一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方法

摘要

本发明一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方法，属于生物工程技术领域。该方法包括下述步骤：(1)对大豆种子进行表面灭菌处理；(2)将经过灭菌的大豆种子在无菌条件下移至YMA琼脂表面皿中催芽，待种子发芽后，移至灭菌的浓度为30％的无氮Rigaud-Puppo营养液进行培养，在培养第12天收集大豆根系分泌物，即得高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物。本发明具有确定了无氮Rigaud-Puppo营养液最佳浓度为30％，收集时间为12d时所收集的大豆根系分泌物能显著提高大豆根瘤菌结瘤基因的表达，进而体现其高效促进大豆竞争结瘤效果的优点。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆 根系分泌物的制备方法。

背景技术

根瘤菌-豆科植物构成的共生体系是自然界生物固氮效率最高的体系，其固氮量占整 个生物固氮量的3/4，成为农业生产的主要氮源，大豆与大豆根瘤菌的共生体系是生物固 氮中的典型代表。利用大豆根瘤菌接种豆科植物以提高其固氮效率已有100多年历史， 作为一项节本增效的农业措施，在许多国家得到了广泛的应用。然而，作为大豆起源地 的中国，大豆根瘤菌的接种面积仅占大豆种植面积的2％左右，远低于美国、巴西、阿根 廷等主要大豆主产国70％以上接种率。其主要原因是具有高效匹配和竞争结瘤能力的优 良菌株的筛选和根瘤菌竞争结瘤过程中与豆科植物根系分泌物间信号识别的“分子对话” 研究滞后于生产，导致接种根瘤菌的竞争结瘤能力差，土壤中存在大量的土著根瘤菌群， 干扰和降低了接种根瘤菌的占瘤率，致使接种根瘤菌剂的增产效果不显著，制约了其应 用和发展。

大豆根瘤菌的竞争结瘤是以大豆宿主与大豆根瘤菌菌株之间可扩散复杂信号分子的 特异识别为基础的复杂调控过程，这一过程受到一系列由大豆品种和根瘤菌菌株双方提 供的信号分子的严格调控。研究表明，根瘤菌的竞争结瘤决于菌株自身产生的不同NodD 调节蛋白与豆科植物根系不同分泌物组分的早期相互作用，大豆苷元和染料木黄酮是一 类能影响根瘤菌结瘤的黄酮物质。为了响应豆科植物分泌的类黄酮类物质，根瘤菌可以 合成宿主特异的(LCOs)作为精确外源结瘤因子，从而启动根瘤菌和宿主的早期识别。特 异结瘤因子的物质骨架都是由普通的nod基因(nodABC)合成，而后进一步被其他nod基 因所编码的蛋白质所修饰。根瘤菌中NodD(原核生物LysR家族转录调节因子)通过与宿 主特异的类黄酮进行相互识别，能够激活结瘤基因的表达。

大豆根瘤菌nod基因的表达受到宿主大豆根系分泌物的影响，很多研究大多采用类 黄酮类纯物质、大豆苷元或大豆幼苗根系提取物来代替大豆根系分泌物，但实际上，豆 科植物根系分泌物组分复杂，截至目前，已发现豆科植物根系分泌物中的类黄酮种类已 超过4000种，某些单一的纯组分或几种纯组分的复合虽然能够影响大豆根瘤菌nod基因 的表达，但研究结果有一定的片面性；大豆苷元及大豆幼苗根系提取物能够影响根瘤菌 竞争结瘤，但在其制备过程中，还包含了大豆根系组织，并不能真正模拟大豆根系中的 实际环境；除此之外，目前已报导的大豆根系分泌物的收集大都集中在收集装置的设计 上，对培养条件和收集时间上存在较大的主观性，其组分和浓度未知，有效性也无法评 价，在一定程度上制约了研究的深入。因此，建立大豆根系分泌物的制备方法，并对其 有效性进行评价，对研究大豆根系分泌物与根瘤菌的互作、大豆根瘤菌nod基因表达的 分子调控机制以及高效菌株的筛选具有重要的理论价值和实践意义。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制 备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方法，包括下述步骤：

(1)、对大豆种子先用蒸馏水洗净，放入95％的酒精中浸泡1min，转至5％次氯酸纳 溶液浸泡5min进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗至少10次；

(2)、将经过表面灭菌的大豆种子在无菌条件下移至YMA琼脂表面皿中催芽，待种子 发芽后，移至灭菌的浓度为30％的无氮Rigaud-Puppo营养液进行培养，在培养第12天 收集大豆根系分泌物，即得高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物；其中培养 条件为：白天30℃、16h光照，光照强度为960μmol·m^-2·s^-1；夜间15℃、8h黑暗。

上述技术方案所述的一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方 法，其中，YMA培养基组成为：甘露糖醇10.0g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、NaCl 0.1g、酵母粉0.8g、CaCO₃1.5g、浓度为0.5％的刚果红5ml、琼脂15-20g、H₂O 1000ml； YMA培养基pH值为6.8～7.0。

上述技术方案所述的一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方 法，其中，无氮Rigaud-Puppo营养液中的成分为：CoCl₂·6H₂O 0.004mg/L、H₃BO₃2.86 mg/L、MnCl₂·4H₂O 1.81mg/L、ZnSO₄·7H₂O 0.22mg/L、CuSO₄·SH₂O 0.102mg/L、 Na₂MoO₄·2H₂O 0.122mg/L、MgSO₄·7H₂O 492.96mg/L、K₂HPO₄174.18mg/L、KH₂PO₄136.886mg/L、CaCl₂·2H₂O 110.99mg/L和FeC₆H₅O₇·5H₂O 5.62mg/L。

本发明具有以下有益效果：

本发明确定了当无氮Rigaud-Puppo营养液最佳浓度为30％，收集时间为12d时所收 集的大豆根系分泌物能显著提高大豆根瘤菌结瘤基因的表达，具体表现为：当无氮 Rigaud-Puppo营养液浓度为30％所收集的大豆根系分泌物，能使菌株Bradyrhizobium  diazoefficiens USDA 110中nodC和nodD1基因分别较对照上调5.48倍和4.95倍，使菌株 Bradyrhizobium japonicum USDA 6中nodC和nodD1基因分别较对照上调1.92倍和3.04 倍；当收集时间为12d时所收集的大豆根系分泌物，能使菌株B.diazoefficiens USDA 110 中nodC和nodD1基因分别较对照上调22.41倍和8.27倍，使菌株B.japonicum USDA 6 中nodC和nodD1基因分别较对照上调11.86倍和7.33倍。最终通过nod基因的上调实 现高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的效果。

附图说明：

1、图1为大豆根系分泌物收集玻璃容器；

2、图2为大豆根系分泌物收集玻璃容器置于光照培养箱内生长照片；

3、图3为不同营养液浓度条件下收集的根系分泌物对菌株B.diazoefficiens USDA 110 中nod基因的诱导表达差异；

4、图4为不同营养液浓度条件下收集的根系分泌物对菌株B.japonicum USDA 6中 nod基因的诱导表达差异；

5、图5为不同时期收集的根系分泌物对菌株B.diazoefficiens USDA 110中nod基因 的诱导表达差异；

6、图6为不同时期收集的根系分泌物对菌株B.japonicum USDA 6中nod基因的诱 导表达差异。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种高效促进大豆 根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方法作进一步的说明。

实施例1：一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物的制备方法：

(1)、对大豆种子先用蒸馏水洗净，放入95％的酒精中浸泡1min，转至5％次氯酸纳 溶液浸泡5min进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗至少10次；

(2)、将经过表面灭菌的大豆种子在无菌条件下移至YMA琼脂表面皿中催芽，待种 子发芽后，移至灭菌的浓度为30％的无氮Rigaud-Puppo营养液进行培养，在培养第12 天收集大豆根系分泌物，即得高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系分泌物；其中培 养条件为：白天30℃、16h光照，光照强度为960μmol·m^-2·s^-1；夜间15℃、8h黑暗。

以下通过具体试验例来说明本发明的一种高效促进大豆根瘤菌竞争结瘤的大豆根系 分泌物的制备方法所具有的有益效果：

试验例1：大豆根系分泌物的制备方法中营养液浓度和收集时间的确定：

一、大豆根系分泌物的收集：

1、大豆根系分泌物收集装置：

选择圆柱形容器，在距离容器底部一定高度处放置带孔圆板用于支撑大豆植株，容 器用无菌过滤透气封口膜密封。上述容器及支撑圆板材质不限，但须耐121℃，30min高 温灭菌。本发明选用的是圆柱形玻璃容器(φ150mm×250mm)，在距离容器底部约1/4高 度设置聚丙烯圆板，匀布设圆孔(φ8mm)约80个，装置如图1所示。容器内置500ml不 同浓度无氮Rigaud-Puppo营养液，成分见表1，121℃，30min灭菌待用。

表1 无氮Rigaud-Puppo营养液成分

2、种子处理：

大豆选用中国黄淮海地区的主栽大豆品种中黄13。对大豆种子进行表面消毒，将种子 先用蒸馏水洗净，放入95％的酒精中浸泡1min，转至5％次氯酸纳溶液浸泡5min进行 表面灭菌，然后用无菌水冲洗至少10次。

3、接种及培养：

将经过表面灭菌的大豆种子在无菌条件下移至YMA(成分见表2)琼脂表面皿中催芽， 待种子发芽后，挑选无污染的豆芽，以无菌操作的方法移至灭菌的上述大豆根系分泌物 收集装置中进行培养，以未播种大豆的装置为对照，每个处理设置3个重复。处理间和 处理内均采用随机排列法。植株和空白对照被随机置于光照温培养箱中培养(白天 30℃、16h光照；夜间15℃、8h黑暗)。光线由距离盒顶部30cm处的日光灯提供，该 日光灯功率为36瓦(240伏)，光照强度为960μmol.m^-2.s^-1。培养照片如图2所示。

表2 YMA培养基配方

4、根系分泌物收集

培养过程中，按规定时间取样。各处理分别取样5ml。用TY培养基对根系分泌物和 空白液体进行无菌检查。根系分泌物通过无菌过滤除菌(0.22μM过滤器，微孔)后，置于 -20℃保存备用。

二、大豆根系分泌物有效性评价：

1、nod基因的诱导，反转录PCR和实时荧光定量PCR：

选取根系分泌物对nod基因表达的影响作为其促进结瘤效果的评价指标。nod基因选 用nodC(序列如SEQ ID No.1所示)和nodD1(序列如SEQ ID No.2所示)。选用两株易于 获得的商业菌株——日本高效固氮根瘤菌B.diazoefficiens USDA 110和B.japonicum  USDA 6验证制备的大豆根系分泌物的有效性；

(a)、使用SV Total RNA Isolation System(Promega，Madison，WI，USA)试剂盒分别提 取B.diazoefficiens USDA 110和B.japonicum USDA 6的总RNA；

(b)、用DNase I(RNase-free，Promega)处理；

(c)、使用Protoscript First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(New England Biolabs， Ipswich，MA，USA)以1.0μg RNA为模板进行反转录PCR；

反转录PCR反应体系(20μl)：

5xprimerScript RT Master Mix：  4.0μl

Total RNA：                     1.0μg

RNase Free H₂O：                up to 20μl

反转录反应条件：

37℃   15min

85℃   5sec

4℃    5min

(d)、根据B.Diazoefficiens USDA110的基因组序列，使用Oligo 6.0和Primer 5设 计实时定量PCR的引物。为了保证PCR产物特异性，设计引物长度一般在18-25bp， 还要使上下游引物的退火温度接近。用琼脂糖电泳和Real-time PCR中的熔解曲线来验证 反应的特异性。反应引物如表3所示，实时荧光定量PCR的使用按照7500型荧光定量 PCR(Applied Biosystems)的操作步骤，所选择的每个基因的扩增作三个重复，利用16S rDNA作为内参基因。

荧光实时定量PCR反应体系(20μl)：

荧光实时定量PCR反应条件：

表3 实时定量PCR引物序列及扩增片断长度

2、无氮Rigaud-Puppo营养液浓度的确定：

按照“大豆根系分泌物的收集”中方法所述。设置营养液浓度分别为0％，30％， 60％，100％，培养6d后收集根系分泌物。将100ml处理后的根系分泌物与100ml菌体 混合，置于30℃恒温摇床中，180rpm摇瓶诱导。1h后收集菌体。按“大豆根系分泌物 有效性评价”中方法所述对分泌物进行有效性评价，结果见图3和图4。通过比较nod(nodC 和nodD1)基因的最大表达量，确定无氮Rigaud-Puppo营养液最佳浓度为30％。

3、根系分泌物的收集时间的确定：

按照“大豆根系分泌物的收集”中方法所述。根系分泌物收集装置中营养液浓度为 30％，分别在第0d，6d，12d，16d收集根系分泌物。将100ml处理后的根系分泌物与100ml 菌体混合，置于30℃恒温摇床中，180rpm摇瓶诱导。1h后收集菌体。按“大豆根系分 泌物有效性评价”中方法所述对分泌物进行有效性评价，结果见图5和图6。通过比较 nod(nodC和nodD1)基因的最大表达量，确定根系分泌物的最佳收集时间为12d。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制， 凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技 术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时， 凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍 属于本发明的技术方案的范围内。