吲哚异羟肟酸和吲哚啉异羟肟酸于治疗心脏衰竭或神经损伤的用途

摘要

在此揭示某些小分子的新颖用途，特别是具有吲哚基或是吲哚啉基的异羟肟酸(hydroxamate)化合物的新颖用途。此吲哚异羟肟酸和吲哚啉异羟肟酸化合物可做为先导化合物，来制备用以治疗心脏衰竭或神经损伤的药剂或药学组合物。

说明书

技术领域

本发明是有关于一种小分子的新颖用途，且特别是具有吲哚基 或是吲哚啉基之异羟肟酸(hydroxamates)化合物的新颖用途，此类 化合物可做为先导化合物来制备用以治疗心脏衰竭或神经损伤的 药剂或药学组合物。

背景技术

心脏衰竭乃是心脏无法提供充足的血液与氧气至体内其它组 织时所引起的心血管疾病。在已开发国家中，患有心脏衰竭的人 占人口总数的2％，且其患病率随着年龄增加而呈现上升趋势。目 前，造成年龄65岁以上个体住院的最主要原因是心脏衰竭，此外， 此疾病亦为医疗照护成本提升的主要因素。目前心脏衰竭的治疗 方法，主要是透过药剂来恢复心脏功能，例如血管收缩素转化酶 抑制剂(angiotensin converting enzyme(ACE)inhibitors)、血管紧 缩素II受体拮抗剂(angiotensin II receptor blockers，ARBs)、利尿 剂(diuretics)、毛地黄糖苷(digitalis glycosides)、β-受体阻断剂 (beta blocker)以及直接作用的血管扩张剂(direct acting  vasodilators)，用以改善血管收缩能力。然而，使用药物经常伴随 有副作用(例如高血压、肾功能异常以及身体活动障碍)产生，造成 使用药物上的限制。对于药物治疗无效之严重心衰竭患者，或可 采用换心手术为其治疗方法。然而，目前器官捐赠者的来源及数 量仍极为有限。

中风、挫伤或缺氧所造成的脑和脊髓损伤，往往会造成人们 终身瘫痪或提前死亡。因此，在大多数国家中，创伤性脑损伤 (Traumatic Brain injury，TBI)和缺血性脑梗塞为二种严重的公共 健康议题。在美国，与TBI相关事件的次数(包含，死亡，住院和 急诊等)，每年估计约有170万件；此外，在伤害所造成的死亡案 例中，TBI占有三成(30.5％)(每年约52,000人死亡)。而在美 国，缺血性脑梗塞为排名第4大的死亡原因，其亦为导致长期瘫痪 的主因。美国每年约有795,000人患有脑中风(stroke)，而依据2008 年的死亡原因统计，其中每18位中就有一位是死于脑中风。此外， 未来预计在2000至2032年间，缺血性脑梗塞的死亡人数将增加一 倍。预测显示在2030年，人的一生罹患脑中风的机率将增加至25 ％，换句话说，仅在美国就有400万人将罹患有脑中风。

有鉴于此，相关领域需要一种可改善或恢复心脏功能的药剂 或化合物；或是一种可降低或预防因为中风、缺氧或创伤型脑损 伤所造成的神经失调的药剂或化合物。

发明内容

本发明至少部分是基于不可预期地发现到，具有以下结构的 式(I)化合物能有效地恢复或改善受试个体(例如，人类)的心脏 功能或是保护神经细胞不致受损，

其中B可以是R、C(O)R、CH₂R、SO₂R、SO₃R或SO₂NRR’；C 可以是R、C(O)R、CH₂R、SO₂R或CH=CHC(O)NHOH；X_a、X_b、 X_c和X_d分别可以是R、卤素(halogen)、硝基(nitro)、亚硝基 (nitroso)、OR或CH=CHC(O)NHOH；以及R和R’分别可以是氢、 烷基(alkyl)、烯基(alkenyl)、炔基(alkynyl)、芳香基(aryl)或杂芳 基(heteroaryl)。于一实施例中，C、X_a、X_c和X_d分别可以是氢； B可以是SO₂R；以及X_b可以是CH=CHC(O)NHOH。因此，式 (I)化合物具有成为治疗心衰竭或神经损伤药剂之先导化合物的 潜力。依据本揭示内容的实施方式，心脏衰竭系由心肌纤维化 (cardiac fibrosis)、高血压(hypertension)、心肌梗塞(myocardial  infarction)、心肌缺血(myocardial ischaemia)、扩大性心肌病变 (dilated cardiomyopathy)、肥厚性心肌病变(hypertrophic  cardiomyopathy)、限制性心肌病变、(restrictive cardiomyopathy)、 压力性心肌病变(stress cardiomyopathy)、糖尿病性心肌病变 (diabetic cardiomyopathy)或特发性心肌病变(idiopathic  cardiomyopathy)所引起的。而神经损伤则系由TBI或缺血性脑梗 塞所引起。

本发明第一方面旨在提供一种治疗心脏衰竭或神经损伤的方 法，此方法包含对一个体投予一治疗有效量的式(I)化合物：

其中B可以是R、C(O)R、CH₂R、SO₂R、SO₃R或SO₂NRR’；C 可以是R、C(O)R、CH₂R、SO₂R或CH=CHC(O)NHOH；X_a、X_b、 X_c和X_d分别可以是R、卤素(halogen)、硝基(nitro)、亚硝基 (nitroso)、OR或CH=CHC(O)NHOH；以及R和R’分别可以是氢、 烷基(alkyl)、烯基(alkenyl)、炔基(alkynyl)、芳香基(aryl)或杂芳 基(heteroaryl)。于一实施例中，C、X_a、X_c和X_d分别可以是氢； B可以是SO₂R；以及X_b可以是CH=CHC(O)NHOH。

所述的个体可以是哺乳类动物，较佳为人。心脏衰竭系由心 肌纤维化、高血压、心肌梗塞、心肌缺血、扩大性心肌病变、肥 厚性心肌病变、限制性心肌病变、压力性心肌病变、糖尿病性心 肌病变或特发性心肌病变所引起的。而神经损伤系由TBI或缺血性 脑梗塞所引起。

在某些实施方式中，给予该个体的剂量为该个体每公斤体重1 至100mg(以下表示为mg/Kg)，给药途径可为注射，如静脉注射 或肌肉注射。在特定实施方式中，利用静脉注射的方式将约10至 100mg/Kg的药剂给予个体(例如，将30mg/Kg的药剂给予个体)。 在给药时，可利用单一试剂或分成多个试剂来给足所需剂量。

在某些实施方式中，所提出的方法更包含在对个体投予本发 明化合物之前、同时和/或之后，对该个体投予一种已知可改善心 脏功能的药剂。此类改善或恢复心脏功能的药剂的实施例包括， 但不限于，血管收缩素转化酶抑制剂、血管紧缩素II受体拮抗剂、 利尿剂、毛地黄糖苷、β-受体阻断剂以及直接作用的血管扩张剂。 于其它实施方式，所提出的方法更包含在对个体投予本发明的化 合物之前、同时和/或之后，对该个体投予一种已知可改善神经损 伤症状的药剂。此类药剂的实施例包括，但不限于：活性氧清除 剂(reactive oxygen scavenger)、抗凝固剂(anticoagulant)及其它类 似物。

有鉴于此，本发明第二方面提供了使用上述式(I)化合物来 制造供治疗心脏衰竭或神经损伤之药剂或药学组合物的用途；上 述药剂或药学组合物包含一治疗有效量之上述式(I)化合物；以 及一药学上可接受的赋型剂。

在所述药学组合物中，本发明化合物的含量为总重量的约 0.1％至99％(重量％)。在某些实施方式中，本发明化合物含量至 少为药学组合物总重量的1％(重量％)。在一些实施方式中，本 发明化合物含量至少为药学组合物总重量的5％(重量％)。在另 一些实施方式中，本发明化合物含量至少为药学组合物总重量的 10％(重量％)。在又另一些实施方式中，本发明化合物含量至少 为药学组合物总重量的25％(重量％)。

在某些实施方式中，本发明上述药剂或药学组合物更包含一 种已知药物，可用来改善或恢复心脏功能，可在对个体投予本发 明的化合物之前、同时和/或之后，对该个体施用。此类改善或恢 复心脏功能的药剂的实施例包括，但不限于：血管收缩素转化酶 抑制剂、血管紧缩素II受体拮抗剂、利尿剂、毛地黄糖苷、β-受 体阻断剂、直接作用的血管扩张剂以及其它类似物。在某些实施 方式中，本发明的上述药剂或药学组合物更包含一种已知药物， 可用来改善神经损伤，可在对个体投予本发明的化合物之前、同 时和/或之后施用。此类药剂的实施例包括，但不限于：活性氧清 除剂、抗凝固剂及其它类似物。

下文的实施方式说明了本发明之一或多种实施方式的细节。 可由实施方式与权利要求范围而了解本发明的其它特征与优点。

附图说明

为让本发明的上述与其它目的、特征、优点与实施例能更明 显易懂，所附图式的说明如下：

第1图为依据本发明一实施方式，对正常大鼠或HF大鼠施用载 体或本发明化合物1进行治疗后其心脏形态的照片。

第2图为依据本发明一实施方式，对HF大鼠施用载体或本发明 化合物1后其心脏尖部组织经过梅生三色染色(Masson trichrome) 后的胶原蛋白沉积的照片。

第3图为依据本发明一实施方式，对HF大鼠施用载体或本发明 化合物1后其心脏ANP表现量的柱状图。

第4图为依据本发明一实施方式，如何评估挫伤体积的流程图。

第5图为依据本发明一实施方式，对TBI个体施用化合物1或丙 戊酸后其挫伤区域的变化。

第6图为依据本发明一实施方式，对TBI个体施用化合物1或丙 戊酸后其行为功能的变化。

第7A图为依据本发明一实施方式，在MCAO后，分别在30分钟、 2小时或4小时，对大鼠施用本发明化合物1或VAP后其缺血梗塞区 域的变化。

第7B图为依据本发明一实施方式，在MCAO后，分别对大鼠 施用本发明化合物1约30分钟、2小时、4小时或24小时后，其缺血 梗塞区域的变化。

第8图为依据本发明一实施方式，对MCAO大鼠施用载体或本 发明化合物1后其CREB正调节的结果。

具体实施方式

发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本 揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概 述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本 发明的范围。发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅 读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容 的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件 或界定本发明的范围。

本发明至少部分是基于不可预期地发现具有以下结构的式 (I)化合物，能有效的恢复受试个体心脏组织的血液循环或提供 神经保护活性，

其中B可以是R、C(O)R、CH₂R、SO₂R、SO₃R或SO₂NRR’； C可以是R、C(O)R、CH₂R、SO₂R或CH=CHC(O)NHOH；X_a、X_b、 X_c和X_d分别可以是R、卤素(halogen)、硝基(nitro)、亚硝基 (nitroso)、OR或CH=CHC(O)NHOH；以及R和R’分别可以是氢、 烷基(alkyl)、烯基(alkenyl)、炔基(alkynyl)、芳香基(aryl)或杂芳 基(heteroaryl)。于一实施例中，C、X_a、X_c和X_d分别可以是氢； B可以是SO₂R；且X_b可以是CH=CHC(O)NHOH。

因此，式(I)化合物具有成为治疗心衰竭或神经损伤药剂的 先导化合物的潜力。心脏衰竭系由心肌纤维化、高血压、心肌梗 塞、心肌缺血、扩大性心肌病变、肥厚性心肌病变、限制性心肌 病变、压力性心肌病变、糖尿病性心肌病变或特发性心肌病变所 引起的。此外，式(I)化合物能有效的提供个体的神经保护能力； 因此，这些活性化合物具有成为治疗神经损伤(例如，挫伤性脑部 外伤(traumatic brain injury，TBI)或缺血性脑梗塞)药剂的先导化 合物的潜力。

有鉴于此，本发明提供一种治疗神经损伤(例如，挫伤性脑部 外伤(TBI)或缺血性脑梗塞)的方法，此方法包含对一个体投予治疗 有效量的式(I)化合物。

TBI往往造成极高的伤亡数目以及产生永久性伤害。发生TBI 的原因包括，但不限于，摔伤、车祸和暴力。TBI是指因头部碰击、 打击、撞击或穿透头部而受伤，致扰乱正常脑部功能。但并非所 有的打击或撞击皆会导致TBI发生。此外，TBI会影响一个体的生 理、认知、情绪和行为，其所造成的结果或严重程度包括完全康 复、永久性伤害或死亡。再者，神经行为缺陷，特别是认知功能 受损，往往是伴随TBI而来之最常见的功能损害。因此，能有效的 改善神经行为缺损的化合物，具有可作为TBI治疗药剂或组合物的 潜力。

缺血性脑梗塞(ischemic stroke)肇因于供应至脑部的血液量减 少，因而导致该区域的脑部组织功能丧失。主要由四种原因引起， 例如，血栓(局部性形成血块造成血管阻塞)；栓塞(由身体其它部 分产生的栓块而造成阻塞)；系统性血液灌流不足(一般的血液供 应减少(例如，休克))，以及静脉栓塞。已知脑部缺血会诱发 环化单磷酸腺苷酸反应组件结合蛋白(cAMP response  element-binding protein，CREB)大量被磷酸化，以及神经元中由 CREB-调控基因所编码产生之神经保护性分子被大量表现 (Kitagawa K.，FEBS J.2007274(13)：3210-7)。因此，本发明化合 物能有效的活化CREB磷酸化，成为有效的先导药物以减缓缺血性 脑梗塞。

本揭示内容亦提供一种治疗心脏衰竭的方法，此方法包含对 一个体投予一治疗有效量的式(I)化合物。该心脏衰竭系由心肌 纤维化、高血压、心肌梗塞、心肌缺血、扩大性心肌病变、肥厚 性心肌病变、限制性心肌病变、压力性心肌病变、糖尿病性心肌 病变或特发性心肌病变所引起的。

心脏衰竭是一通用名词，其可能发展成为多种复杂的状况， 影响心脏正常功能(例如，泵血功能)；导致心脏衰竭的原因如 下所示：

(I)心脏纤维化：心脏纤维化系由于心脏纤维母细胞不适当的 增生导致心脏瓣膜异常增厚。此增厚将伴随心脏纤维母细胞丧失 弹性，最终导致心脏衰竭。

(II)高血压：高血压是一种慢性心血管疾病，使全身动脉血 压上升。因动脉血管压力增加，使得患有高血压之个体的心脏难 以输出血液，随着日月累积，导致心脏衰竭。

(III)心肌梗塞：心肌梗塞(mycardial infarction，MI)或急性心 肌梗塞(acute mycardial infarction，AMI)，俗称心脏病发作 (heart-attack)，是冠状动脉突然阻塞造成心肌坏死。严重的心肌梗 塞将造成心脏衰竭。

(IV)心肌缺血：心肌缺血或缺血性心脏病(schemic heart  disease，IHD)是一种因心脏肌肉血液供应量减少所造成的疾病， 通常发生于冠状动脉狭窄的患者身上。

(V)心肌病(Cardiomyopathy)：心肌病是一种心脏肌肉 (myocardium)疾病，通常与心脏泵血不良有关。可以依据不同病因 来将心肌病加以分类。心肌病包含，但不限于，扩大性心肌病变、 肥厚性心肌病变、限制性心肌病变、、压力性心肌病变、糖尿病 性心肌病变或特发性心肌病变。在扩大型心肌病变中，具有部分 的心肌被扩张；因此，心脏变得虚弱且被扩大，而导致心脏无法 有效的泵血。肥厚性心肌病变，包含心室的心脏肌肉增厚且扩大， 导致心室的尺寸缩小。病理性的肥大，会导致心脏衰竭，而非病 理性的(例如，心因性的肥厚)，则不会导致心脏衰竭。限制性心肌 病为心肌病的一种，其脏壁不具弹性，使心脏的伸展，以及血液 的填充受到限制。随着时间演进，限制性心肌病变的患者心脏舒 张功能将产生障碍，最终导致心脏衰竭。压力性心肌病变或压力 诱导的心脏病变，是一种非缺血性心肌病，此类型的心肌病会产 生一突然暂时性的心肌虚弱，此为常见导致急性心脏衰竭的原因。 糖尿病心肌病为一种糖尿病患者所具有的心脏肌肉疾病，可导致 心脏功能丧失，无法有效地将血液经循环系统输送至身体各处， 则此状况为心脏衰竭。此外，其它心肌病皆可能导致心脏衰竭的 发生。

本发明化合物包括但不限于以下化合物1-10：

本发明化合物，特别是式(I)化合物，可以依据美国专利申 请案第13/074,312号(Chen et al on March29，2011)所述方法合成， 此先申请案的内容，已纳入为本案参考文献。举例而言，本发明 的化合物3-(1-苯磺酰-1H-吲哚-5-基)-N-羟基-丙烯酰胺可以依据 陈发明人等人所揭示的流程2(Scheme2)的方法进行合成。

治疗心脏衰竭或神经损伤的方法包含以下步骤，包含对该个 体投予一治疗有效量的式(I)化合物(如上述)。在一较佳实施 方式中，该化合物是3-(1-苯磺酰-1H-吲哚-5-基)-N-羟基-丙烯酰 胺。

该个体可以是哺乳类动物，包含但不限于，小鼠、大鼠、兔 子、山羊、绵羊、马、牛、猪、狗、猫、猴子、黑猩猩和人类。 较佳是，该个体为人。该心脏衰竭可以由以下任一心肌纤维化、 高血压、心肌梗塞、心肌缺血、扩大性心肌病变、肥厚性心肌病 变、限制性心肌病变、压力性心肌病变、糖尿病性心肌病变或特 发性心肌病变所引起的。

在某些实施方式中，可利用注射(如静脉注射或肌肉注射) 将式(I)化合物投予个体，剂量为约1至100mg/Kg间。经由静脉 注射投予个体的剂量为约10、20、30、40、50、60、70、80、90 或100mg/Kg，较佳为约30至70mg/Kg间，如30、40、50、60或70 mg/Kg。在给药时，可采用单一剂量或分成多剂量来给足所需剂量。

在某些实施方式中，所提出的方法更包含在对个体投予本发 明化合物之前、同时和/或之后，对该个体投予一种已知可改善心 脏功能或神经损伤症状的药剂。此类改善或恢复心脏功能的药剂 的实施例包括，但不限于：血管收缩素转化酶抑制剂、血管紧缩 素II受体拮抗剂、利尿剂、毛地黄糖苷、β-受体阻断剂、直接作 用的血管扩张剂(direct acting vasodilators)以及本领域已知的其 它类似药物。ACE抑制剂的实施例包含，但不限于，卡托普利 (captopril)、依那普利(enalapril)、利欣诺普(lisinopril)、雷米普利 (ramipril)以及其它类似药物。血管紧缩素II受体拮抗剂的实施例 包含，但不限于，缬沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisarta)、洛 沙东(losartan)、艾比沙坦(irbesartan)、阿齐沙坦(azilsartan)、奥 美沙坦(olmesartan)和其它类似药物。利尿剂的实施例包含，但不 限于，弗洛西迈(furosemide)、布米他奈(bumetanide)、托拉塞米 (torsemide)、氢氯苯噻(hydrochlorothiazide)、美托拉腙 (metolazone)、螺环固醇内酮(spironolactone)和其它类似药物。毛 地黄糖苷的实施例包含，但不限于，毛地黄毒素(digitoxin)、毛地 黄(digoxin)、拉诺辛(lanoxin)和其它类似药物。β-受体阻断剂的 实施例包含，但不限于，醋丁洛尔(acebutolol)、比索洛尔 (bisoprolol)、博立克(esmolol)、普潘奈(propranolol)、阿替洛尔 (atenolol)、拉贝洛尔(labetalol)、卡利索普若多锭(carvedilol)、美 多心安(metoprolol)、奈必洛尔(nebivolol)、布新洛尔(bucindolol) 和其它类似药物。直接作用的血管扩张剂的实施例包含，但不限 于，肼酞嗪(hydralazine)、二硝酸异山梨醇(isosorbide dinitrate)和 其它类似药物。可以改善神经受损症状的药物，包含，但不限于， (reactive oxygen scavenger，ROS)、抗凝固剂和其它类似药物。活 性氧清除剂的实施例，包含但不限于，催化酶(catalase)、超氧歧 化酶(superoxide dismutase，SOD)、N-第三丁基-α-苯基硝酸灵 (alpha-phenyl-N-tert-butylnitrone，PBN)、维生素E(vitamine E)、 维生素C(vitamine C)、多酚性化合物(polyphenolic compounds)、 类胡萝匐素(carotenoids)和其它类似药物。抗凝固剂的实施例包 含，但不限于，维生素K(vitamine K)、华法林(warfarin)、醋硝香 豆醇(acenocoumarol)、肝素(heparin)、阿司匹林(aspirin)、氯吡格 雷(clopidogrel)、二吡待摩(dipyridamole)和其它类似药物。

本揭示内容提供一种可用来治疗患有心脏衰竭或神经损伤的 个体之药学组合物；上述药学组合物包含一种治疗有效量的上述 式(I)化合物；以及一药学上可接受的赋型剂。在一实施方式中， 此药学组合物也可作为用来治疗患有心脏衰竭或神经损伤之非人 类哺乳动物的兽医用药。

一般来说，本发明式(I)化合物的含量占整体药学组合物重 量的约0.1％至99％(重量％)。在某些实施方式中，本发明式(I) 化合物的含量占整体药学组合物重量的至少1％(重量％)。在一 些实施方式中，本发明式(I)化合物的含量占整体药学组合物重 量的至少5％(重量％)。在另一些实施方式中，本发明式(I)化 合物的含量占整体药学组合物重量的至少10％(重量％)。在又另 一些实施方式中，本发明式(I)化合物的含量占整体药学组合物 重量的至少25％(重量％)。

在某些实施方式，本发明所述的药物组合物更包含一种已知 可用于改善心脏或神经损伤症状的药剂。此类可改善或恢复心脏 功能药剂的实施例包括，但不限于：此类改善或恢复心脏功能的 药剂的实施例包括，但不限于：血管收缩素转化酶抑制剂、血管 紧缩素II受体拮抗剂、利尿剂、毛地黄糖苷、β-受体阻断剂、直 接作用的血管扩张剂以及本领域已知的其它类似药物。血管收缩 素转化酶抑制剂抑制剂的实施例包含，但不限于，卡托普利 (captopril)、依那普利(enalapril)、利欣诺普(lisinopril)、雷米普利 (ramipril)以及其它类似药物。血管紧缩素II受体拮抗剂的实施例 包含，但不限于，缬沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisarta)、洛沙 东(losartan)、艾比沙坦(irbesartan)、阿齐沙坦(azilsartan)、奥美 沙坦(olmesartan)和其它类似药物。利尿剂的实施例包含，但不限 于，弗洛西迈(furosemide)、布米他奈(bumetanide)、托拉塞米 (torsemide)、氢氯苯噻(hydrochlorothiazide)、美托拉腙 (metolazone)、螺环固醇内酮(spironolactone)和其它类似药物。毛 地黄糖苷的实施例包含，但不限于，毛地黄毒素(digitoxin)、毛地 黄(digoxin)、拉诺辛(lanoxin_和其它类似药物。β-受体阻断剂的 实施例包含，但不限于，醋丁洛尔(acebutolol)、比索洛尔 (bisoprolol)、博立克(esmolol)、普潘奈(propranolol)、阿替洛尔 (atenolol)、拉贝洛尔(labetalol)、卡利索普若多锭(carvedilol)、美 多心安(metoprolol)、奈必洛尔(nebivolol)、布新洛尔(bucindolol) 和其它类似药物。直接作用的血管扩张剂的实施例包含，但不限 于，肼酞嗪(hydralazine)、二硝酸异山梨醇(isosorbide dinitrate)和 其它类似药物。可以改善神经受损症状的药物，包含，但不限于， 活性氧清除剂(reactive oxygen scavenger，ROS)、抗凝固剂、和其 它类似药物。活性氧清除剂的实施例，包含，但不限于，催化酶 (catalase)、超氧歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、N-第三-丁 基-α-苯基硝酸灵(alpha-phenyl-N-tert-butylnitrone，PBN)、维生素 E(vitamine E)、维生素C(vitamine C)、多酚性化合物(polyphenolic  compounds)、类胡萝匐素(carotenoids)和其它类似药物。抗凝固剂 的实施例包含，但不限于，维生素K(vitamine K)、华法林 (warfarin)、醋硝香豆醇(acenocoumarol)、肝素(heparin)、阿司匹 林(aspirin)、氯吡格雷(clopidogrel)、二吡待摩(dipyridamole)和其 它类似药物。

可根据众所接受的药学制程来制备上述药剂或上述药学组合 物，如Remington’s Pharmaceutical Sciences(17th edition，ed. Alfonoso R.Gennaro，Mack Publishing Company，Easton，Pa (1985))中所述的制程。药学上可接受的赋型剂系指可和制剂中其 它成分兼容且与生物体兼容者。

本发明化合物(如，上述式(I)化合物)可经由口服(orally)、 肠胃外(parenterally)、穿皮膜(transdermally)、直肠(rectally) 或吸入(inhalation)等方法给药，给药时可单独给药或并同传统 药学上可接受的赋型剂一起给药。在较佳实施方式中，可经由肠 胃外给药的方式将本发明化合物投予该个体。

可将本发明化合物配方成液态药学组合物，例如成为一种无 菌溶液或悬浮液，并可利用诸如静脉注射、肌内(intramuscular) 注射、皮下(subcutaneous)注射、腹腔内(intraperitoneal)注射 方式来施用。可用来制造无菌注射溶液或悬浮液的适当的稀释液 或溶剂包含，但不限于，1，3-丁二醇(1，3-butanediol)、木蜜醇 (mannitol)、水(water)、林格溶液(Ringer’s solution)以及等渗压氯 化钠溶液(isotonic sodium chloride solution)。脂肪酸，例如油酸 (oleic ac id)与其甘油化物衍生物(glyceride derivatives)皆可用来 制备注射液，如天然的、药学上可接受的油，例如橄榄油(olive oil) 或菎麻油(castor oil)。这些油溶液或悬浮液可以包含醇类稀释液或 羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose)或其它类似的分散剂。其 它常用的表面活性剂，如Tweens或Spans或其它相似的乳化剂或常 见用以制造药学上可接受剂型的可提高生物可利用性的药剂 (bioavailability enhancers)，皆可被用来调制配方。口服给药可以 采用固态或液态的剂型。口服给药的固体剂型包含囊剂、锭剂、 粒状、粉状、颗粒状、胶状和糊状。在此固态剂型，可将活性成 分与至少一常用的惰性稀释溶液混合，例如纤维素(cellulose)、 硅胶(silica)、蔗糖(sugars)、乳糖(lactose)、淀粉(starch) 或改良淀粉(modified starch)。此剂型(例如，颗粒状)可以包含 其它惰性稀释液以外的物质(例如，润滑剂(硬脂酸镁(magnesium  stearate)))或一般的缓冲溶剂。此外，锭剂和粒剂还可以额外的 包覆一般的肠衣。

依据本揭示内容某些实施方式，固态制剂可以制备成大丸药 (bolus)，供兽医医药使用。于兽医医药领域，大丸药通常是指较 大的粒剂(＞5克)，或一固态的即可吞(ready-to-swallow)药物制 剂，可以口服方式给药。在一较佳的实施方式，大丸药包含治疗 有效量的一种上述式(I)化合物；以及一种药学上可接受的盐类。 因此，大丸药包含式(I)化合物的含量为至少100mg，较佳为至 少1,000mg，更佳为至少1,500mg。从实用的观点而言，作为兽医 医药用途的药学组合物可以含有，例如，式(I)化合物，其含量 介于1,000至5,000mg间。

可将本发明上述药剂或药学组合物配制成多种可供局部表面 给药(topical application)的剂型。此时可使用多种相关领域所 熟知之皮肤学上可接受的惰性赋型剂。上述局部表面给药的组合 物的形式包括液体(liquids)、乳霜(creams)、乳液(lotions)、 乳膏(ointments)、凝胶(gels)、喷剂(sprays)、气雾剂(aerosols)、 皮肤贴片(skin patches)及与上述类似者。常用的惰性赋型剂如 水、乙醇(ethyl alcohol)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、 丙二醇(propylene glycol)、矿物油(mineral oil)、硬脂醇(stearyl  alcohol)及其它可形成胶状物的材料。所有上述剂型与赋型剂皆 为药学领域所熟知。对于此处所述的组合物的效果而言，剂型的 选择并非关键。

亦可将本发明上述药剂或药学组合物制成多种适用于黏膜给 药(mucosal application)的剂型，如经颊(buccal)和/或舌下 (sublingual)药物剂型单元，以递送药物穿过口腔黏膜。可使用 多种生物可降解且药学可接受的高分子赋型剂，此种赋型剂可使 得药学组合物具有可接受的吸附效果以及所欲的药物释放模式， 且可和经颊和/或舌下药物剂型单元中所含的欲施用活性成分或其 它成分兼容。一般来说，上述的高分子赋型剂包含亲水性聚合物， 其可黏附至口腔黏膜的湿润表面。高分子赋型剂的实施例包括但 不限于丙烯酸聚合物与共聚物(acrylic acid polymers and  copolymers)；水解聚乙烯醇(hydrolyzed polyvinylalcohol)；聚 乙烯氧化物(polyethylene oxides)；聚丙烯酸酯(polyacrylates)； 乙烯聚合物与共聚物(vinyl polymers and copolymers)；聚乙烯 吡咯啶；葡萄糖(dextran)；瓜胶(guar gum)；果胶(pectins)； 淀粉；及纤维素聚合物(cellulosic polymers)。

本揭示内容提供数种治疗患有心脏衰竭或神经外伤的哺乳类 的方法，所述哺乳类，较佳为人。此方法包含投予其中包含如上 述化学式所示化合物的本发明药剂或药学组合物。本发明化合物 或药学组合物可施用于哺乳类，较佳为人类身上。可利用任何可 将一或多活性成分有运送至适当或所欲作用位置的途径，将此类 药剂或组合物施用予一哺乳类动物(较佳为人类)，上述途径如 口腔给药、鼻腔给药、肺部(pulmonary)给药、穿皮膜给药(如 被动或离子电渗透(iontophoretic)给药)或肠胃外给药(如直肠 注射、栓剂(depot)、皮下注射、静脉注射、肌肉内注射、鼻腔 内(intranasal)注射、小脑内注射，或使用眼药水(ophthalmic  solution)或乳膏)。更有甚者，可于施用本发明的化合物的同时 施用其它活性成分。

当可理解，本发明化合物的治疗有效量会因患者而有所不同， 这不仅是因为所选择的特定化合物或药学组合物、给药途径以及 所选化合物(单独使用或和一或更多种药物并同使用)在患者体 内引发所欲反应的能力，同时也还可能受到其它因素的影响，这 些因素包括所欲减轻的疾病的状态或情况的严重性、患者的年龄、 性别、体重、欲治疗患者的当前状态与病理状况的严重程度、患 者同时进行的医疗行为或之后所实行的特殊饮食，以及本领域技 术人员可想见的其它因素，因此适当的剂量最终仍须由负责照料 的医事人员来判定。可调整给药的剂量与模式，以提供更佳的疗 效。此外，治疗有效量亦指该化合物或组合物的任何毒性或负面 效果不会超出该化合物的正面有利效果。在较佳的情形中，可在 一段适当的时间内施用适量的本发明上述化合物或组合物，以减 低患者出现的症状次数和/或严重性。

以下为本说明书中所用特定名词的说明。除非另有所述，所 有本文中所使用的技术及科学用语具有本发明领域一般技艺人士 一般了解的意义。

在此处单数型式「一」以及「该」等涵盖复数名词，除非本 说明书另有规定者外。

在此处所述的「烷基」(alkyl)，系指含有1-20个碳原子的直链 或支链状的单价碳氢化合物(例如，C1-C10)。烷基的实施例包 含，但不限于，甲基、乙基、正-丙基(n-propyl)、异丙基(i-propyl)、 正-丁基(n-butyl)、异丁基(i-butyl)和第三丁基(tert-butyl)。在此处 所述的「烯基」(alkenyl)，系指含有2-20个碳原子的直链或支链状 的单价碳氢化合物(例如，C2-C10)，且具有一个或多个双键。 烯基的实施例包含，但不限于，乙烯(ethenyl)、丙烯基(propenyl)、 烯丙基(allyl)、1，4-丁二烯基(1，4-butadienyl)。在此处所述的「炔 基」(alkynyl)，系指是指含有2-20个碳原子的直链或支链状的单价 碳氢化合物(例如，C2-C10)且具有一或大于三个键结。炔基的 实施例包含，但不限于，乙炔基、1-丙炔基(1-propynyl)、1-丁炔 基及2-丁炔基(1- and 2-butynyl)和1-甲基-2-丁炔基 (1-methyl-2-butynyl)。在此处所述的「烷氧基」(alkoxyl)，系指 O-烷自由基(O-alkyl radical)。烷氧基的实施例包含，但不限于， 甲氧基(methoxy)、乙氧基(ethoxy)、正-丙氧基(n-propoxy)、异丙 氧基(isopropoxy)、正-丁氧基(n-butoxy)、异-丁氧基(iso-butoxy)、 第二-丁氧基(sec-butoxy)以及第三-丁氧基(tert-butoxy)。

在此处所述的「芳香基」(aryl)，系指一单价的6-碳单环、10- 碳单环、14-碳三环芳香环系统。芳香基的实施例包含，但不限于， 苯基(phenyl)、萘基(naphthyl)、葱基(antracenyl)。在此处所述的 「杂芳基」(heteroaryl)，系指价5-8员单环、8-12员双环或11-14 员三环系统的芳香族，且具有一或多个杂原子(如，O、N、S或Se)。 杂芳基的实施例包含，但不限于，砒啶基(pyridyl)、呋喃基(furyl)、 咪唑基(imidazolyl)、苯并咪唑基(benzimidazolyl)、嘧啶基 (pyrimidinyl)、噻吩基(thienyl)、喹啉基(quinolinyl)、吲哚基 (indolyl)、四唑基(tetrazol)以及噻唑基(thiazolyl)。

以上所述的烷基、烯基、炔基、芳香基、杂芳基具有可取代 与不可取代的部分。芳香基和杂芳基可能的取代物包含，但不限 于C1-C10烷基、C2-C10烯基和C2-C10炔基。

在此处「治疗」(treatment)做名词用，包括所施用之预防 性质(如预防性(prophylactic)、治疗性质或缓解性质(palliative) 的处置。

此处所述的「治疗有效量」(therapeutically effective amount) 一词系指在所用药剂中，活性成分的含量使其能够在必需的时期 内有效地达到恢复欲求的心脏功能或是改善神经损伤。

此处所述的「药学上可接受」(pharmaceutically acceptable) 一词系指一般认为「通常认为具安全性(generally regarded as  safe)」(亦即，生理上可耐受的)的分子和/或组合物，当施用于人 类时，通常不会产生过敏或类似的不良反应(例如，肠胃不适、头 晕、以及类似的症状)。较佳为，如此处所述的「药学上可接受」 (pharmaceutically acceptable)一词，系指经过联邦或州政府的 专责机构所核准的，或是依据美国药典所记载的，或其它一般公 认药典所载可适用于动物，特别是人类。

本说明书中「化合物」(compounds)、「组合物」 (compositions)、「活性化合物」(active compounds)、「药 物」(agent)或「药剂」(medicament)等词汇可互换使用，且 均系指称一种于投予一个体(人类或动物)可透过局部或全身性 的作用，而诱发所欲的药学和/或生理反应。

在此处，「投予」、「给药」、「施用」等被动或主动式动 词与名词(包含“administered”、“administering”或 “administration”)可互换使用，且系指称将本发明之化合物或药 学组合物直接投予一个体，或将可于个体体内形成与上述活性化 合物相当数量的前驱药、衍生物或类似物投予一个体。

「个体」(subject)或「患者」(patient)等词系指可利用 本发明提出之组合物和/或方法来治疗、处置的动物，包含人类。 除非特别指明，「个体」或「患者」涵盖雄性与雌性动物。因此， 「个体」或「患者」包含任何可经由对伴有感觉运动门控缺损的 神经精神异常的治疗而获益者。

在此处「改善心脏功能」(improve cardiac function)一词系指于一期 间内对一个体施用一组合物或方法，能有效改善心脏功能，相较 于没有施用该组合物或该方法的个体而言。此外，「改善」 (improve)一词系指减缓心脏衰竭的征状。

「恢复」(restore)一词系指长时间(例如，周或月测量)改善个 体的心脏功能，相较于未施用药物组合物或该方法的个体。

下文参照多个实验例来说明本发明，这些实验例旨在说明本 发明而非提出进一步的限制。

实施例

实施例1化合物1可降低患有心脏衰竭个体心脏纤维化

为了证实本发明化合物能够改善心脏功能，将异丙基肾上腺 素(isoproterenol)注入实验动物体内，以诱发产生心脏衰竭。接着，以 试验化合物(例如，化合物1)或载体来治疗该实验动物。以心脏超 音波观察试验化合物，对于心脏功能的影响。

1.1心脏衰竭动物模式的制备

本试验采用威士塔(Wistar)雄性成鼠(每只重量约240-270公 克，购自BioLASCO Taiwan Co.，Ltd)。

首先，将异丙基肾上腺素以单次皮下注射入大鼠体内(100 mg/Kg)，以诱发大鼠产生心脏衰竭。心衰竭鼠则进一步随机分组为 HF+载体或HF+化合物1。

以上的实验动物饲养于动物室中，饲育环境有温度与湿度控 制，光：暗循环期间分别为12小时：12小时。动物可自由食用实 验室的标准鼠饲料和自来水。所有动物实验均遵照台北医学大学 院动物实验管理小组(Institutional Animal Care and Utilization  Committee)规定的准则。

1.2制备欲施用的药剂

将化合物1(例如，MPT0E014)溶解于0.4％甲基纤维素 (methylcellulose)中，浓度为100mg/ml。

于施用异丙基肾上腺素一周之后，将心脏衰竭的大鼠(HF大 鼠)，随机分成二组，分别施用化合物1(100mg/kg)或载体(0.4％甲 基纤维素)，以经口灌胃的方式，每日一次，持续施用7日。接着， 将戊基巴比妥钠(s odium pentobarbital)(100mg/kg，Sigma)以腹腔 内注射(i.p.)方式注入大鼠体内以麻醉大鼠，再以行中线胸廓切 开术以摘除大鼠心脏，秤重并解剖，作进一步分析。

1.3心脏超音波

于实验动物执行安乐死之前，系利用HP Sonos5500系统与 15-6L探头(6 to 15 MHz，SONOS 5500，Agilent Technologies， Palo Alto，California)或Vivid I超音波心血管系统(GE  Healthcare，Haifa，Israel)，执行心脏超音波照射。以M-模式测量 左心室舒张末期直径(LV end-diastolic diameter，LVEDD)、左心室 收缩末期直径(LV end-systolic diameter，LVESD)、以及壁厚度。 左心室心肌短缩分率(LV fractional shortening percentage)之计算 方式为([LVEDD-LVESD]/LVEDD)×100。左心室射出分率以 Techholz’s公式计算。

试验结果如表I所示。以mean±S.E.M表示定量数值，且以非 成对的T-测试法来比较不同组之间的差异。数值以mean±S.E.M 表示，^*P＜0.05比较同一组治疗前后的结果；^#P＜0.05比较使用载 体和化合物1组治疗的结果。

表I HF大鼠有/或无施用化合物1的心脏超音波结果

于心血管生理学的定义，射出分率为每一心博血液从右与左心 室泵出的分率。心脏肌肉损伤，例如持续性的心肌梗塞或心肌病 变，造成心脏射出血液的功能受损，造成射出分率降低。因此， 射出分率降低，常见于心脏衰竭的个体。然而，结果显示，相较 于施用载体的大鼠(EF=59％)，施用化合物1(100mg/Kg)的HF 大鼠的心脏分率(EF=81％)，具有显著上升。肼酞嗪(hydralazine) 为一种临床上用于治疗心脏衰竭的药物，亦应用于本实验的动物 模式。大鼠以皮下注射异丙基肾上腺素(150mg/kg)以诱发心脏衰 竭，一周后，再以肼酞嗪(10mg/kg)腹腔注入大鼠体内，每日一 次，持续施用7日。结果显示出肼酞嗪可以增加射出分率，从原本 的59±4％增加至76±10％(数据未揭示于此)。

以上结果显示，本发明化合物1能有效的改善心脏功能。

1.4组织型态学分析

第1图，分别绘示出控制组、施用化合物或载体组，各组HF 大鼠的心脏型态。上排的照片为心脏的前视图。如照片所示，其 中心脏组织呈白色的部分，为产生心肌纤维化的现象。相较于施 用化合物1的HF大鼠与控制组大鼠，施用载体的大鼠，具有严重 的心脏纤维化现象。下排的照片，为由室间隔切开所分离的心室。 由此可见，施用载体的大鼠(HF+载体)，其左心室的心脏组织具有 显著的白色变化，然而，此现象于控制组大鼠和施用化合物的大 鼠(HF+化合物1)中并不存在。

将有或无施以化合物1进行治疗的大鼠左心室心尖部组织，以 福尔马林固定以及石蜡包埋。再以梅生三色染色(Masson  trichrome)，观察胶原蛋白沉积的现象。第2图绘示经载体或化合 物1处理的大鼠，其胶原蛋白沉积的现象，其中呈现蓝色为心肌 纤维化的部分。组织型态学检查显示出，相较于施用载体的HF大 鼠，施用化合物1的HF大鼠其产生心脏纤维化的现象较低。

有鉴于此，在心脏衰竭动物模式当中，本发明之化合物1能显 著地改善心脏功能。特别是，本发明之化合物1能有效增加心脏 的射出分率，以及减少心脏纤维化的发生。以上数据能证明化合 物1能有效的改善或恢复心脏衰竭个体的心脏功能。

实施例2化合物1可降低心房利钠肽的表现量

于此实施例中，透过心房利钠肽(atrial natriuretic peptide， ANP)之表现量，来探查并评估本发明化合物的效果。

施用药剂的制备与施用方式如前述。以TRIzol试剂从组织中 萃取总RNA。依据使用手册(Invitrogen，Carlsbad，USA)，并以 superscript III cDNA合成套组(Invitrogen)及随机引子(random  primers)(Invitrogen，Carlsbad，USA)进行反转录。利用SYBER  Green-based qPCR及ABI PRISM7300系统(Applied Biosystems， Foster City，USA)来测定GAPDH与ANP的RNA表现量。所有 基因的生成阈值(Threshold cycle(Ct))，均藉由2^(-ΔΔCt)法，以其 相对GAPDH RNA的Ct值进行标准化。结果如第3图所示。

ANP是一多肽荷尔蒙，系由位于心房的肌肉细胞(即，心脏肌 肉细胞)为了响应高血压而释放出来的多肽贺尔蒙。因此，ANP能 作为一种心脏衰竭的临床与功能参数。结果第3图所示，显示 出相较于施用载体的大鼠，心脏衰竭的大鼠，以口服方式施用化 合物1(100mg/kg)，持续7日，能有效减少心脏ANP mRNA的表 现量。有鉴于此，本发明化合物1能显著的改善心脏衰竭动物模 式的心脏功能。

实施例3化合物1可提供脑损伤个体神经保护活性

为了证实本发明化合物对神经具有保护效果，先以人工方式诱 导实验动物产生TBI，再以试验化合物(例如，化合物1或丙戊酸 (valproic acid))或载体处理，接着以TTC染色、以及行为试验(即， 受训练之前肢抓取动作(skilled forelimb reaching task))来测定各 组试验化合物对脑部挫伤区域与行为功能的影响。

3.1建立创伤性脑损伤(TBI)动物模式

本实验采用Sprague-Dawley雄性成鼠(每只重量约250-300 公克，购自BioLASCO Taiwan Co.，Ltd)。以随机方式将实验动物 分成3组：(i)TBI+试验化合物(例如，化合物1或丙戊酸(VPA))， (ii)TBI+VEH(例如，施用载体)，以及(iii)假控制组(sham)。实 验动物饲养于动物房中，并控制饲育环境中的温度与湿度，光： 暗循环分别为12小时：12小时。让其可自由食用标准实验室级的 老鼠饲料和自来水。所有动物实验均遵照台北医学大学院动物实 验管理小组(Institutional Animal Care and Utilization Committee) 规定的准则。

将氯胺酮(ketamine)(90mg/kg体重)与甲苯噻嗪(xylazine) (10mg/kg体重)以腹腔注射方式注入大鼠体内，进行手术麻醉。接 着，将实验动物固定在立体定位架(stereotaxic frame)上，同时提 供机械式通风。透过一可调控的冲击装置TBI-0200TBI模块系统 (Precision Systems and Instrumentation)，在实验动物暴露出来的 皮质区域产生挫伤。将头皮和帽状腱膜拉开，以一钻头(其与中矢 状缝(mid-sagittal suture)(偏好肢体的对侧)平行，并以下列坐标为 中心：前囱门AP=+1mm、ML=±2.5mm)进行直径3公厘的环 形开颅手术。简言之，延伸冲击轴，且以冲击尖端为中心，并往 下延伸超过开颅区域直到碰触到硬脑膜为止。接着，拉开杆子， 再由冲击尖端往下延伸使大鼠产生中度严重性的脑损伤。(冲击尖 端直径3mm；皮质挫伤深度，2mm；冲击速度(impact velocity)， 4m/sec)。于执行每一冲击后，以无菌酒精清洁冲击尖端，且于术 后以戊二醛(cidex)进行清洁/消毒。于手术期间，以加热板维持中 心温度，介于37±0.5℃。于脑部损伤产生之后，立即以尼龙 线缝合皮肤切口。

3.2制备施用药剂

以5％乙醇、35％聚乙二醇和60％生理食盐水溶解化合物1 (最终浓度为15mg/ml)。将化合物1(30mg/Kg)，丙戊酸(30mg/kg) 或载体(即，5％乙醇、35％聚乙二醇和60％生理食盐水)，以静脉注 射方式将所制备药剂注入至实验动物体内，其施用方式为于大鼠 产生TBI后的第0-7天。

3.3制备检体

将实验动物以水合氯醛(choral hydrate)(400mg/kg)进行 深层麻醉，再以生理食盐水和4％之三聚甲醛(paraformaldehyde) 涂布。接着，摘除实验动物的脑部，进行横跨脑的喙-尾部之活体 组织切片(每片厚度2mm)，以进行皮质组织损失的测定。藉由扫 描仪(HP photosmart B110a，600dpi)，取得脑部切片的影像。

3.4挫伤体积测量

考虑因切除和固定所可能导致的微量损耗下，可利用占总 皮质体积多少部分来评估皮质损伤量。在此研究中，「挫伤率 (contrusion ratio)」定义为挫伤体积和同侧大脑的相关性。为了让 每一切片呈现挫伤率，挫伤体积(c_area)和同侧大脑(b_area)两者的区 域系以手工标示并以所包含的像素量表示。第4图为一挫伤体积的 图示。简言之，为了描述可进一步分析之整体挫伤体积，将挫伤 体积的区域进行特定分析。每一切片的挫伤体积的厚度为2mm， 定义为0.5x(Area_front+Area_back)x2，因此，总挫伤体积可以公式 0.5x(A₁+A₂)x2+0.5x(A₂+A₃)x2+...+0.5x(A_N-1+A_N)x 2表示。亦可改写由以下公式所表示

3.5 2，3，5-三苯四唑鎓氯(TTC)染色

TTC染色系藉由比较不同神经组织的存活力，来评估损害 的大小。将摘除的大脑进行组织切片，每片厚度为2mm，以1％TTC 溶液培养，置于37℃，30分钟。存活的神经组织具有去氢酶酵素， 会将TTC转换成红色甲□(formazan)色素，使组织呈深红色。而受 损的组织，因缺发去氢酶酵素，无法与TTC反应，因此组织呈淡白 色。

第5图绘示出试验化合物的效果，例如，化合物1或VPA， 可减少因TBI所引起的挫伤区域。因此，如第5图所示，相较于丙 戊酸(其为一已知的组蛋白乙酰酶抑制剂(histone deactylase  (HDAC)inhibitor)，习知用来控制经孪的发生)，本发明化合物1 能有效的降低脑部组织受损的区域。

3.6训练/行为试验

让所有试验动物进行前肢抓取试验(skilled forelimb reaching task) 的训练以符合标准。经训练合格后的实验动物，先进行T B I手术， 再将其分配至不同的组别(如上所述)。每一只动物于每周的第1 天、第3天、以及第7天，执行前肢抓取试验，共持续6周。于施用 试验化合物(如，化合物1或VPA)或载体的当天(例如，第1天、第3 天或第7天)，需先进行行为试验，再进行药物注射。前肢抓取试 验之执行方式，如先前所述之。简而言之，实验动物被安置在透 明的树脂玻璃箱(30公分x36公分x30公分)且需穿过一窗口(1.5 公分x3公分)，去取得小蔗糖锭片(45毫克，Bilaney Consultants， Frenchtown，NJ)，该锭片置放于距离约1公分外的平台上。在训练 初期，实验动物需进行肢体偏好测定，而该锭片的放置位置，会 依据动物前肢偏好的使用习惯进行调整。此外，于手术进行前， 需先建立基准，系为操作前最后三次试验回合的平均值。为实验 动物第一次尝试抓取锭片且将其置入口中(例如，「第一次抓取成 功」)即定义为「成功」。每一试验内容为依照实验动物之偏好而 设置之前肢抓取试验，抓取机会为20次。若实验动物企图以非惯 用的前肢进行抓取，则不纳入后续分析计算中。手术前的标准为， 于连续3天内，20次的抓取机会中，成功次数为16次。此外，时间 限度为每一回合测试5分钟。

3.7结果

依据实施例3.2所述的步骤制备药剂，接着将药剂分别施用 于实施例3.1所述之3组T B I实验动物，再使该些实验动物进行所述 之前肢抓取试验，结果如第6图所示。再次证明，本发明化合物1 与VPA，能显著的改善因TBI所造成的行为功能丧失，且以上数据 显示，化合物1对于脑损伤的个体具有神经保护活性。

实施例4化合物1提供缺血性脑梗塞个体神经保护活性

于此实施例中，以缺血性脑梗塞动物模式证明本发明化合 物的效用。与实施例3所述之步骤类似，以人工方式诱使实验动物 产生缺血性脑梗塞，接着施用试验化合物(例如，化合物1或丙戊 酸)或载体，再以TTC染色与西方墨点法测定试验化合物对于梗塞 区域的影响，以及环化单磷酸腺苷酸反应组件结合蛋白(cAMP  response element-binding protein，CREB)的正调控现象。

4.1建立中大脑动脉阻塞(Middle Cerebral Artery Occulsion， MCAO)动物模型(或缺血性脑梗塞大鼠模式)

藉由结扎试验大鼠的下大脑静脉以刺激产生缺血性脑梗塞， 来建立大脑中动脉阻塞(MCAO)动物模型。简言之，制造一颞切口 以找到右MCA，其中右MCA位于下大脑静脉水平处。透过颈部切 口，分离出双侧的颈总动脉，并以动脉夹进行阻塞。藉由尼龙线 (10-0)将远离下脑静脉处的MCA结扎。于60分钟后，再次将大 鼠麻醉，移除颈动脉夹，并缝合颈部切口。待大鼠从麻醉恢复后， 再将其放回饲养箱当中。假手术(sham surgery)与MCAO手术类似， 其包含手术切口开合的步骤，但不包含分离、结扎或使MCA或颈 动脉凝集的动作。

4.2制备施用药剂

以5％乙醇、35％聚乙二醇和60％生理食盐水溶解化合物1 (最终浓度为15mg/ml)。将化合物1(30mg/Kg)、丙戊酸(30mg/kg) 或载体(5％乙醇、35％聚乙二醇和60％生理食盐水)，以静脉注射方 式注入至实验动物体内，其施用方式为于大鼠产生MCAO后的第 0-7天。

4.3CREB西方墨点法分析

将Laemli检体缓冲液与收集的蛋白检体混合。以SDS-聚丙 烯胺凝胶来分离检体蛋白质，接着转渍至硝化纤维膜上，再以5％ 牛奶、PBS(含0.05％Tween-20)进行遮断，接着，加入一级抗体 和缓冲液，进行隔夜培养。接着以PBS/Tween-20和PBS清洗，免疫 标记蛋白带包含组蛋白去乙酰抑制剂1(histone deacetylase  inhibitor1，HDAC1)、组蛋白去乙酰抑制剂2(histone deacetylase  inhibitor2，HDAC2)、去乙酰化组蛋白H2A(acetylated histone  H2A，Ac-H2A)，去乙酰化组蛋白H2B(acetylated histone H2B， Ac-H2B)，磷酸化环化单磷酸腺苷酸反应组件结合蛋白 (phosphorylation of cAMP response element-binding protein， p-CREB)、以及总环化单磷酸腺苷酸反应组件结合蛋白(total  protein of cAMP response element-binding protein，t-CREB)表现 于右前脑(right anterior brain，RA)、右后脑(right posterior brain， RP)、左前脑(left anterior brain，LA)、以及左后脑(left posterior brain，LP)。分别以抗体-山葵氧化物-共轭抗-兔子、抗-小鼠或抗- 山羊抗体(Santa CruzBiotechnology，1∶5,000倍稀释)进行，再以 化学冷光系统(ECL，GE Healthcare Bioscience， Buckinghamshire，UK)，以及HyperfilmTMECL放射显影(GE  Healthcare Bioscience)侦测。此外，藉由Quantity OneTM软件 (Bio-Rad)定量免疫墨点法。

4.4结果

依据实施例4.2所述制备药剂，将实施例4.1的MCAO大鼠分 成三组(每组，N=5)，将该些动物的梗塞区域进行染色，以和实施 例3.4和3.5所述步骤类似的步骤进行评估，结果绘示于第7A及7B 图。三个治疗时间点的梗塞体积，例如在中风后的30分钟、2小时 以及4小时分别进行测量；施用化合物1和/或丙戊酸的MCAO大 鼠，经3天后，治疗处的梗塞体积显著的减少(第7A图)。在另一实 验中，则是在诱发MCAO后，透过连续灌注，分别对大鼠施用本发 明化合物1约30分钟、2小时、4小时或24小时，之后再测量梗塞体 积；发现灌注时间愈久，梗塞体积愈小(亦即，减少程度愈高)。

如上所述，脑部缺血引起了大量的CREB磷酸化，以及于神 经元当中由CREB-调控基因所大量编码表现的神经保护性分子 (Kitagawa K.，FEBS J.2007 274(13)：3210-7)。因此，化合物可有 效的活化CREB的磷酸化，具有成为减缓缺血性脑梗塞之先导化合 物的潜力。依据实施例4.3的步骤，以西方墨点法测定CREB磷酸化 值。结果如第8图所示。如图所示，观察施用接受化合物1的大鼠， 于脑部区域RA、LA与RP、LP，其CREB(包含p-CREB以及t-CREB) 正调节的现象。

尽管本发明之范畴所设置之数值范围和参数为近似值，但 在此所揭示之特定实施例，尽可能精确呈现。然而，因各个试验 测量具有标准差，故任何数值存在着特定的误差值。

当可理解，上文的说明与实施方式仅为本发明之例示，且 本领域技术人员可对其进行各种修饰。以上的说明文字、实验例 数据提供了本发明例示性实施方式的结构与用法。虽然上文某种 程度数了本发明的多种实施方式，或提及了一或多种具体的实施 方式，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明 之原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本 发明的保护范围当以附随权利要求书所界定的为准。