )加有0和0.1 g人工海水盐(商品名：SEALIFE，日本Marinetech有限公司生产）的容器中暂养4-6小时，室内温度保持在20-25°C。用吸满加有0和0.01 % 浓度人工海水盐的去离子水注射器插入蚌外鳃，缓慢冲洗蚌的外鳃。用加有150 mL 0和0.01 % 浓度人工海水盐的去离子水的玻璃培养皿收集冲洗流出的钩介幼虫，保留钩介幼虫周围的粘性分泌物，静置0.5 h后检查钩介幼虫0 h的成活率。

检测成活率的方法：用2 mm直径塑料吸管吸取90-110只钩介幼虫放入盛有20 ml加有0和0.01 % 浓度人工海水盐的去离子水的培养皿中，于解剖镜下记录钩介幼虫的总数和闭壳的数量，然后加一滴NaCl饱和溶液，并在1 min内记录开壳和闭壳钩介幼虫的数量。加入NaCl溶液后，闭壳的钩介幼虫定义为存活的个体，而加入NaCl溶液前闭壳及加入NaCl溶液后开壳的钩介幼虫定义为死亡个体；0 h时0和0.01 % 盐度组的成活率分别为96%和97%。

2、背角无齿蚌钩介幼虫实验室培养的存活检验和标准培养溶液的获取

通过步骤（1）于玻璃培养皿收集的成活率大于90%的钩介幼虫方可进行实验室培养。实验室培养在PGX-350A型光照培养箱（沃信仪器有限公司，中国无锡）中进行，培养温度为：25℃，24小时光照条件模拟自然光，即16小时600 Lux白炽灯、8小时暗室培养，共设计装有0和0.01%两个对比浓度梯度人工海水盐的去离子水、每个浓度梯度三个平行、每个玻璃培养皿加有150 mL实验溶液并用2mm直径塑料吸管吸出的900-1100个钩介幼虫进行培养，保留钩介幼虫周围的粘性分泌物，培养24小时后用步骤（1）的方法检查成活率。

培养24小时后 0盐度组三个平行的成活率分别为：84.4%，80.9%，72.3%，平均成活率为79.2 %；0.01 %盐度组三个平行的成活率分别为：97.1%，96%，93%，平均成活率为95%。

说明添加一定浓度的人工海水盐于去离子水中，同时保留钩介幼虫周围的粘性分泌物，能够明显提高背角无齿蚌钩介幼虫的成活率。

实施例2

根据本发明提供的“一种提高淡水贝类背角无齿蚌钩介幼虫存活率的方法”， 利用标准培养溶液进行钩介幼虫受铜胁迫和添加固定浓度钙离子提高其存活率的对比验证，步骤如下：

1、背角无齿蚌钩介幼虫的实验室获取

选取钩介幼虫发育成熟即外鳃成黄褐色的健康的3-4龄、壳长90-110mm的背角无齿蚌母蚌1只，带回实验室放入0.01 % 盐度即1 L去离子水(各主要离子浓度背景值为Cu: 0.000 mg/L, Na: 0.002 mg/L, Ca: 0.015 mg/L, Cl: 5 mg/L )加有0.1 g人工海水盐(商品名：SEALIFE，日本Marinetech有限公司生产）的容器中暂养4-6小时，室内温度保持在20-25°C。用吸满加有0.01 % 浓度人工海水盐的去离子水注射器插入蚌外鳃，缓慢冲洗蚌的外鳃。用加有150 mL 0.01 % 浓度人工海水盐的去离子水的玻璃培养皿收集冲洗流出的钩介幼虫，保留钩介幼虫周围的粘性分泌物，静置0.5 h后检查钩介幼虫0 h的成活率。

检测成活率的方法：用2 mm直径塑料吸管吸取90-110只钩介幼虫放入盛有20 ml加有0.01 % 浓度人工海水盐的去离子水的培养皿中，于解剖镜下记录钩介幼虫的总数和闭壳的数量，然后加一滴NaCl饱和溶液，并在1 min内记录开壳和闭壳钩介幼虫的数量。加入NaCl溶液后，闭壳的钩介幼虫定义为存活的个体，而加入NaCl溶液前闭壳及加入NaCl溶液后开壳的钩介幼虫定义为死亡个体。0 h时的成活率为96%。

 2、背角无齿蚌钩介幼虫受铜胁迫和添加固定浓度钙离子提高其存活率的对比验证

按照铜浓度梯度为0.02，0.04和0.08mg/L，铜+钙浓度梯度为0.02+170，0.04+170 和0.08 +170 mg/L于玻璃培养皿中配置150 ml溶液，溶液组成为铜（铜+钙）+标准培养溶液 (去离子水+ 0.01 % 人工海水盐)，再配置一个仅装有150 ml标准培养溶液的正常组，每个浓度梯度均有三个平行，每个玻璃培养皿中吸入用2 mm直径塑料吸管吸出的900-1100个钩介幼虫，放入PGX-350A型光照培养箱（沃信仪器有限公司，中国无锡）中模拟24小时自然光照条件，即16小时600 Lux白炽灯、8小时暗室进行24小时对比培养，培养箱温度设为25℃。

24小时后用步骤（1）的方法检查成活率，正常组三个平行的成活率分别为：96%，96%，95%，平均成活率为96%；0.02 mg/L铜组三个平行的成活率分别为：57%，62%，55%，平均成活率为58%，而0.02 mg/L铜+170 mg/L钙组三个平行的成活率分别为：83%，76%，76%，平均成活率为78%，成活率提高了20%；0.04 mg/L铜组三个平行的成活率分别为：32%，40%，29%，平均成活率为34%，而0.04 mg/L铜+170 mg/L钙组三个平行的成活率分别为：54%，76%，56%，平均成活率为62%，成活率提高了28%； 0.08 mg/L铜组三个平行的成活率分别为：24%，33%，31%，平均成活率为29%，而0.08 mg/L铜+170 mg/L钙组三个平行的成活率分别为：54%，39%，54%，平均成活率为49%，成活率提高了20%。

说明即使Cu超标浓度达到2011年《中国渔业生态环境状况公报》报道的内陆重要渔业水域的最高值，添加一定浓度钙离子仍然可使背角无齿蚌钩介幼虫的存活率平均提高20%。

实施例3

根据本发明提供的“一种提高淡水贝类背角无齿蚌钩介幼虫存活率的方法”， 利用标准培养溶液进行钩介幼虫受铜胁迫和添加不同浓度钙离子提高其存活率的对比验证，步骤如下：

1、背角无齿蚌钩介幼虫的实验室获取

选取钩介幼虫发育成熟即外鳃成黄褐色的健康的3-4龄、壳长90-110mm的背角无齿蚌母蚌1只，带回实验室放入0.01 % 盐度即1 L去离子水(各主要离子浓度背景值为Cu: 0.000 mg/L, Na: 0.002 mg/L, Ca: 0.015 mg/L, Cl: 5 mg/L )加有0.1 g人工海水盐(商品名：SEALIFE，日本Marinetech有限公司生产）的容器中暂养4-6小时，室内温度保持在20-25°C。用吸满加有0.01 % 浓度人工海水盐的去离子水注射器插入蚌外鳃，缓慢冲洗蚌的外鳃。用加有150 mL 0.01 % 浓度人工海水盐的去离子水的玻璃培养皿收集冲洗流出的钩介幼虫，保留钩介幼虫周围的粘性分泌物，静置0.5 h后检查钩介幼虫0 h的成活率。

检测成活率的方法：用2 mm直径塑料吸管吸取90-110只钩介幼虫放入盛有20 ml加有0.01 % 浓度人工海水盐的去离子水的培养皿中，于解剖镜下记录钩介幼虫的总数和闭壳的数量，然后加一滴NaCl饱和溶液，并在1 min内记录开壳和闭壳钩介幼虫的数量。加入NaCl溶液后，闭壳的钩介幼虫定义为存活的个体，而加入NaCl溶液前闭壳及加入NaCl溶液后开壳的钩介幼虫定义为死亡个体。0 h时的成活率为99%。

 2、背角无齿蚌钩介幼虫受铜胁迫和添加固定浓度钙离子提高其存活率的对比验证

按照铜浓度为0.03 mg/L，铜+钙浓度梯度为0.03+15，0.03+30，0.03+60，0.03 +120 mg/L和0.03 +240 mg/L于玻璃培养皿中配置150 ml溶液，溶液组成为铜（铜+钙）+标准培养溶液 (去离子水+ 0.01 % 人工海水盐)，再配置一个仅装有150 ml标准培养溶液的正常组，每个浓度梯度均有三个平行，每个玻璃培养皿中吸入用2 mm直径塑料吸管吸出的900-1100个钩介幼虫，放入PGX-350A型光照培养箱（沃信仪器有限公司，中国无锡）中模拟24小时自然光照条件，即16小时600 Lux白炽灯、8小时暗室进行24小时对比培养，培养箱温度设为25℃。24小时后用步骤（1）的方法检查成活率。

正常组三个平行的成活率分别为：93%，96%，92%，平均成活率为94%；0.03 mg/L铜组三个平行的成活率分别为：72%，69%，58%，平均成活率为66%；与此相对照，0.03 mg/L铜+15 mg/L钙组三个平行的成活率分别为：89%，80%，85%，平均成活率为85%，成活率提高了19%；0.03 mg/L铜+30 mg/L钙组三个平行的成活率分别为：80%，75%，78%，平均成活率为78%，成活率提高了12%； 0.03 mg/L铜+60 mg/L钙组三个平行的成活率分别为：87%，85%，89%，平均成活率为87%，成活率提高了21%；0.03 mg/L铜+120 mg/L钙组三个平行的成活率分别为：82%，80%，92%，平均成活率为85%，成活率提高了19%。结合实例二，说明在Cu超标的水体中，添加15-170 mg/L浓度的钙可以减轻钩介幼虫受铜胁迫的强度，明显提高存活率。

综合上述，本发明不仅提供了一种保证背角无齿蚌钩介幼虫正常情况下24小时存活率大于90%的标准培养溶液，还找到了减轻背角无齿蚌钩介幼虫受铜胁迫，提高其生存率的有效方法，为下一步开展淡水生物指示贝种-背角无齿蚌稚蚌、幼蚌等毒理学研究和其它淡水贝类的幼体保护提供了有力支持。