适合细胞生长的多孔径组织工程脚手架的制造方法

摘要

本发明公开适合细胞生长的多孔径组织工程脚手架的制造方法。该方法包括如下步骤：(1)明胶0.3-1.0g，透明质酸钠1-8mg和软骨素6-磷酸钠盐0.05-0.5g溶解在5-10ml双蒸水中而构成溶液；(2)用1-5mL0.5-5％EDC加入所述溶液中混匀；(3)在室温放置1-10min，然后在-20℃冷冻0.5-3h，-60～80℃再冷冻0.5-3小时；(4)最后经-50℃冻干机条件下冻干48-96小时以得到初步脚手架；(5)将所述初步脚手架和5-20mL0.1-0.5％EDC在室温作用12-48h；(6)再在-20～-30℃的条件冷冻12-48h后，最后，在-50℃冻干机条件下冻干48-96小时，制得脚手架，这样的脚手架具有多孔海绵状空间立体架构、组织相容性好、质地好、孔径大小合适以及吸水度好、没有毒性也可完全降解。

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程学的医学组织工程材料，尤其涉及适合细胞生长的多 孔径组织工程脚手架的制造方法。

背景技术

组织工程是指应用生命科学与工程学的原理和方法来设计、组建、维护人 体细胞和组织的生长，以恢复受损伤的组织或器官的功能。组织工程的发展为 组织或器官的修复与再建提供了可能。组织工程材料也日益受到人们的重视， 研究开发具有良好组织相容性的材料已成为组织工程发展的基石。

以前的脚手架一般为颗粒状、线条状结构，不具有多孔空间立体架构。另 外，以前的脚手架常常组织相容性不好、或具有一定毒性、或不能可完全降解， 或吸水度不好。这样的脚手架不利于细胞在一定的空间架构中生长，不利于它 们的相互作用和细胞通讯，不符合在机体中实际的自然状态。

发明内容

本发明解决的问题是现有的脚手架不具有多孔空间立体结构的问题。

为解决上述问题，本发明提供一种适合细胞生长的多孔径组织工程脚手架 的制造方法，该方法包括如下步骤：(1)、明胶0.3-1.0g，透明质酸钠1-8mg和 软骨素6-磷酸钠盐0.05-0.5g溶解在5-10ml双蒸水中而构成溶液；(2)、用1-5mL 0.5-5％EDC加入所述溶液中混匀；(3)、在室温放置1-10min，然后在-20℃冷冻 0.5-3h，-60～80℃再冷冻0.5-3小时；(4)、最后经-50℃冻干机条件下冻干48-96 小时以得到初步脚手架；(5)、将所述初步脚手架和5-20mL0.1-0.5％EDC在室 温作用12-48h；(6)、再在-20～-30℃的条件冷冻12-48h后，最后，在-50℃冻干 机条件下冻干48-96小时，制得脚手架。

在进一步方案中，所述明胶的数值范围是0.4～0.7g、透明质酸钠的数值范围 是3～8mg、软骨素6-磷酸钠盐的最好范围是是0.2～0.4g或双蒸水的数值范围是 7.0～8.5ml。

在进一步方案中，在步骤2中所述EDC的数值范围是1.5～2.5ml。

在进一步方案中，在步骤3中，所述在室温放置时间是2～5min、在-20℃冷 冻放置时间的数值范围是1.5～2.5h或在-80℃冷冻放置时间的数值范围是 1.5～2.5h。

在进一步方案中，在步骤4中-50℃的条件下冻干时间的数值范围是64～80h。

在进一步方案中，在步骤5中，EDC的数值范围是8～13ml、在室温放置时 间的数值范围是18～30min。

在进一步方案中，在步骤6中，在-20℃冷冻在室温放置时间的数值范围是 18～30min或在冻干时间最好的数值范围是64～80h。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

由于本发明采用上述制备条件并将各成分控制在上述范围内，所以，制得 的工程脚手架具有多孔海绵状空间立体架构、组织相容性好、质地好、孔径大 小合适以及吸水度好，而且，由于采用所述材料，所以，没有毒性也可完全降 解。

附图说明

图1是本发明适合细胞生长的多孔径组织工程脚手架的制造方法的流程图；

图2是通过本发明的方法制造的一种工程脚手架的结构图，该图显示工程 脚手架铂金喷镀后扫描电子显微镜放大2000倍照片，该照片显示本材料呈光滑 的多孔海绵状空间构架，标尺20um，P为海绵多孔结构，孔径均匀，表面光滑， 经测量孔径大小为60-80um。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所达成目的及功效，下面将结 合实施例并配合附图予以详细说明。

请参阅图1，本发明适合细胞生长的多孔径海绵状组织工程脚手架包括如下 步骤：

(1)、明胶0.3-1.0g，透明质酸钠1-8mg和软骨素6-磷酸钠盐0.05-0.5g溶 解在5-10ml双蒸水中而构成溶液；

在该步骤中，当明胶小于0.3g时，脚手架质地会太软，不易冻干成型，无 法形成多孔状结构，孔径大小合适；当明胶大于1.0g时，脚手架质地太硬而脆， 吸水度变差。在本发明中，明胶为0.3g、0.35g、0.4g、0.42g、0.47g、0.5g、0.53g、 0.57g、0.59g、0.65g、0.7g、0.75g、0.78g、0.81g、0.84g、0.89g、0.92g、0.95g、 0.97g或者1.0g，明胶最好的数值范围是0.4～0.7g，在该范围内脚手架质地和吸 水度合适。

在该步骤中，当透明质酸钠小于1mg时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变 差，大于8mg时，孔径变小，质地变软。比如，可以是1mg、1.5mg、1.8mg、 2mg、2.5mg、2.7mg、2.9mg、3mg、3.4mg、3.6mg、4mg、4.1mg、4.2mg、4.9mg、 5mg、5.7mg、5.9mg、6mg、6.3mg、6.5mg、6.8mg、6.9mg、7mg、7.2mg、7.8mg 或者8mg。在本发明中，透明质酸钠最好的数值范围是3～8mg。

在该步骤中，所述软骨素6-磷酸钠盐可以是0.05g、0.1g、0.13g、0.15g、0.2g、 0.23g、0.27g、0.3g、0.35g、0.4g、0.41g、0.43g、0.47g或者0.5g。在本发明中， 软骨素6-磷酸钠盐的最好范围是是0.2～0.4g。

在该步骤中，当双蒸水的量小于5ml时，质地变脆；当双蒸水的量大于10ml 时，不易冻干。比如，5ml、5.5ml、5.8ml、6ml、6.2ml、6.7ml、6.9ml、7ml、 7.1ml、7.3ml、7.7ml、8ml、8.5ml、8.9ml、9ml、9.1ml、9.3ml、9.6ml、9.9ml 或者10ml。双蒸水的最好数值范围是7.0～8.5ml。

(2)、用1-5mL0.2％1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(EDC) 加入所述溶液中混匀；

在该步骤中，当EDC小于1ml时，脚手架质地会太软，不易冻干成型，无 法形成多孔状结构；当EDC大于5ml时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变差。 在本发明中，EDC为1ml、1.3ml、1.6ml、1.9ml、2ml、2.2ml、2.5ml、2.8ml、 3.1ml、3.4ml、3.7ml、4.0ml、4.3ml、4.6ml或者5ml，在本发明中EDC最好的 数值范围是1.5～2.5ml，脚手架质地和吸水度合适。

(3)在室温放置1-10min，然后在-20℃冷冻0.5-3h，-80℃再冷冻0.5-3小 时；

在该步骤中，当在室温放置时间小于1min时，脚手架质地会太软，不易冻 干成型，无法形成多孔状结构；当EDC大于10min时，脚手架质地太硬而脆， 吸水度变差。在本发明中，在室温放置时间为1min、2min、3min、4min、5min、 6min、7minl、8min、9min或10min，在室温放置时间最好的数值范围是2～5min， 在该范围内脚手架质地和吸水度合适。

在该步骤中，当在-20℃冷冻放置时间小于0.5h时，将有冰晶形成，不能使 用冻干机冻干；当-20℃冷冻放置时间大于3h时，脚手架质地太硬而脆，吸水度 变差。在本发明中，在室温放置时间为0.5h、1.0h、1.5h、2h、2.5h、3h，在-20 ℃冷冻放置时间最好的数值范围是1.5～2.5h，在该范围内脚手架质地和吸水度合 适。

在该步骤中，当在-80℃冷冻放置时间小于0.5h时，脚手架冷冻不足，不能 使用冻干机冻干；当-80℃冷冻放置时间大于3h时，脚手架质地太硬而脆，吸水 度变差。在本发明中，在室温放置时间为0.5h、1.0h、1.5h、2h、2.5h、3h，在 -80℃冷冻放置时间最好的数值范围是1.5～2.5h，在该范围内脚手架质地和吸水 度合适。

(4)、最后经-50℃冻干机条件下冻干48-96h以得到初步脚手架；

在该步骤中，当冻干时间小于48h时，脚手架冻干不足，还呈粘稠状，无 法得到初步脚手架；当冻干时间大于96h时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变 差。在本发明中，在冻干时间为48h、56h、64h、72h、80h、88h、96h，在冻干 时间最好的数值范围是64～80h，在该范围内脚手架质地和吸水度合适。

(5)、将所述初步脚手架和5-20mL0.2％EDC在室温作用12-48h；

在该步骤中，当EDC小于5ml时，脚手架质地会太软，孔径将太小；当EDC 大于20ml时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变差。在本发明中，EDC为5ml、 5.2ml、5.6ml、6.3ml、7ml、7.5ml、8ml、10ml、11ml、13ml、16ml、20ml， EDC最好的数值范围是8～13ml，在该范围内脚手架质地和吸水度合适。

在该步骤中，当在室温放置时间小于12h时，脚手架质地会太软；当EDC 大于48h时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变差。在本发明中，在室温放置时 间为12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h，在室温放置时间最好的数值范围是 18～30min，在该范围内脚手架质地和吸水度合适。

(6)、再在-20℃的条件冷冻12-48h后，最后，在-50℃冻干机条件下冻干 48-96小时，制得脚手架。

在该步骤中，当在-20℃冷冻放置时间小于12h时，将有冰晶形成，不能使 用冻干机冻干；当-20℃冷冻放置时间大于48h时，脚手架质地太硬而脆，吸水 度变差。在本发明中，12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h，在室温放置时 间最好的数值范围是18～30min，在该范围内脚手架质地和吸水度合适。

在该步骤中，当在-50℃冻干时间小于48h时，脚手架冻干不足，质地变软； 当冻干时间大于96h时，脚手架质地太硬而脆，吸水度变差。在本发明中，在 冻干时间为48h、56h、64h、72h、80h、88h、96h，在冻干时间最好的数值范围 是64～80h，在该范围内脚手架质地和吸水度合适。