含辣木叶水溶性提取物为有效成分的用于治疗或预防癌的组合物及辣木叶提取物的制备方法

摘要

本发明涉及含有辣木叶水溶性提取物作为有效成分的用于治疗或预防癌症的组合物，以及对于抗癌有效的辣木叶提取物的制备方法，本发明的组合物对正常细胞的毒性低但对癌细胞显示出优异的毒性，且因为是水溶性而细胞内吸收非常容易，因此作为口服制剂的抗癌治疗剂具有有利的优点，从而能够应用于天然物抗癌新药的开发。

说明书

技术领域

本发明涉及含有辣木(Moringa oleifera)叶水溶性提取物作为有效成分的用于治疗或预防癌症的药物组合物、含有辣木叶水溶性提取物作为有效成分的组合物及对抗癌有效的辣木叶提取物的制备方法。 

背景技术

辣木是原产地为印度的小灌木但在世界任何地方都有栽培，在广泛利用辣木的地区已经被移入而野生。辣木科有13种辣木树，其中，最为人所熟知的是印度传统辣木。印度传统辣木是以伞状展开的4-8米高的灌木。其特征为，30-70cm长度的叶子为落叶性，花为白色、香浓，果实为绿色、革质和悬垂的长三角形长荚，长达30-40cm，原生于印度西北部喜马拉雅山坡上，是在所有热带地区栽培的多用途的树种之一。 

辣木是原生于东南亚等地的植物，富含营养成分，而被称为奇迹之树，已知其具有抗糖尿病、抗癌、抗过敏等多种效果。虽然目前有利用辣木的单一的保健食品在销售，但是作为真正的抗癌剂还没有开发和上市。其理由是对辣木抗癌效果的科学论证资料不足，没有进行临床试验。且虽然开发了多种利用以往的辣木提取物的组合物，但到目前为止的辣木提取法主要依靠醇提法，辣木醇提提取物虽然能够在实验室中应用，但是还没有实际地将癌症患者或动物癌症模型为对象进行的研究。以往公知的辣木提取物相关专利有日本专利公开公报第2006-508902号，其组合物中含有辣木提取物作为有效成分，但仅涉及血管性头痛或神经疾病的治疗效果。此外，美国专利公开公报第2007-0264366号公开有已知的辣木叶提取物是利用乙醇提取，并仅记 载其抗真菌效果。 

另外，癌症患者的治疗方法的现状为主要依赖外科手术、放射疗法以及通过使用显示40多种强细胞毒性的抗癌物质给药的化学疗法，这些疗法大部分只局限于早期癌症患者或特定癌症，因此癌症引起的死亡是继续增加的趋势。 

以往作为抗癌剂使用的物质不仅对癌细胞产生影响，还对正常细胞显示毒性，因此发生很多导致副作用的情况。此外，现有的抗癌剂大部分主要是非水溶性物质，因此具有抗癌物质在细胞内吸收困难的缺点。为了溶解这些抗癌物质动用了多种附加方法，因此还可能导致由此引起的副作用，还发生抗癌剂的药效降低的问题，为了增加吸收同时还使用促吸收剂。且以往的注射剂型的抗癌剂显示出多种毒性和副作用，由于反复注射给药的困难而给患者带来不便。因此迫切需要一种对正常细胞不产生毒性，仅对癌细胞选择性地显示优异毒性，且给药便利性及人体吸收性提高的抗癌治疗剂。 

本发明发明人为了解决抗癌治疗剂的上述问题，在天然物辣木叶中寻找有效的抗癌成分而深入研究，结果发现以水作为提取溶剂得到的辣木叶提取物具有优异的抗癌效果，由此完成了本发明。 

现有技术文献 

专利文献 

专利文献1日本专利公开公报第2006-508902号(2006年3月16日公开) 

专利文献2美国专利公开公报第2007-0264366号(1995年11月21日公开) 

发明内容

发明目的 

本发明的目的在于提供含有辣木叶提取物作为有效成分的用于治疗或预防癌症的药物组合物。 

本发明的另一目的在于提供含有辣木叶提取物的用于改善或预防癌症的食品组合物及化妆品组合物。 

本发明的又一目的在于提供对抗癌有效的辣木叶提取物的制备方法。 

技术方案 

为了解决上述目的，本发明一实施例中提供含有辣木叶的水溶性提取物作为有效成分的用于治疗或预防癌症的药物组合物。 

在本发明的药物组合物中，作为优先实施例为了得到所述辣木叶的水溶性提取物，可以使用水作为提取溶剂。此外，用作所述提取溶剂的水可以使用低于40℃的温度，优选使用0-20℃，更优选使用0-10℃的水，但不限于此。 

所述辣木叶提取物可以将辣木叶浸渍于提取溶剂中得到。此时，辣木叶在水中浸渍的时间优选为1-60分钟，但不限于此。 

作为更优选实施例，作为有效成分而包含于本发明的组合物中的辣木叶提取物，可以使用在0-20℃的水中浸渍1-30分钟而得到的辣木叶提取物。此外，优选以辣木叶体积为基准，使用1-20倍体积的水进行浸渍得到，但不限于此。 

根据本发明的药物组合物想要预防或治疗的癌症可以是所有的癌症，优选肝癌、乳腺癌、肺癌、扁平上皮癌及纤维瘤，更优选为肺癌或肝癌。 

本发明的用于治疗或预防癌症的药物组合物可进一步含有药学上可接受的载体。且本发明的药物组合物使用水溶性溶剂，尤其是使用水作为提取溶剂，因此具有能够容易以口服吸收的制剂制备的优点，优选制备为片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、液剂、混悬剂、乳剂或胶囊剂等口服制剂，但不限于此，也可以制备为非口服制剂。 

此外，本发明另一实施例中提供含有辣木叶水溶性提取物作为有效成分的用于预防或改善癌症的食品组合物。此外，本发明还提供含 有辣木叶水溶性提取物作为有效成分的用于预防或改善癌症的化妆品组合物。 

本发明的又一实施例中提供对抗癌有效的辣木叶提取物的制备方法，其特征为，使用0℃以上且低于40℃的水提取辣木叶。 

所述辣木叶提取物的制备方法，包括：将辣木叶在以辣木叶体积为基准1-20倍体积的0-20℃的水中浸渍的步骤；收集辣木叶浸出液，去除不溶性物质的步骤；及对去除所述不溶性物质的浸出液进行过滤的步骤。所述的将辣木叶在水中浸渍的步骤中，优选将辣木叶在水中浸渍1-60分钟进行提取。 

下面详细说明本发明。 

本发明中使用的术语“预防”是指给药本发明的组合物而抑制癌症或延迟癌症的进行的所有行为。 

本发明中使用的术语“治疗”是指给药本发明的组合物而癌症症状好转或变得有利的所有行为。 

本发明中使用的术语“给药”是指使用任意的适当的方法，向个体提供规定的本发明组合物。 

本发明中使用的术语“药学上有效的量”是指可适用于医学治疗的合理的受惠量或风险比例的用于治疗疾病的充分的量，这可以根据个体的疾病的种类、严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径及排泄比例、治疗期间、包括同时使用的药物等因素以及其他医学领域公知的因素决定。 

本发明的一实施例涉及含有辣木叶水溶性提取物作为有效成分的用于治疗或预防癌症的药物组合物。 

在本发明的药物组合物中，以有效成分而含有的所述辣木叶提取物为水溶性提取物，其特征为使用水溶性溶剂，尤其是使用水作为提取溶剂。根据本发明的一实施例，可以确认使用水作为提取溶剂时，相比使用其他有机溶剂得到的提取物，其癌细胞的杀灭效果更优异 (图15)。 

此外，作为本发明药物组合物中含有的提取物的提取溶剂使用的水的温度优选低于40℃的温度。因此根据本发明的用于治疗或预防癌症的药物组合物中含有的有效成分可以大部分是辣木叶水溶性成分。现有的辣木叶提取物大部分使用乙醇或甲醇等有机溶剂作为提取溶剂或使用热水提取物法。使用上述有机溶剂提取或热水提取的情况时，活性成分的化学结构内具有巨大的疏水性基团，从而具有低水溶性，因此具有难以剂型化，且即使给药到体内也很难吸收的问题。相反，本发明使用低温水对辣木叶进行提取，提取物中含有水溶性成分，细胞内的吸收容易，具有易溶于水的优点，因此可以有效用作口服抗癌治疗剂。 

作为上述提取溶剂使用的水优选低于40℃温度的水，更优选0℃以上20℃以下的水，最优选0℃以上10℃以下的水。可以确认提取溶剂水的温度为40℃以上时，即使提高提取物的浓度处理，提取物对癌细胞生存的影响甚微，温度越低对癌细胞的毒性越低(图1a)。 

此外，本发明的提取溶剂的浸渍时间优选为1小时以内，浸渍时间为30分钟以内的提取物对癌细胞的存活显示出更优异的毒性效果(图1b)。 

因此，作为更优选的实施例，本发明的辣木叶提取物可以是在0℃以上至10℃以下的水中浸渍1-30分钟而得到的。 

本发明的药物组合物以有效成分包含的辣木叶水溶性提取物，其特征为，以辣木叶体积为基准，浸渍于1-20倍的水中得到。根据本发明一实施例的辣木叶提取物优选使用干燥的辣木叶粉末，但不限于此，也可以使用没有干燥的辣木叶。 

本发明中，所述癌症可以是选自肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、扁平上皮癌、纤维瘤、非小细胞性肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼球内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠 癌、肛周癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金式病(Hodgkin's disease)、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(Central nervous system，CNS)肿瘤、原发性CNS肿瘤、脊髓瘤、脑间神经胶质瘤或脑垂体腺瘤组成的组中的一种以上，优选为选自肝癌、乳腺癌、肺癌、扁平上皮癌及纤维瘤组成的组中的一种以上，优选为肝癌、乳腺癌、肺癌、扁平上皮癌及纤维瘤中的一种以上，更优选为肺癌或肝癌，但不限于此。本发明一实施例中，给实验小鼠口服给药辣木叶提取物1次，结果发现辣木叶提取物对肝癌及肺癌细胞具有优异的抑制效果(图14)。 

本发明的药物组合物以药物组合物的总重量为基准，可以含有0.01-50重量％的辣木叶提取物作为有效成分，进一步含有药学上可接受的载体。 

此外，将所述含有辣木叶提取物的药物组合物剂型化时，可以使用通常使用的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂而制备。 

本发明的药物组合物可根据药学领域的通常的方法，以适合给药到患者体内的单位给药型制剂剂型化。适于这种目的的剂型中非口服给药剂型优选注射用溶液或混悬液或可注射时使用注射用蒸馏水而制备的即时使用型注射用干燥粉末等注射用制剂；或软膏剂等局部给药用制剂等。此时，可以同时使用通常使用的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂。此外，本发明的药物组合物还可以制备成片剂、水性或油性混悬液、分散用粉末或颗粒、乳剂、硬质或软质胶囊、糖浆或酏剂等适合口服给药的口服型制剂。这些组合物的制备可以通过本领域技术人员公知的任意的方法制备。 

本发明的药物组合物含有水溶性提取物作为有效成分，因此优选为片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、液剂、混悬剂、乳剂或胶囊剂的口服制剂，但不限于此。用于口服给药的上述固体制剂可以在所述提取物中混合至少一种以上的如淀粉、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)或明胶等赋形剂制备。此外，除了单一的赋形剂之外，还可以使用硬脂酸镁、滑石等润滑剂。 

本发明的药物组合物还可以进一步包含向需要进行癌症治疗的患者给药的药剂，所述药剂选自由抗生素、烷基化剂、抗代谢药、激素物质、免疫学制剂、干扰素制剂及其他抗癌剂组成的组中的1种以上。但是本发明的医药用途及治疗用药物组合物并不限于上述内容，且可联用的其他药剂也不限于上述内容。 

本发明药物组合物的优选给药量根据患者的状态、体重、疾病程度、药物形态、给药途径及给药期间而不同，可由本领域技术人员进行适当的选择。但为了理想的癌症治疗或预防效果，本发明的提取物优选以每日0.0001-600μg/ml，更优选0.001-600μg/ml的量给药。此时所述提取物的给药量以提取物中包含的蛋白质的浓度为基准，而不是提取物的干燥重量。因此，实际给药时提取物干燥重量可能比所述蛋白质的用量更高。即根据本发明的具体实施例，实际给药的提取物的干燥重量大概为蛋白质用量的3倍，因此如果是以相对于总组合物的提取物干燥重量为基准的话，给药量优选为0.0001-18000μg/ml。此外本发明的组合物以Kg为基准时，优选所含的提取物干燥重量为50mg/Kg以上，更优选200mg/Kg。 

给药方式可以是1天给药1次，或分为数次给药。根据本发明的一实施例，向小鼠口服给药200mg/Kg(相对于总组合物的提取物干燥重量)的本发明提取物时，能够获得确切的癌细胞抑制效果。有效成分的实际给药量可根据癌细胞的量、给药途径、患者体重、年龄及性别等各种相关因素决定，因此上述给药量不管是选择哪种形式，都 不限定本发明的范围。 

本发明的提取物可以通过多种途径给药到大鼠、小鼠、家畜、人类等哺乳动物。可使用所有的给药方式，例如，可通过经口给药、直肠给药，或静脉、肌肉、皮下、子宫内膜或脑血管内(intracerebrove ntricular)注射给药。 

此外，本发明提供含有辣木叶水溶性提取物作为有效成分的用于预防或改善癌症的食品组合物。所述食品组合物可以直接添加辣木叶水溶性提取物，或可以与其他食品或食品成分一起使用，按照通常的方法适当地使用。添加到所述食品组合物的辣木叶水溶性提取物优选使用将辣木叶利用水作为提取溶剂得到的。作为提取溶剂的水优选使用40℃以下的水，更优选0℃以上至20℃以下的温度。使用20℃以下的水作为提取溶剂时，可以得到对预防或改善癌症具有更优异的效果的辣木叶提取物。此外，辣木叶提取物优选将辣木叶浸渍于水中得到，此时浸渍时间在1小时以内时，能够得到预防或改善癌症的效果更好的提取物。 

对所述食品的种类没有特别的限制。能够添加所述辣木叶提取物的食品的具体实例有肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、点心类、饼干类、披萨、方便面、其他面类、口香糖类、包括冰淇淋的乳制品、各种汤、饮料、茶、保健饮料、酒精饮料及维生素复合制剂等，包括所有通常含义的食品。 

本发明的食品组合物中的饮料组合物与通常的饮料一样可以含有各种增香剂或天然碳水化合物等作为附加成分。所述天然碳水化合物为葡萄糖、果糖等单糖；麦芽糖、蔗糖等双糖；及糊精、环糊精等多糖；木糖醇、山梨醇、赤藓醇等糖醇。甜味剂可以使用索马甜、甜菊提取物等天然甜味剂；糖精、阿斯巴甜等合成甜味剂等。以本发明组合物100ml为基准，所述天然碳水化合物的比例通常约为0.01-0.04g，优选约为0.02-0.03g。除了上述成分之外，本发明的辣木叶提取 物还可以含有各种营养剂、维生素、电解质、增味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。这种添加剂的比例并不是很重要，通常以本发明组合物100重量份为基准，在0.01-0.1重量份范围内进行选择。 

此外，本发明提供含有辣木叶水溶性提取物作为有效成分的化妆品组合物。所述化妆品组合物具有改善或预防皮肤癌的效果，更优选具有改善或预防扁平状皮肤癌的效果。根据本发明化妆品组合物优选含有以水作为提取溶剂得到提取物作为有效成分。且此时提取使用的水的温度优选使用低于40℃的水，更优选为0℃以上至20℃以下。此外，包含于所述化妆品组合物的辣木叶提取物优选将辣木叶浸渍于水中而得到，此时浸渍时间为1小时以内时能够得到具有更好的预防或改善皮肤癌活性的提取物。根据本发明的化妆品组合物除了有效成分之外，还可以含有化妆品组合物中通常利用的成分，例如还含有抗氧化剂、稳定剂、溶解剂、维生素、颜料及香料等通常的助剂，以及载体。此外，所述化妆品组合物为了增强其效果还可以进一步含有皮肤吸收促进物质。本发明的化妆品组合物可以制备为本领域通常制备的任何剂型。 

本发明的另一实施例涉及对抗癌有效的辣木叶的提取物的制备方法，其特征为，将辣木叶使用0℃以上20℃以下的水进行提取。 

根据本发明的辣木叶提取物的制备方法包括： 

将辣木叶在以辣木叶体积为基准的1-20倍的0-20℃的水中浸渍的步骤；收集辣木叶浸出液，去除不溶性物质的步骤；及对去除不溶性物质的浸出液进行过滤的步骤。 

本发明中，所述辣木叶提取物优选在辣木叶中加入1-20倍的水，浸渍一定时间后获得，优选浸渍1-6分钟。所述辣木叶优选使用干燥的辣木叶，但不限于此，也可以使用没有干燥的辣木叶。 

所述不溶性物质的去除可以利用离心分离进行。本发明的一实施例中在12000rpm条件下离心分离10分钟，进行3次，仅取上清液，从而去除不溶性物质。 

此外，所述过滤可以利用气孔尺寸为微米单位的滤布或滤纸将提取物分离为提取液和残余提取原料固体成分，过滤的提取液进一步使用气孔尺寸为纳米单位的膜滤器过滤，从而去除杂质(异味成分或色素成分)。将通过上述过滤获得的滤液进行浓缩，从而可以制备成液状辣木叶提取物，还可以通过干燥制备成粉末形态。此时，干燥方法的种类不受特别的限制，但为了使活性成分的热变性最小化，优选冷冻干燥。 

发明效果 

作为有效成分包含在本发明的组合物中的使用水作为提取溶剂提取的辣木叶提取物，对癌细胞的生长、迁移及浸润具有卓越的抑制效果，具体地，对癌细胞的生长、迁移及浸润能力相比正常细胞在癌细胞中显示出更高的毒性，且在诱导肝癌和肺癌的动物模型中仅口服给药1次的情况下也显示出高的抗癌效果。根据本发明的组合物对正常细胞的毒性低，但对癌细胞显示出优异的毒性，不仅因为是水溶性的而在细胞内的吸收及传递非常容易，而且能够克服有机溶剂提取时溶剂自身有毒性且难以制剂化的缺点，因此作为口服制剂的抗癌治疗剂具有有利的优点。从而本发明能够有效用于天然物抗癌新药的开发。 

附图说明

图1表示本发明组合物对A549肺癌细胞的增殖产生的效果的MTT分析结果。图1a表示在不同温度浸渍30分钟而得的提取物对A549肺癌细胞增殖产生的实验效果。图1b表示根据不同浸渍时间制备的辣木叶提取物的癌细胞抑制效果。 

图2是表示本发明一实施例在A549细胞中的细胞凋亡(apoptos  is)诱发效果的图。图2a是FACScan分析结果，框中的数字表示G0/G1流分(fraction)；图2b是半胱天冬酶-3(caspase-3)的蛋白免疫印迹测定的结果。 

图3是表示独立进行5次实验而平均化的辣木提取物对A549细胞的细胞凋亡诱导效果的谱图。 

图4是对其它癌细胞的辣木叶提取物的细胞凋亡诱导效果的FACS分析结果。 

图5是表示辣木叶提取物对细胞增殖的抑制效果的图。图5a是显微镜照片(×400)和利用细胞计数器(cell counter)计算的细胞数；图5b是表示通过集落形成测定(colony forming assay)得到的集落数。 

图6是表示通过集落形成测定的辣木叶提取物对其它癌细胞的抑制效果。 

图7是表示使用本发明辣木叶提取物处理的A549细胞的迁移性分析结果。图7a是光学显微镜照片；图7b表示平均迁移率。 

图8是表示通过DCFH-DA处理的活性氧簇，用本发明组合物对细胞进行处理之后使用FACScan对细胞内部的ROS水平进行分析的结果。 

图9是使用本发明组合物处理细胞后的蛋白质表达水平的蛋白免疫印迹测定的结果。 

图10是对使用本发明组合物处理及未处理时进行比较的总细胞蛋白的SDS-PAGE电泳照片。 

图11是基因微阵列的结果；图11a是微阵列结果；图11b是与上调的基因相关的功能分析结果；图11c是没有任何变化的基因的功能分析结果。 

图12是rRNA降解(degradation)的示意图。 

图13是正常细胞和癌细胞的细胞增殖的比较结果图。 

图14a表示中空纤维测定法(hollow fiber assay)的试验方法；图14b表示中空纤维测定的结果。 

图15是分别使用水、70％乙醇、100％DMSO作为提取溶剂时，辣木叶提取物的细胞凋亡诱导效果的FACS分析结果。 

具体实施方式

以下通过实施例进一步详细说明本发明。但本发明可以以多种不同形式实施，并不由在此说明的实施例所限定。且本发明中使用的术语、技术等在没有特别限定的情况下，应解释为本领域通常使用的含义。 

实施例1：根据提取时间的辣木叶提取物的制备 

干燥的辣木叶(M.oleifera leaves)购自GL网络公司(GL Net work Co.Ltd.)(在泰国清迈栽培)。将150mg的干燥的辣木叶在4℃的1ml水中浸渍，进行30秒的涡旋(vortexing)，然后在冷藏室中搅拌保存。各实施例在冷藏室的保存时间各不相同，即各实施例的浸渍时间如下表1中所示进行不同设置。将浸渍时间不同的各浸渍物在室温下再次进行1分钟的涡旋。此后通过进行3次离心分离(12000r pm，10分钟)，将浮游物的不溶性部分去除，接着将上清液(supern atant)进行过滤(0.2μM膜滤器)，得到最终产物。最终的辣木叶提取物进行冷冻干燥，并在-20℃下储藏。 

表1 

实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 5分钟 30分钟 1小时 3小时 24小时

实施例2：根据提取温度的辣木叶提取物的制备 

按照与实施例1相同的方法制备辣木叶提取物，不同的是，将浸渍时间固定为30分钟，各提取溶剂(水)的温度按照下表中所示进行不同设置。 

表2 

实施例6 实施例7 实施例8 实施例9 20℃ 40℃ 60℃ 80℃

用于下述实验的冷冻干燥的辣木叶提取物在对蛋白质浓度进行定量后，在蒸馏水(D.W.)中悬浮，以使蛋白质浓度为20mg/ml。以下实验中所用的辣木叶提取物的浓度是表示蛋白质的浓度。 

实验方法 

1、根据辣木叶提取物浓度的试样的准备 

辣木叶干燥粉末100g使用蒸馏水进行提取时，在冷冻干燥提取物的情况下，获得总重为17.5g的具有活性的水溶性干燥粉末。从起始原料得到水溶性干燥粉末的收率约为17.5％。 

此外，取通过所述方法得到的冷冻干燥粉末1g在10ml的蒸馏水中溶解并对蛋白质定量的情况下，上述试样中含有的蛋白质量为322mg，在干燥试样中蛋白质含量约为32％。使用起始原料辣木叶100g进行提取，因此根据上述蛋白含量计算的话最终蛋白质的收率为322mg*17.5＝5.6％。 

即1g的原料使用蒸馏水进行提取时得到0.175g的水溶性干燥粉末、0.056g的蛋白质，具有活性的水溶性干燥粉末中含有的蛋白质达32％。 

下面所有实施例中使用的标准均以蛋白质浓度为基准，导入到上述提取结果时，每克干燥重量含有32％的蛋白质，因此含有20mg/mL蛋白质的试样最终换算为干燥重量时大约相当于60mg/mL的干燥重量。即想要将实验所使用的活性提取物的所有蛋白质浓度换算为干燥重量的话乘以3倍即可。即以蛋白质浓度为基准使用100、200、300μg/mL浓度时，相当于300、600、900μg/mL的干燥重量。下面没有特别说明的情况下所有试样的浓度都是以蛋白质的浓度为基准。 

2、细胞培养(cell culture) 

为确认本发明效果而用于实验的肺癌细胞系(Lung cancer cell line)A549、肝癌细胞系(Hepatocellular carcinoma(HCC)cell li  ne)HpG2及源自肾脏的细胞系(非洲绿猴肾细胞，African green monkey kidney cells(COS-7)购自ATCC(美国典型培养物保藏中心，American Type Culture Collection；美国)及韩国细胞系银行(K orean Cell Line Bank，KCLB)。细胞在加入了10％FBS(胎牛血清，fetal bovine serum；Hyclone Lab公司，美国)和1％的青霉素-链霉素的RPMI-1640(A549、H23和H358)或DMEM(HpG2、MC F-7、A431、HT1080和COS-7)培养基中培养。将培养的细胞分别以1×10⁵细胞接种于6孔板，然后在37℃、95％空气/5％CO₂条件下维持。 

3、细胞存活率分析(MTT assay) 

细胞的存活能力通过使用四氮唑(tetrazolium)的细胞增殖分析方法—MTT分析法进行分析。将细胞以每100μl的培养基为基准以3×10³的细胞浓度接种于96孔板。培养1天之后，使用实施例制备的辣木叶提取物以0-400μg/ml的不同浓度在各板上进行处理。继续培养1天或2天后，向各孔中添加10μl的cell-counting Kit-8(Cat.No.CK04，同仁化学研究所，日本)或WST assay试剂(DAEIL LAB SERVICE，韩国)，培养4小时。然后，利用酶标仪(microplate rea der)(型号680，伯乐公司)在450nm波长处测定吸光度。 

4、流式细胞分析(Flow cytometric detection) 

在6孔板上以1×10⁵细胞/ml接种细胞之后，培养1天，然后使用不同浓度的辣木叶提取物进行处理。继续培养2天收集细胞，用PBS洗涤之后，在暗处使用70％乙醇在4℃条件下反应2小时进行固定。固定的细胞使用PBS洗涤2次之后，在室温下使用50μg/ml的碘化丙啶(propidium iodide，PI)进行30分钟染色。DNA的量使用F ACScan(EPICS XL流式细胞仪，贝克曼库尔特计数器(Beckman Coulter Counter))测定。各个细胞周期中显示的效果通过在细胞周期各个时期中显示的细胞排列的％(百分率)变化来进行测定，通过 凤凰多循环软件(Pheonix Multicycler software)(凤凰流式系统，Ph oenix Flow System)决定。 

5、显微镜观察(Microscopy) 

为了观察细胞形态，使用光学显微镜(徕卡显微系统，Leica Mi crosystems)将细胞可视化。使用佳能数码照相系统(Cannon Digital Camera system)(型号：Power Shot S45)对影像进行捕捉。 

6、cDNA合成及PCR扩增 

各细胞(1×10⁵细胞)接种于6孔培养板中，培养1天后，使用本发明的辣木叶提取物处理各细胞。继续培养2天后，通过使用高纯RNA分离纯化试剂盒(High Pure RNA isolation kit，Roche，Cat.No.11828665001)从各细胞分离出总RNA。为了使用oligo dT从总RNA(1g)中生产cDNA，利用了cDNA合成试剂盒(cDNA synthe sis kit，Maxim RT Premix Kit-Oligo dT引物，iNtRON生物技术公司，韩国)。最终，cDNA通过使用Maxim PCR Premix Kit-iTaq(i NtRON生物技术公司，韩国)由引物进行扩增。使用的各引物的碱基序列在表3中示出。扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶(1.5％)电泳分析。其结果通过UV光(智能凝胶显影分析系统，Smart gel im aging analysis system，北京赛制创业科技有限公司)可视化。 

表3 

7、免疫蛋白印迹分析(Western blot analysis) 

各细胞(1×10⁵细胞)接种于6孔培养板中，培养1天后，使用本发明的辣木叶提取物处理各细胞。继续培养2天后，为了进行蛋白免疫印迹分析，重新收集细胞并将其裂解(lysed)。用于蛋白免疫印迹分析的抗体均购自生物信号技术公司(Cell Signalling Technology)[β-actin:Cat.No.cs4967，Akt:Cat.No.cs9272，p-JNK:Cat.No.cs9251，p-Erk:Cat.No.cs9101，p-IκBα:Cat.No.cs2859，SOX2:Cat.No.cs3579，and cleaved Notch1:Cat.No.cs2421]，from Sant a Cruz Biotechnology[p53:Cat.No.sc-126，cyclinD1:Cat.No.sc-753，Notch1:Cat.No.sc-6014，NF-κB:Cat.No.sc-109，β-catenin:Cat.No.sc-7963and c-Myc:Cat.No.sc-761]，and from Merck Millipore[Oct4:Cat.No.mab4305]。蛋白质浓度通过考马斯亮兰法(Bradford method)(蛋白定量染料浓缩液，Protein Assay Dye Rea gent Concentrate，Bio-Rad Laboratories，Cat.NO.500-0006)决定。细胞裂解后，取相同量的蛋白质(20-80μg)实施8-12％SDS聚丙烯 酰胺凝胶电泳(SDS PAGE凝胶电泳)，按照尺寸分离蛋白质，转移至硝酸纤维膜(沃特曼公司)后使用封闭缓冲液(含有0.1％吐温20的10％脱脂奶粉三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水，TBS-T)在4℃下处理16小时。使用TBS-T洗涤所述膜3次，使用标记有辣根过氧化物酶的2抗在室温下与膜反应2小时，然后使用ECL试剂盒(通用医疗公司，Cat.No.RPN1237)进行可视化。为了确认蛋白质是否转移至硝酸纤维膜，使用丽春红染色液(Ponceau S solution)(西格玛公司，Cat.No.P7170-1L)染色5分钟。使用蒸馏水洗涤染色的膜数次之后，确认了蛋白质的转移。 

8、通过SDS-PAGE凝胶电泳的蛋白质的确认 

各细胞(1×10⁵细胞)接种于6孔培养板中，培养1天后，使用本发明的辣木叶提取物处理各细胞。继续培养2天后，将细胞进行裂解。裂解后，取等量的蛋白质在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，然后利用考马斯亮兰进行染色。染色的凝胶使用甲醇及醋酸的混合溶液进行脱色。将凝胶上的60-80kDa位置的条带切下，利用胰蛋白酶处理。通过凝胶-分解生成的胰蛋白酶分解肽使用与Eksigent-Na no-Ultra UPLC(OmniGrid II，GeneMachines公司，加利福尼亚)连接的LTQ质量分析仪(赛默飞公司，圣荷西，加利福尼亚)进行分析。蛋白质使用UniPort Program(http://www.uniprot.org)进行确认。 

9、微阵列的准备 

针对23753编码序列的所有寡核苷酸以最终浓度为50pmole/μl悬浮于打印缓冲液(printing buffer)(Telechem International公司，美国)。悬浮的寡核苷酸，在40％的湿度、20-25℃的条件下，在硅烷化的载玻片(UltraGAPSTM，康宁生命科学公司，美国马萨诸塞州)上利用点样机器人(robotic microarrayer，OmniGrid II，GeneMachi nes公司，加利福尼亚轴)进行点样。 

10、cDNA探针及微阵列杂交(microarray hybridization)的准 备 

各细胞(1×10⁵细胞)接种于6孔培养板中，培养1天后，使用本发明的辣木叶提取物处理各细胞。继续培养2天后，获得了总RN A。靶标cDNA探针的合成及杂交通过以往公知的方法进行。20μg的各总RNA与5μg的pdN6引物(Amersham Biosciences公司，英国)在15.4μl的没有核糖核酸酶(RNase)的水中混合，在65℃下反应10分钟。cDNA在Cy3-或Cy5-dUTP(1mM each，NEN生命科学制品公司，美国波斯顿)3μL的存在下，在42℃合成2小时。荧光标记的cDNA使用PCR纯化试剂盒(PCR purification kit，凯杰公司)进行纯化。Cy3及Cy5-labeled cDNA使用Microcon YM-30(默克密理博公司，美国)浓缩至最终体积为27μl。含有20μl的20SSC、8μl的1％SDS、24μl的甲醛(西格玛公司，美国)、10μg的鲑鱼精(s almon sperm)DNA(英杰公司(Invitrogen Corp.))及27μl的标记c DNA溶液的杂交混合溶液(80μl)在100℃下加热2-3分钟，随即用于微阵列。所述微阵列在加湿杂交箱(humidified hybridization cham ber，Array Chamber X，基因组树公司，韩国)中，在42℃下杂交12-16小时。杂交的微阵列洗涤后，使用Axon4000B微阵列扫描仪(A xon仪器公司，美国加利福尼亚州)进行定量。 

11、数据的收集及分析 

杂交影像使用GenePix Pro4.0(Axon仪器公司，美国加利福尼亚州)进行定量。测定各斑点的平均荧光密度，并消除了背景。所有数据的一般化及统计分析使用GeneSpring6.1(Silicon Genetics公司，美国)进行。基因在控制通路(control channel)中通过它们的强度(intensity)而被过滤。接着进行强度依赖正常化(Intensity-depende nt normalization，LOWESS)，其比值减少了强度对比曲线的lowess fit残基。倍数变化(fold change)的值是除以通过标化的控制通路强度的中位数而标化的信号通路强度而计算得到。倍数变化的比是在相 关状态(relevant conditions)之间将倍数变化值除以倍数变化值而计算得到，设定2.0以上为具有统计学意义的显著差异。为了发现在试样中表达不同的基因，在p值为0.05或0.01以下时，使用Benjamin i-Hochberg FDR(发现错误率，false discovery rate)补偿法进行参数多态ANOVA测试(parametric anova test)。通过在0附近皮尔逊相关系数(Pearson correlations)为根据的类似度测定而进行阶层式分群法(Hierarchical clustering)。所述相关系数分析使用皮尔逊相关系数(-1至1)进行。从实验导出的微阵列数据从http://218.48.131.23/Servelet/GeNet下载使用。 

12、HFA(中空纤维测试法，Hollow fiber assay) 

中空纤维测试法(HFA)是按照NCI(美国国家癌症研究所，美国)的标准程序(http://dtp.nci.nih.gov/branches/btb/hfa.html)进行。简略说明为，将A549和HepG2个癌细胞系在75cm²的培养皿中进行培养。普通的生长培养基在用具有5×10⁵细胞/ml的优选细胞密度的细胞进行负载之前，先适用具有500kDa的限制分子量的1mm(内部直径)的聚偏氟乙烯中空纤维(HFs)(仕必纯公司，美国德克萨斯州休斯敦)。各个中空纤维(HFs)按照它们的长度，每1.5cm使用热式无齿持针器(hot smooth-jawed needle holder)进行热密封。为了使把持方便，剪切为具有2-mm尾部的片段。在最高的接种密度下分别为1.5cm。每个中空纤维片段包含了大约10⁵个细胞。将纤维放置在包含细胞培养液的6孔培养板上，在采用外科方法移植于6周龄免疫缺陷裸鼠的前1天培养而成(Harlan，Horst，荷兰)。所有小鼠在安装有冷气设施的房间中以12小时的明-暗周期进行饲养，水和饲料自由摄取(Purina5001Rodent Chow；普瑞纳公司，美国密苏里州圣路易斯)，实验小鼠使用舒泰(Zoletil)和隆朋(Rompun)进行麻醉。将中空纤维(HFs)移植到皮下(subcutaneous，SC)部分，并用皮肤用缝合钉缝合切口。各个小鼠在纤维移植3天后，分别使用 不同浓度的辣木叶提取物(MOL extract)口服给药1次(参考图14b)，作为对照组使用阿霉素(doxorubicin，DOX)静脉给药。7天后，回收中空纤维实施了台盼蓝拒染实验(trypan blue exclusion assay)。 

实验例1：对体外癌细胞的辣木叶提取物的抑制效果的确认 

1、根据提取温度及提取时间的辣木叶的癌细胞抑制效果 

为了确认根据提取温度及提取时间的辣木叶提取物对癌细胞的效果，将各个癌细胞使用按照上述实施例制备的辣木叶提取物按照不同浓度进行处理，然后按照下述方法实施MTT分析确认了癌细胞的存活率。 

在96孔板培养基中以每100μl为基准以3×10³的浓度接种细胞。培养一天后，使用实施例1制备的辣木叶提取物以0-400μg/ml的不同浓度处理各个培养板。继续培养1天或2天之后，向各个孔中添加10μl的细胞计数试剂盒-8(Cat.No.CK04，同仁化学研究所，日本)或WST分析试剂(DAEIL LAB SERVICE，韩国)培养4小时。然后使用酶标仪(型号680，Bio-Rad公司)在450nm处测定吸光度。 

(1)根据提取温度的辣木叶提取物的效果 

如图1a所示，对提取时间同样为30分钟、使用不同提取物温度的实施例2、实施例6-9的癌细胞毒性效果进行评价时，可以确认在4℃下的提取物(实施例2)的效果最高。 

(2)根据提取时间的辣木叶提取物的效果 

如图1b所示，对提取温度相同(4℃)、使用不同浸渍时间的实施例1-5的影响癌细胞生存率的效果进行比较时，可以确认提取时间越短对癌细胞的毒性效果越高，尤其提取时间为5分钟时辣木叶提取物的效果最优异。 

以下，下面所有实验中均使用了显示出最好的癌细胞毒性效果的采用提取温度4℃且提取时间5分钟而制备的辣木叶提取物。 

2、使用FACS分析的辣木叶提取物对癌细胞细胞周期变化及细 胞杀灭效果的确认 

为了确认辣木叶提取物对癌细胞产生的细胞周期变化及细胞杀灭效果，使用不同浓度的辣木叶提取物处理A549细胞系处理，48小时之后实施FACS分析。结果确认根据辣木叶提取物的浓度(200、300及400μg/ml)，sub-G1population最大可分别增加21％、65％和93％(参照图2a)。将独立的6号实验的平均sub-G1population在图3中示出。 

对Caspase-3进行免疫印迹反应的结果，辣木叶提取物的处理依赖其提取物的用量而使半胱天冬酶-3下调(down-regulation)，裂解的半胱天冬酶-3上调(up-regulation)(参照图2b)，由此可以确认产生了对癌细胞的杀灭效果。 

此外，为了确认辣木叶提取物对A549细胞系之外的癌细胞的细胞周期变化的影响，进行FACS分析时得到与A549细胞系相似的结果(参照图4)。 

3、辣木叶提取物对癌细胞的毒性效果 

(1)显微镜(microscopy)及集落形成分析(colony forming a ssay) 

使用显微镜(参照图5a)及集落形成分析法(参照图5b)，评价了辣木叶提取物对A549细胞株的毒性效果。如图5a所示，在辣木叶提取物浓度200μg/ml以上时细胞无法附着在培养皿，显示出典型的细胞凋亡形态。 

辣木叶提取物的处理对A549细胞的生存能力的影响，通过集落生存分析来评价。收集用胰蛋白酶处理的细胞，以1×10³细胞的浓度接种于6孔培养皿的各个部分，培养1天后，添加不同浓度的辣木叶提取物，继续培养7天。7天后，集落固定，使用结晶紫(0.1％w/v)染色1分钟，使用蒸馏水洗涤后照相。实验反复进行3次，将具有代表性的结果照片在图5b中示出。 

如图5b所示，可以确认处理了辣木叶提取物的细胞相比没有处理提取物的细胞，A549的存活集落数依赖浓度降低，且在辣木叶提取物浓度100μg/ml以上时没有任何集落存在。此外，为了确认辣木叶提取物对A549细胞系之外的癌细胞的影响，对其他癌细胞进行相同实验时得到与A549细胞系相似的结果(参照图6)。 

(2)细胞迁移性分析(cell migration assay) 

细胞迁移特性通过如下方法分析。在24孔平板内包含聚碳酸酯薄膜掺合物(8μm孔径)，利用CytoSelect24-孔细胞迁移分析试剂盒(Cell Biolabs公司，Cat.No CBA-100-C)进行细胞迁移分析。所述膜起到识别从没有迁移的细胞中通过聚碳酸酯薄膜的气孔迁移的细胞的界限作用。在没有血清的培养基中培养1×10⁵细胞/ml的细胞，分别处理不同浓度的辣木叶提取物之后放置16小时。此后，向迁移板(migration plate)的壁添加含有10％的FBS的培养基0.5ml之后，向上方室(chamber)添加0.3ml的细胞悬浮溶液。培养1天之后，从上方室的内部小心吸收培养基，用棉棒小心擦拭未移动的细胞而将其去除。最终迁移细胞使用细胞染色溶液染色10分钟，照相，并利用酶标仪(型号680，Bio-Rad公司)在560nm波长下测定吸光度(参照图7)。 

结果在细胞迁移性分析中，移动的细胞比例在辣木叶提取物处理的细胞中比没有处理的细胞中低。细胞迁移能力根据量被辣木叶提取物抑制。其迁移率在使用辣木叶提取物300μg/ml处理时减少了87％，400μg/ml处理时减少了99％。 

实验例2：对活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的影响的确认 

为了确认辣木叶提取物对细胞内ROS水平产生的影响，利用了荧光测定。处理辣木叶提取物48小时后，使用对于ROS的生产为细胞透过氧化敏感染料的2′,7′二氯二氢荧光素二乙酸盐(H2DCFDA) (英杰公司)进行测定。羧基二氯荧光素二乙酸盐(DCFH-DA)作为非极性化合物向细胞内结合后，通过细胞的酯酶(esterase)转化为膜非透过性的非荧光性极性衍生物(DCFH)。转化(trapped)的D CFH通过细胞内的过氧化氢迅速氧化为荧光性的2′,7′＝二氯荧光素(DCF)。具体地，将用胰蛋白酶处理的细胞(约1×10⁵细胞)使用P BS洗涤后重悬，使用最终浓度为10μM的DCFH-DA处理。然后将细胞在暗处37℃的条件下培养30分钟，接着使用FACScan(EPIC S XL流式细胞仪，贝克曼库尔特计数器)直接测定ROS的水平。 

结果，处理了辣木叶提取物的细胞相比没有处理的对照组，根据用量诱导了明显的ROS减少。这表明辣木叶提取物具有自由基清除作用(参照图8)。 

实验例3：辣木叶提取物对基因及蛋白质表达产生的影响的分析 

1、作为对照组的管家基因或蛋白质的确认 

为了确认辣木叶提取物对细胞凋亡相关mRNA及蛋白质表达的影响，首先利用RT-PCR和蛋白免疫印迹法分析了作为对照组的管家基因或蛋白质、β-肌动蛋白的表达。虽然使用了相同量的试样，但是在图9a的第1和第2凝胶结果中，处理了300μg/ml辣木叶提取物的细胞相比没有处理的细胞，β-肌动蛋白的表达水平显著降低(参照图9a)。这种现象在反复的实验中持续而反复地被观察到。为了确认在蛋白免疫印迹法中负载了相同量的蛋白质，使用丽春红(西格玛公司)将膜进行染色，从而确认凝胶负载及向膜的蛋白质迁移没有任何问题(参照图9b)。但是为了在此之后的所有试样中控制类似的表达水平，添加了对于300μg/ml的追加RNA或蛋白质，如图9a的第3或第4凝胶中所示。 

2、由于辣木叶水溶性提取物引起的蛋白质及基因的下调分析 

(1)信号通路(signaling pathway) 

对A549处理0-300μg/ml的辣木叶提取物之后，利用RT-PCR或 蛋白免疫印迹法分析了mRNA或蛋白质。Akt、p-IkB、NF-kB、p-Er k、β-连环蛋白及细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)依赖辣木叶提取物用量而显著下调(参照图9c及9d)。但是能够通过炎症信号、ROS水平的变化、紫外线、蛋白质合成抑制剂等多种应激而被活化的Jun核激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNKs)通过辣木叶提取物的处理而增加。 

已公知的是，Sox、Oct4、Klf4、c-Myc强化的表达能够产生iPS细胞(J Vis Exp14：734-735)，SOX2基因的沉默在异体移植的NO D/SCID小鼠中减弱c-MYC、WNT1、WNT2和NOTCH1表达的同时，减少A549细胞的致癌性特性(PLoS One7(5):e36326)。因此调查了Notch1及包含其在活性胞内域的分裂的Notch1的蛋白质或基因的表达。结果，如图9e及9f所示，所有调查的蛋白质均下调。进一步地，mRNA的表达的用量依赖性减少倾向，也与蛋白质的结果一致。 

(2)通过辣木叶提取物的蛋白质的重要下调 

负载相同量的蛋白质，通过丽春红染色确认向膜的蛋白质的正常迁移，但如图9a所示，作为管家基因的β-肌动蛋白的表达显著下调。为了更进一步进行调查，利用SDS-PAGE凝胶电泳进行分析，结果如图10所示，所有条带的强度均相似，与处理的辣木叶提取物的浓度无关。这表明负载到各孔中的蛋白质浓度相似。但是有趣的是，除了位于61.5和90.5kDa之间的几个蛋白质之外，多数蛋白质显示为下调。通过分析发现在这个范围的主要蛋白质为热休克蛋白(heat-s hock proteins)(Heat shock cognate71kDa protein(69kDa)/H eat shock70kDa protein(68kDa)/Heat shock protein HSP90-beta(83kDa)/Heat shock protein，mitochondrial(61kDa))。 

(3)通过辣木叶提取物的基因的重要下调确认-微阵列分析 

利用微阵列，确认了辣木叶提取物产生的所有基因表达图案(如图11)。测试的23753个基因中仅有205个基因(0.9％)上调2倍以 上，90.1％的基因下调，且没有变化的基因为1964个(8.3％)。这种微阵列的结果与上述SDS-PAGE凝胶电泳的结果一致。这可推测为蛋白质的重要下调是由于mRNA表达的下调引起的。相反，大部分与上调基因相关的功能还不明确，没有任何变化的基因的功能在图11c中示出。 

(4)rRNA(ribosomal RNA)的降解(degradation)的确认 

为了分析蛋白质及mRNA的重要下调，在总RNA提取之后通过凝胶电泳调查了rRNA的条带图案(参照图12)。在辣木叶提取物的0和100μg/ml中可以确认两个明显的28S和18S rRNA的普通图案。但在200μg/ml中可以观察到rRNA的部分降解，在300μg/ml中可以观察到重要rRNA的降解(参照图12，左栏)。这种依赖用量的rRN A的降解在凝胶的28S和18S rRNA条带之间显示出了新的条带(表示为1*)形态。除此之外，在辣木叶提取物300μg/ml处理组的细胞中出现的新的条带(表示为2*)在18S rRNA正下方被观察到。综上所述，大部分蛋白质及基因的重要下调是正常的RNA的减少及非正常的RNA的增加两者同时产生的结果。 

实验例4：辣木叶提取物对癌细胞的特异性毒性的确认 

使用MTT分析进行了辣木叶提取物对非癌细胞的普通细胞的毒性效果实验。MTT分析结果显示在癌细胞系A549中显示强毒性(在200μg/ml处理时约为65％)。相同浓度的辣木叶提取物向普通细胞系COS-7(非洲绿猴肾细胞)处理时，其存活能力显示出相比A549显著低的毒性(参照图13)。这表明普通细胞相比癌细胞对辣木叶提取物具有更强的抗性。在300μg/ml以上浓度的辣木叶提取物处理时A549细胞全部无法存活，但普通细胞株COS-7在用600μg/ml浓度的辣木叶提取物处理时仍有50％以上存活。这是由于辣木叶提取物在癌细胞中具有高特异性的毒性导致的结果。 

实施例5：辣木叶提取物对体内癌细胞的抑制效果的确认-中空 纤维分析(Hollow Fiber assay，HFA) 

如上所述，辣木叶提取物在体外具有对癌细胞增殖的抑制作用，且对癌细胞具有高特异性，因此确认了辣木叶提取物在体内是否也抑制癌细胞增殖。为此，向裸鼠移植分别填充A549肺癌细胞和Hep G2肝癌细胞系的中空纤维。3天后，向实验鼠口服给药不同浓度的辣木叶提取物1次，作为对照试药静脉注射了阿霉素(doxorubicin，D OX)。经过10天后，从实验鼠回收中空纤维，实施了台盼蓝拒染试验(trypan blue exclusion assay)(参照图14a)。 

结果显示在辣木叶提取物在体内的对癌细胞的效果与体外的结果一致。具体地，肺癌细胞(A549)中可以确认细胞存活能力的递减(参照图14b，左栏)；在肝癌细胞Hep G2中也可以确认类似的动态分配图。但是肝癌细胞相比A549细胞，确认具有更重要的毒性(图14b，右栏)。此外，在HepG2细胞中辣木叶提取物浓度为200μg/ml时，细胞毒性程度相比对照组阿霉素优异。这表明本发明辣木叶提取物口服给药时在没有额外的吸收补充剂的情况下也容易被吸收，显示出与静脉注射的结果相当的优异结果，因此在今后的口服给药制剂的开发中能够得到应用。 

实验例6：根据提取溶剂的辣木叶提取物的癌细胞凋亡效果分析 

为了确认根据不同提取溶剂的辣木叶提取物的癌细胞凋亡效果，辣木叶分别在蒸馏水、70％的乙醇(比较例1)、100％的DMSO溶液(比较例2)溶剂中提取10分钟后(但是蒸馏水使用4℃的蒸馏水进行提取，其他提取溶剂在室温下提取)，实施了FACS分析。具体地，将辣木叶使用上述溶剂分别提取10分钟后，去除不溶物，过滤提取物，向A549细胞系分别处理0-30μl的提取物，接着培养24小时，然后实施FACS分析。结果可以确认，使用蒸馏水提取的辣木叶提取物相比其他提取溶剂提取的辣木叶提取物(比较例1、比较例2)，具有更优异的A549细胞凋亡效果(参照图15)。 

制剂例 

以下例示本发明组合物的制剂例。下面辣木叶提取物是指根据本发明的辣木叶提取物。 

制剂例1：散剂的制备 

辣木叶提取物20mg 

乳糖100mg 

滑石10mg 

将上述成分进行混合填充于气密包中，从而制备散剂。 

制剂例2：片剂的制备 

辣木叶提取物10mg 

玉米淀粉100mg 

乳糖100mg 

硬脂酸镁2mg 

制剂例3：胶囊的制备 

辣木叶提取物10mg 

结晶性纤维素3mg 

乳糖14.8mg 

硬脂酸镁0.2mg 

按照通常的胶囊制备方法将上述成分进行混合填充于明胶胶囊中，从而制备胶囊剂。 

制剂例4：注射剂的制备 

辣木叶提取物10mg 

甘露醇180mg 

注射用灭菌蒸馏水2974mg 

Na₂HPO₄·12H₂O26mg 

按照通常的注射剂的制备方法，制备为每1安瓿(2ml)含有上述含量的成分。 

制剂例5：保健饮料的制备(食品组合物的制备) 

辣木叶提取物100mg 

葡萄糖10mg 

柠檬酸0.6g； 

及液状寡糖25g 

将上述成分混合之后添加300ml的纯化水，分别以每瓶200ml填充到瓶中，然后在130℃下灭菌4-5秒，从而制得饮料。