采用LAMP技术检测牛无浆体方法

摘要

采用LAMP技术检测牛无浆体方法，该检测方法包括LAMP引物设计、LAMP反应体系建立以及采用LAMP检测方法，所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测，所述的LAMP引物设计利用PrimerExplorerV4软件针对牛无浆体16SrRNA基因的6个位点设计4条LAMP引物，引物包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，其中：F3：GGGCATGTAGGTGGTTTGG；B3：GCGTGGACTACCAGGGTAT；FIP：TCTCCCGGACTCCAGTCTGGTAAAGGTGAAATGCCAGGGC；BIP：ATTAGGAGGAACACCAGTGGCGCACGCTTTCGCACCTCAG。该法以牛无浆体16SrRNA为靶基因位点，具有快速、灵敏、高效、低成本等特点，为牛无浆体病的病原检测提供新的技术方法。

说明书

技术领域

 本发明属于分子生物学领域，具体涉及采用环介导等温扩增技术（LAMP）检测牛无浆体方法。

背景技术

牛无浆体（Anaplasma bovis）：属于立克次体目(Rickettsiales)无浆体科(Anaplasmataceae)无浆体属（Anaplasma），是一类专性寄生于脊椎动物血细胞中的无固定形态的微生物(宝福凯, 柳爱华. 立克次体目微生物的系统分类进展[J].中国人兽共患病学报, 2007,23(12): 1262-1264.)。该病原可引起牛、羊、鹿等反刍动物和犬、兔等哺乳动物的贫血、消瘦、黄疸、流产甚至死亡，给养殖业带来严重的损失。

无浆体属包含6个种：（1）边缘无浆体（A. marginale）；主要感染牛和鹿，寄生于动物红细胞中；有较强致病力，是各国科学家研究的热点和重点；（2）绵羊无浆体(A. ovis)：主要寄生于动物红细胞，可以引起绵羊、山羊、鹿等发病，但不感染牛；（3）中央无浆体(A. centrale)：感染牛，致病力较弱，在以色列、南美洲和澳大利亚被用作活疫苗(de la FUENTE J, LEW A, LUTZ H, et al. Genetic diversity of Anaplasma species major surface proteins and implications for anaplasmosis serodiagnosis and vaccine development[J]. Animal Health Research Reviews, 2005, 6(1): 75-89.)；（4）嗜吞噬细胞无浆体（A. phagocytophilum）：是由以前的马埃里克体（Ehrlichia equi）、嗜吞噬细胞埃里克体（E. phagocytophila）和人粒细胞埃里克体病（Human granulocytic anaplasmosis,HGA）的病原合并而来，是一种寄生于宿主粒细胞中的人畜共患病病原；（5）牛无浆体（A. bovis）：旧称牛埃里克体（E. bovis），感染牛羊等反刍动物，寄生于动物血液的单核细胞中；（6）扁平无浆体（A. platys）：旧称扁平埃里克体（E. platys）主要感染犬类动物(DUMLER J S, BARBET A F, BEKKER C P, et al. Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and 'HGE agent' as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophila[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2001, 51(Pt 6): 2145-2165.)。

牛无浆体的宿主动物主要是牛羊等反刍动物，也可感染鹿，哺乳动物犬及兔等(GOETHERT H K, TELFORD S R. Enzootic transmission of Anaplasma bovis in Nantucket cottontail rabbits [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2003, 41(8): 3744-3747; LEE M, YU D, YOON J, et al. Natural co-infection of Ehrlichia chaffeensis and Anaplasma bovis in a deer in South Korea[J]. Journal of Veterinary Medical Science, 2009, 71(1): 101-103; KANG J G, KIM Y J, YANG H J, et al. New Genetic Variants of Anaplasma phagocytophilum and Anaplasma bovis from Korean Water Deer (Hydropotes inermis argyropus)[J]. VetorBorne and Zoonotic Diseases, 2011, 11(7): 929-938.)；绵羊无浆体的宿主动物主要是绵羊、山羊及一些野生反刍动物(de la FUENTE J, HOGG J T, NARANJO V, et al. Genetic characterization of Anaplasma ovis strains from bighorn sheep in Montana[J]. Journal of Wildlife Diseases, 2006, 42(2): 381-385)；嗜吞噬细胞无浆体的宿主范围比较广，包括人、牛、羊、马、鹿、狗、猫、猪、鼠和兔等动物(de la FUENTE J, WONG S J, LUTZ H, et al. Sequence analysis of the msp4 gene of Anaplasma phagocytophilum strains [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2005, 43(3): 1309-1317; MORGENTHAL D,  HAMEL D, ARNDT G, et al. Prevalence of haemotropic Mycoplasma spp., Bartonella spp. and Anaplasma phagocytophilum in cats in Berlin/Brandenburg (North-East Germany)[J]. Berliner und Münchener Tier?rztliche Wochenschrift, 2012, 125 (9- 10): 418-427; GALINDO R C, AYLLON N, SMRDEL K S, et al.Gene expression profile suggests that pigs(Sus scrofa) are susceptible to Anaplasma phagocytophilum but control infection[J]. Parasites & Vectors, 2012, 5: 181.)，是一种重要的人畜共患病病原。边缘无浆体主要感染牛等反刍动物，包括家养牛及一些野生动物如野牛、长颈鹿、叉角羚、大角羊、麋鹿、白尾鹿、黑尾鹿等(PALMER G H, RURANGIRWA F R, MCELWAIN T F. Strain composition of the EhrlichiaAnaplasma marginale within persistently infected cattle, a mammalian reservoir for tick transmission[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2001, 39 (2): 631-635; de la FUENTE J, THOMAS E, Van den BUSSCHE R A, et al. Characterization of Anaplasmamarginale isolated from north American bison[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(8): 5001-5005. )。

目前，无浆体的主要检测方法有病原学诊断、血清学诊断法和分子生物学诊断法等。

    病原学诊断主要有血涂片检查和动物接种试验。血涂片检查仍是无浆体检查最为经典的方法，其要求在疑患病动物用药之前体温较高时进行采集动物耳尖血做血涂片，用姬姆萨染色法染色，染色后在1000倍油镜下观察结果。该法然简单可靠，但在感染率很低或感染早期时很难在显微镜下检查出病原，而且操作的熟练程度将直接影响诊断结果的准确性(张菲菲. 羊无浆体PCR诊断方法建立及分子流行病学调查[D]. 郑州: 河南农业大学, 2013.)。临床上，若被检动物染虫率很低，不能确诊，可通过人工培养病原，接种实验动物来人工感染动物，然后收集接种动物的血液，进行诊断(AUBRY P, GEALE D W. A Review of Bovine Anaplasmosis[J]. Transboundary and Emerging Diseases, 2011, 58(1):1-30；COETZEE J F, APLEY M D, KOCAN K M. Comparison of the complement fixation test and competitive ELISA for serodiagnosis of Anaplasma marginale infection in experimentally infected steers[J]. American Journal of Veterinary Research, 2007, 68(8): 872-878. )。无浆体的体外培养往往需要较好的实验条件和操作熟练的专业技术人员，因此该方法不适用于田间流行病学调查，而较适合于病原的实验室分离。

血清学诊断主要有补体结合试验（CF）、卡片凝集试验（CA）、酶联免疫吸附试验(ELISA)。在我国，张其才利用边缘边虫高染虫率的含虫血所制备的补反诊断抗原具有敏感性良好和特异性很强的特点，CF方法对试验条件下人工感染牛的补反检出率为99%，安全区无假阳性反应(张其才,吕文顺,窦惠芳,等. 补体结合试验诊断边虫感染牛的研究[J]. 中国兽医科技．1993,23 (5):8-10)，但袁建丰等试验证明该试验在很大程度上无法检测出隐性感染及感染初期的动物（袁建丰.1）边缘无浆体快速诊断试剂盒的研制;2）羊泰勒虫临床症状、血液学以及抗体变化的研究[D].武汉：华中农业大学，2005）。该方法虽然具有其自身的很多优点，但其自身仍存在不足，它要求抗原和抗体的比例适当，否则会出现假阳性或假阴性现象，另外，由于操作条件和技能等较高要求的限制而不适合于田间流行病学调查。在1991年，国际兽医局颁布的推荐诊断技术指南中，卡片凝集试验被确定为诊断牛边缘无浆体病的主要方法之一。张肖正等将快速卡片凝集试验(RCA)与补体结合试验(CF)进行了比较，结果显示，RCA的敏感性比CF更好，且检出感染后的阳性反应持续时间长。但是卡敏凝集实验的非特异性反应及解释结果的主观性是该方法的制约因素，另外，该实验所用的抗原很难制备，并且不同批次、不同实验室之间制备的会有所不同，从而造成结果的异同。在我国，余丰等利用冷藏抗原片进行间接免疫荧光抗体实验检测边缘无浆体，结果表明，该方法具有敏感性高、特异性强等特点，人工感染牛的符合率为100%；检查疫区的273份血清样品，阳性率为35.2％，对安全区的86份血清样品进行检查，假阳性率为3％。在实验中，边缘无浆体抗原与双芽巴贝斯虫、瑟氏泰勒虫、伊氏锥虫感染的牛血清均无交叉反应，与感染了绵羊无浆体的羊血清有较强的交叉反应（余丰,吕文顺,张其才等.间接荧光抗体诊断牛边缘边虫病的研究[J].中国兽医科技,1990(5): 8-10.）。2007年Glen等证实了ELISA方法能够有效且可靠的诊断家养羊的绵羊无浆体病和野生有蹄类动物的无浆体病(Glen A Scoles, WL Goff, TJ Lysyk, et al. Validation of an Anaplasma marginale cELISA for use in the diagnosis of A. ovis infections in domestic sheep and Anaplasma sp. in wild ungulates[J]．Veterinary Microbiology, 2008,130(1-2): 184-190)。同年，Strik 等报道cELISA能够特异和敏感的检测出感染无浆体的动物。然而，由于MSP 5蛋白在无浆体中的保守性，该方法并不能将各种无浆体区分开而进行鉴别诊断（Strik, N. I., A. R. Alleman, A. F. Barbet, et al. Characterization of Anaplasma phagocytophilum major surface protein 5 and the extent of its cross-reactivity with A.marginale [J]. clinical and vaccine immunology,2007,14 (3): 262-268.）。2010年徐平源等还对湖南地区边缘无浆体的 MSP4基因进行了克隆及序列分析，这些都为重组抗原ELISA诊断方法的建立奠定了基础。ELISA多用于样品的批量筛检，且特异性强，但其缺点在于对时间和操作的要求非常严格，必须有专业人员完成，而且对于阳性的区别比较模糊，有时候需要反复做(徐平源, 何德肆. 湖南地区边缘无浆体的MSP4基因的克隆及序列分析[J]. 中国预防兽医学报, 2010, 32(10): 815-817)。 

分子生物学诊断方法主要有核酸探针技术、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)。核酸探针是指一段用放射性同位素或其他标记物(如酶与荧光素等)标记的DNA片段、单链DNA和RNA等。其具有特定的序列，能够与具有相应核苷酸碱基互补序列的核酸片段结合，可用于样品中特定基因片段的检测。中国研究者马米玲等的研究表明，核酸探针技术的最大优点是可以较准确的区分形态相似的病原，但与病原学检查和血清学方法相比，其敏感性并不具有明显的优势，而且需要特殊设备，检出速度又慢，不适应于大批量样品的检测(马米玲, 罗建勋, 殷宏, 等. 边缘无浆体病诊断方法的研究进展[J]. 中国兽医科学, 2008,38(07):633-638)。除常规PCR检测方法外，还有复合实时荧光定量PCR(JW Courtney, LM Kostelnik, NS Zeidner, et al. Multiplex Real-Time PCR for Detection of Anaplasma phagocytophilum and Borrelia burgdorferi[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2004, 42(7): 3164- 3168)、实时反转录PCR (KR Sirigireddy, RR Gant. Multiplex Detection of Ehrlichia and Anaplasma Species Pathogens in Peripheral Blood by Real-Time Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction[J]. Journal of Molecular Diagnostics, 2005, 7(2): 308-316)、双重RT-PCR (N Decaro, G Carelli, E. Lorusso, et al. Duplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection and quantification of Anaplasma marginale and Anaplasma centrale[J]. Journa of Veterinary Diagnostic Investigation, 2008, 20(5): 606-611)、实时荧光定量PCR(迟庆安. 绵羊无浆体和牛无浆体实时荧光定量 PCR 检测方法的建立[D]. 新疆: 新疆农业大学, 2013.)等方法检测无浆体，虽然PCR方法的敏感性高，特异性强，但是其操作繁琐，不适合实践应用，而更适合用于长期带虫动物的检测。

与传统PCR方法相比，LAMP技术属于等温扩增，无需昂贵的热循环仪，并且由于LAMP反应中可以产生大量的副产物——白色焦磷酸镁沉淀，扩增产物可不经过电泳，无需开盖直接通过肉眼观察即可判定结果，在反应前、后加入染色剂效果更佳。LAMP技术敏感性高、特异性强、操作简便，能够满足现场和条件较差的基层实验室进行快速检测的需求。目前，LAMP方法已用于多种寄生虫等病原体的检测，例如，李群等根据牛巴贝斯虫的细胞色素b基因（cyt b）设计LAMP引物，建立了检测牛巴贝斯虫的LAMP方法(李群,王素华,周前进,等.快速检测牛巴贝斯焦虫LAMP方法的建立[J].中国预防兽医学报,2010,10(32): 781-784.)；王中光等根据瑟氏泰勒虫表面蛋白基因（P33）设计引物，建立了检测牛瑟氏泰勒虫的LAMP方法(王中光,张守发,曹士诺,等.牛瑟氏泰勒虫环介导等温扩增检测方法的建立[J].中国预防兽医学报,2010, 2(32): 108-111)；Ma 等根据绵羊无浆体的表面蛋白4（MSP4）基因设计引物，建立了检测绵羊无浆体的LAMP方法(Miling Ma, Zhijie Liu, Jianxun Luo, et al. Development and Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Rapid Detection of Anaplasma ovis[J].JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. 2011, 49(6):2143-2146)；Pan等根据嗜吞噬细胞无浆体的表面蛋白2（MSP2）基因设计引物，建立了检测嗜吞噬细胞无浆体的LAMP方法(Lei Pan, Lijuan Zhang, Guiqiang Wang, et al. Rapid, Simple, and Sensitive Detection of Anaplasma phagocytophilum by Loop-Mediated Isothermal Amplification of the msp2 Gene[J]. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. 2011,49(12):4117- 4120)；目前，尚没有牛无浆体的LAMP检测方法，本发明以牛无浆体16S rRNA为靶基因位点设计引物，建立针对牛无浆体的LAMP方法。

发明内容

针对现有技术的检测方法检出率低、操作繁琐等问题，本发明提供一种LAMP技术检测牛无浆体方法，该法以牛无浆体16S rRNA为靶基因位点，具有快速、灵敏、高效、低成本等特点，为牛无浆体病的病原检测提供新的技术方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：采用LAMP技术检测牛无浆体方法，该检测方法包括LAMP引物设计、LAMP 反应体系建立以及采用LAMP检测方法，所述的 LAMP 检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测，所述的LAMP引物设计利用Primer Explorer V4软件针对牛无浆体16S rRNA基因的6个位点设计4条LAMP引物，引物包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP。 

F3：GGGCATGTAGGTGGTTTGG；

B3：GCGTGGACTACCAGGGTAT；

FIP：TCTCCCGGACTCCAGTCTGGTAAAGGTGAAATGCCAGGGC；

BIP：ATTAGGAGGAACACCAGTGGCGCACGCTTTCGCACCTCAG。

    所述的LAMP 反应体系包括：

1）引物混合液：外引物为F3和B3各0.2 μmol/L，内引物为FIP和BIP各1.6 μmol/L，外内引物比为1：8；

2）反应混合液：0.8 mol/L Betaine，8 mmol/L MgSO₄，1.4 mmol/L dNTP Mixture，8 U/25 μL Bst DNA 聚合酶；

3）2μl DNA模版；

加灭菌双蒸馏水至25 μL。

    所述LAMP 反应体系的反应条件，将引物引物混合液和反应混合液混合均       匀后加入2 μL DNA模版，在60-65℃保温30-90min。

    所述LAMP 反应体系的反应条件，将引物引物混合液和反应混合液混合均匀后加入2 μL DNA模版，在62℃保温60min。

    所述的荧光可视化检测采用SYBR Green I染料，在每个管盖内侧添加1μL稀释10倍的SYRB Green I原液，合上管盖，反应结束后，轻甩反应管，使染料与产物混合。

    本发明有以下优点：（1）扩增效率极高，60min内扩增产物可达到靶基因的10⁹~10¹⁰倍；（2）本发明操作简单，只需在62℃恒温条件下将反应物混合，反应1h，不需要复杂的温度变化过程；（3）本发明建立的牛无浆体 LAMP检测方法灵敏性高，扩增模板只需10 copies/μL或更少；（4）本发明基于牛无浆体16S rRNA建立的LAMP方法特异性高，可检测牛无浆体，不能检测嗜吞噬细胞无浆体、绵羊无浆体、吕氏泰勒虫、莫氏巴贝斯虫、血吸虫；（5）本发明结果判定简单，可以通过添加1μL 10倍稀释的SYRB GreenⅠ染料，显色直接肉眼观察，不经过电泳。

附图说明

图1为本发明检测牛无浆体电泳检测图，M为DL2000DNA Marker，1-7为阳性结果，为LAMP 扩增梯形条带，N为阴性对照，无扩增产物；

图2为本发明添加荧光染料检测结果，1-7为阳性结果，具有绿色荧光，N为阴性对照，为褐色；

图3为本发明添加荧光染料后紫外显像检测结果，1-7为阳性结果，呈较亮荧光，N为阴性对照，荧光较弱；

图4是本发明中不同反应温度条件下测得的LAMP体系试验电泳检测图，图中所示：M：DL2000 DNA Marker；1：60℃；2：61℃；3：62℃；4：63℃；5：64℃；6：65℃；N：阴性对照，65℃；

图5是本发明中不同浓度MgSO₄条件下测得的LAMP体系试验电泳检测图，图中所示：M：DL2000 DNA Marker；1：2 mmol/L；2：4 mmol/L；3：6 mmol/L；4：8 mmol/L；5：10 mmol/L；6：12 mmol/L；7：14 mmol/L；N：阴性对照，8 mmol/L；

图6是本发明中不同浓度dNTP Mixture条件下测得的LAMP体系试验电泳检测图，M：DL2000 DNA Marker；1：0.8 mmol/L；2：1.0 mmol/L；3：1.2 mmol/L；4：1.4 mmol/L；5：1.6 mmol/L；6：1.8 mmol/L；7：2.0 mmol/L；N：阴性对照，1.4 mmol/L；

图7是本发明中在加入不同量的酶的条件下测得的LAMP体系试验电泳检测图，M：DL2000 DNA Marker；1：2U；2：4U；3：6U；4：8U；5：10U；6：12U；7：14U；N：阴性对照，8U /25μL；

图8是本发明检测牛无浆体敏感性试验LAMP 电泳扩增图，图中M：DL2000 DNA Marker；1~7代表嗜吞噬细胞无浆体DNA含量为10³~10^-3 copies/μL，N为阴性对照；电泳结果显示LAMP的检测限为10⁰，检测灵敏度是常规PCR的100倍；

图9是本发明检测牛无浆体敏感性试验常规PCR电泳扩增图，1~7代表嗜吞噬细胞无浆体DNA含量，N为阴性对照；

图10是本发明检测牛无浆体特异性试验电泳检测图，图中M：DL2000 DNA Marker；1：A. bovis；2：A. phagocytophilum；3：A. ovis；4：B. motasi；5：T. luwenshuni；6：Schistosoma japonicum ；7：双蒸水，1为A. bovis基因组出现LAMP特征性梯状条带，展示较好的特异性。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。

所述试剂均为市售，所用DNA模版本申请人实验室均有保存。

主要试剂：Bst DNA聚合酶大片段（Bst DNA polymerase large fragment），New England Biolab；三甲铵乙内酯（Betaine），Sigma公司；Tap DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP Mixture）、DL2000 DNA Marker、6×Loading buffer，TaKaRa生物合成公司；DNAGreen，TIANDZ； SYBR Green I，Solarbio；基因组DNA快速抽提试剂盒（血液），上海生工生物合成有限公司。

试验仪器：电热恒温水浴锅，北京市长风仪器仪表公司，型号HwS24；PCR仪，Gene Company Limited，型号9700；稳压稳流电泳仪，北京市六一仪器厂，型号DYY-5；紫外成像仪，SYNGENE，型号InGenius LHR；数码照相机，佳能公司，型号IXUS115 HS；快速混匀器，GENIE，型号VORTEX-2；高速台式离心机，上海安亭科技有限公司，型号TGL-16B；手掌型离心机，江苏海门市麟麟医用仪器厂，型号LX-100；分析天平，METTLER TOLEDO公司，型号AB204-N；精密PH计，上海宇隆仪器有限公司，型号PHS-3C；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；双重纯水蒸馏仪，上海亚荣生化仪器厂，型号SZ-93；移液器，BRAND。

1.引物设计

首先本发明人从NCBI上下载了牛无浆体16S rRNA基因序列（登录号：FJ169957.1），使用 Primer Explorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0 / index.html）设计多组引物，然后根据引物序列所在区域的保守性、引物的发夹结构、GC含量及Tm 值等综合因素选择引物，共设计4条LAMP引物，其中包括2条外引物F3、B3和2条内引物FIP、BIP。引物的信息见表1：

表1引物序列信息

    2. DNA提取

使用DNA 快速提取试剂盒(血液)，（购自上海生工生物工程有限公司，批号：82241205Y），按照操作说明，分别提取血液样品总DNA，最后溶于50 μL 洗脱缓冲液中，保存于-20℃冰箱中。

3. LAMP 反应体系

LAMP反应体系总量为25μL，如下：10×ThermoPol 缓冲液2.5μL，20 m mol/L Tris-HCl，10 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH₄)₂SO₄，外引物F3和B3各0.2 μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，dNTPs 1.4 mmol/L，MgSO₄ 8 mmol/L， betaine 0.8 mol/L，Bst DNA polymerase(NEB) 8U，模板DNA 2 μL，LAMP体系反应不足用灭菌双蒸馏水添加至25μL。反应前在管盖上加入1μL 10倍稀释的SYBR Green I染料，反应条件为：65℃恒温1h。

  1）反应温度的优化，在LAMP 反应体系中，其他条件相同的情况下，设置LAMP反应温度分别为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，观察温度对LAMP反应的影响，并作阴性对照，温度为65℃。如图2的条带1-6，可以看出反应温度对LAMP体系的影响，在60~65℃温度范围内均出现LAMP特征性梯状条带扩增，从经济和扩增效率等多方面因素考虑，将62℃作为最优反应温度。

  2）反应时间的优化，在LAMP 反应体系中，其他条件相同的情况下，设置LAMP反应时间分别为30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min，观察反应时间对LAMP反应的影响，并作阴性对照，反应时间为60min。LAMP反应在40min时开始出现条带，但考虑到要应用于不同DNA含量的样本，因此确定反应时间应不少于60min。

  3）在LAMP 反应体系中，设置Betaine的终浓度梯度为：0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L、1.2mol/L、1.4mol/L，阴性对照的终浓度为0.8mol/L，其他条件相同。LAMP反应中Betaine在1.0mol/L以下几个浓度均展现了较清晰的条带，也有报道不添加Betaine成功扩增的，但Notomi等报道反应体系中有0.5-1.5 mol/L Betaine存在的情况下，Betaine会促进DNA双链解链，同时会使碱基的堆积和非特异性扩增减少，最终提高反应效率，因此，我们选用0.6 mol/L作为Betaine最佳浓度。

  4）在LAMP 反应体系中，设置MgSO₄的终浓度梯度为：2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、12mmol/L、14mmol/L，阴性对照的终浓度为8mmol/L，其他条件相同。如图3所示，可以看出MgSO₄的浓度对LAMP体系的影响，选用MgSO₄的浓度有两个出现明显特征性条带，即图3中的条带4-5，MgSO₄的浓度为8 mmol/L和10 mmol/L，将8 mmol/L为MgSO₄最优浓度。

5）在LAMP 反应体系中，设置dNTP Mixture的终浓度梯度为：0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L、1.6mmol/L、1.8mmol/L、2.0mmol/L，阴性对照的终浓度为1.4mmol/L，其他条件相同。如图4所示，可以看出dNTP Mixture的浓度对LAMP体系的影响，选用dNTP Mixture的浓度有4个出现明显特征性条带，即图4中的条带1-4，dNTP Mixture的浓度0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L、1.4 mmol/L，将1.0 mmol/L作为dNTP Mixture最优浓度。

6）在LAMP 反应体系中，设置酶的终浓度梯度为：2U/25μL、4U/25μL、6U/25μL、8U/25μL、10U/25μL、12U/25μL、14U/25μL，阴性对照的终浓度8U/25μL，其他条件相同。如图5所示，可以看出酶的浓度对LAMP体系的影响，选用酶的添加量有5个出现明显特征性条带，即图5中的条带3-7，酶的浓度6U、8U、10U、12U和14U，将8U作为酶的最优用量。

7）在LMAP反应中F3和B3引物的浓度对反应结果影响很小，因此本研究中固定外引物F3和B3的浓度（0.2μM），把内引物FIP和BIP的浓度进行梯度优化，按外内引物比1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:12、1:14进行，阴性对照的外内引物比为1:8，其他条件相同。

4. 荧光可视化检测

SYBR Green I是一种双链DNA染料，可以非特异地结合到到双链DNA中。在游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链DNA中以后，便可以发出荧光，把SYRB GreenⅠ原液10倍稀释，每检测管添加1 μL，反应结果通过直接用肉眼观察和电泳两种方法来进行分析，结果见图1，发生扩增反应的呈现绿色，未发生扩增反应的呈现橙黄色，阳性呈绿色荧光，阴性褐色荧光；添加染料的反应管经紫外现象仪照射显示，发生扩增的呈较亮荧光，未发生扩增反应的荧光较弱；电泳阳性出现特征性体壮条带，阴性没有。

 5.敏感性试验

测定提取的牛无浆体的DNA浓度，将DNA按照l0倍系列稀释成10³~10^-3 7个梯度，取2μL进行LAMP扩增，电泳分析扩增结果，从而确定LAMP扩增方法的敏感性，结果见图6，本发明中LAMP的灵敏度比PCR方法高2个数量级（100倍）。

6.特异性试验

根据本发明建立的LAMP方法，试验组以牛无浆体基因组DNA为模板；分别将嗜吞噬细胞无浆体( A. phagocytophilum)、绵羊无浆体(A. ovis)、莫氏巴贝斯虫(B. motasi)、吕氏泰勒虫(T. luwenshuni)和血吸虫（S. japonicum）的DNA作为模板，按建立的LAMP检测方法进行扩增。如图7，检测牛无浆体、嗜吞噬细胞无浆体、绵羊无浆体、莫氏巴贝斯虫、吕氏泰勒虫和血吸虫的DNA，只有牛无浆体出现特征性条带，其余扩增结果均为阴性，说明特异性良好。

7. LAMP扩增产物的检测结果 

以牛无浆体基因组DNA为模板，按筛选好的25 uL LAMP扩增体系添加染料SYBR Green I进行扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，见图1，阳性呈特征性梯状条带，对照组未扩增条带；添加染料，阳性呈现绿色，阴性呈现橙黄色；紫外照射显像，阳性呈较亮荧光，阴性荧光较弱。

LAMP 检测方法不需要昂贵的仪器设备、操作程序简单，而且有快速高效、高特异性、高灵敏性的特点，其应用范围越来越广泛，已经在病原微生物检测中发挥出极大的优势，并成功应用于寄生虫病的相关研究中。

本发明建立了快速、灵敏、低成本的牛无浆体分子检测方法，针对牛无浆体16S rRNA设计引物，在62℃水浴锅中反应60 min，即可高效的扩增出结果。与传统的PCR检测方法相比，具有省时、高效、灵敏度高，特异性强的特点；并且，在反应管中加入SYBR Green I染料，即可完成不开盖检测，避免了开盖电泳检测时造成的污染。LAMP 作为一种分子生物学的快速检测方法，将会有更广阔的应用前景。 

引物位置说明：

其中，FIP由F1c和F2组成；BIP由B1c和B2组成；F1c、B2、B3序列的碱基是反向互补的。箭头方向是合成方向。

碱基互补：A对T    G对C

例如：          ATGCATGCATGC

互补序列就是：  TACGTACGTACG。

 

序列表

<110> 专利申请人   河南农业大学

<120> 发明名称      采用LAMP技术检测牛无浆体方法

<140> 专利申请号

<141> 专利申请日         

<160> 2

<210> 1

<211> 1412

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)...(1412)

<400> 

1                  gagtttgat cctggctcag atgcaagtcg aacggattgt tctcgtagct tgctatgaga           

60                 acaattagtg gcagacgggt gagtaatgca taggaatcta cctagtagta taggatagcc      

120               actagaaatg gtgggtaata ctgtataatc cctgcggggg aaagatttat cgctacatga        

180               tgagcctatg ttagattagc tagttggtgg ggtaatggcc taccaaggca gtgatctata          

240          gctggtctga gaggatgatc agccacactg gaactgagac acggtccaga ctcctacggg   

300             aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg cgcaagcctg atccagctat gccgcgtgag    

360               tgaggaaggc cttagggttg taaaactctt tcagtgggga agataatgac ggtacccaca       

420          gaagaagtcc cggcaaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggg gcaagcgttg  

480              ttcggaatta ttgggcgtaa agggcatgta ggtggtttgg taagttaaag gtgaaatgcc          

540               agggcttaac cctggagctg cttttaatac tgccagactg gagtccggga gaggatagcg      

600               gaattcctag tgtagaggtg aaattcgtag atattaggag gaacaccagt ggcgaaggcg      

660               gctatctggt ccggtactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat     

720              accctggtag tccacgctgt aaacgatgag tgctggatgt gggggttttt acctccgtgt           

780           tgtagctaac gcgttaagca ctccgcctgg ggactacggt cgcaagacta aaactcaaag     

840                gaattgacgg ggacccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaaa     

900                aaccttacca ctccttgaca tgaagattag atcctcctta acaggagggc gcagttaggc       

960                tgggtcttgc acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa          

1020              gtcccgcaac gagcgtaacc ctcaccctta gttgccagcg ggtaatgccg gggactttaa      

1080              gggaactgcc agtggtaagc tggaggaagg tggggatgat gtcaagtcag catggccctt      

1140              atggggtggg ctacacacgt gctacaatgg tgactacaat aggttgcaat gccgtaaggc       

1200              tgagctaatc cgtcaaaagt catcttagtt cggattgtcc tctgcaactc gagggcatga          

1260              agcaggaatc gctagtaatc gtggatcagc atgccacggt gaatacgttc tcgggtcttg        

1320          tacacactgc ccgtcacgcc atgggaattg gcttaactcg aagctggtgc gccaaccgaa     

1380          aggaggcagc caaagtcgta acaaggtagc cg      1412