非B亚型GAG蛋白在慢病毒包装中的应用

摘要

本发明涉及慢病毒包装载体，所述慢病毒包装载体包含非B亚型gag-pol序列，尤其是D亚型gag-pol序列。本发明还涉及用于制备和使用这些载体的方法。本发明还涉及包含HIV-1非B亚型Gag和/或Pol蛋白的慢病毒载体颗粒。

说明书

背景技术

重组疫苗已随重组DNA技术的进步而发展，重组DNA技术能够修饰病毒基 因组以产生修饰的病毒。通过这种方式，已能够将遗传序列引入非致病性病毒， 从而它们编码需要在干扰后于靶细胞内得以表达的免疫原性蛋白质，以在其宿 主内发展特定免疫应答。

此类疫苗构成了疫苗技术中的重大进步(Kutzler等,Nat Rev Genet,9(10): 776-788,2008)。具体而言，它们具有优于传统疫苗的优势：避免活(减毒的)病 毒和消除灭活疫苗制造的相关风险。

采用经修饰的逆转录病毒(逆转录病毒载体)的基因递送在上世纪80年代早 期由Mann等描述(Cell,33(1):153-9,1983)。最常用的致瘤性逆转录病毒基于莫 洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MLV)。其基因组简单，从该基因组产生多聚蛋白 质Gag、Pol和Env，并以反式形式供病毒复制所需(Breckpot等,2007,Gene Ther, 14(11):847-62;He等，2007,Expert Rev vaccines,6(6):913-24)。一般需要的顺式 序列是长末端重复序列(LTR)及其如下周边序列：整合所需的反向重复序列(IR 或att位点)、包装序列Ψ、转运RNA结合位点(引物结合位点，PBS)，和逆转录 涉及的一些其它序列(LTR内的重复R，以及多嘌呤序列(PPT)，正链起始所必 需)。为了生成复制缺陷型逆转录病毒载体，通常使gag、pol和env基因全部缺 失，并且用表达盒替代。

源自慢病毒基因组的逆转录病毒载体(即，慢病毒载体)已涌现为用于基因 治疗和免疫治疗目的的有希望的工具，因为它们显示优于其它病毒系统的若干 优势。具体而言，慢病毒载体本身无毒，并且不像其它逆转录病毒，慢病毒能 够转导非分裂细胞，尤其是树突细胞(He等，2007,Expert Rev vaccines, 6(6):913-24)，这允许通过内源性通路的抗原递呈。慢病毒代表逆转录病毒科 (Retroviridae)的一个慢病毒(slow virus)属，其包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴 免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性脑炎病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、 牛免疫缺陷病毒(BIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。慢病毒可以无限地持续存在于 其宿主内，并且在一生的感染期间以不同速度连续复制。所述病毒在其宿主内 的持续复制取决于其避开宿主防御的能力。

重组慢病毒载体的设计基于所述慢病毒的顺式与反式作用序列的分离。非 分裂细胞中的有效整合与复制需要所述慢病毒基因组中存在两种顺式作用序 列：中心多嘌呤序列(cPPT)和中心终止序列(CTS)。它们导致形成三链DNA结构， 称为中心DNA“瓣(flap)”，该结构使基因进入非分裂细胞(包括树突细胞(DC))核 内的效率最大化(Zennou等,2000,Cell,101(2)173-85;Arhel等,2007,EMBO J, 26(12):3025-37)。

已经基于由包装构建体为反式包装载体提供B亚型Gag、Pol、Tat和Rev蛋 白而生成了HIV-1慢病毒载体(Naldini等,PNAS15:11382-8(1996);Zufferey等, Nature Biotechnology15:871-875,1997);Dull等,Journal of Virology(1997))。这 些研究采用B亚型Gag和Pol蛋白进行。而HIV-1包装构建体中非B亚型gag和pol 序列的作用还未经评估。

除B亚型外存在HIV-1的多种不同亚型。HIV-1的一些亚型，例如C、E和A 亚型，似乎在转送上比HIV-1B亚型(美国和欧洲的主要亚型)更为有效。Essex 等,Adv Virus Res.1999;53:71-88。在发达西方国家，发现HIV-1优势亚型是进 化枝B，这与存在于非洲和亚洲(绝大多数HIV感染人类的居住地)的那些亚型和 重组子相差甚远。Spira等,J.Antimicrobial Chemotherapy(2003)51,229-240。因 此，在北美和欧洲所见的B亚型逆转录病毒与全球范围人类传染的那些病毒亚 型之间可能存在严重差异（出处同上）。亚型差异可影响HIV传播模式。同性 传播和静脉内药物滥用是在欧洲和美国观察到的进化枝B株系的主要传播模式 （出处同上）。相反，进化枝A、C、D和E在非洲和亚洲占优势，在这些地方 异性传播为主（出处同上）。此外，一些研究提出艾滋病(AIDS)的进展视感染 性亚型而有不同（出处同上）。因此，似乎HIV-1B亚型与其它HIV-1亚型差异 很大。

HIV种系分类法一般基于源自相同分离物的多个亚基因组区域(gag、pol和 env)的核苷酸序列，或基于全长基因组序列分析。对于HIV-1的接近全长序列的 种系分析揭示，HIV-1B亚型在遗传上与HIV D亚型最紧密相关(图1)。对于 HIV-1Gag和Pol蛋白序列的种系分析也显示，HIV-1B亚型在遗传上与HIV D亚 型最紧密相关(图2)。

不过，HlV-1-NDK(一种D亚型病毒)对CD4+淋巴细胞的细胞致病性显著高 于HIV-1-BRU原形(一种B亚型病毒)。这可能归因于D亚型病毒的增强的致融性 (fusogenicity)和感染性。De Mareuil等,J.Virol.66:6797(1992)。重组病毒的表 型分析表明，来自HIV-1-NDK基质(MA)蛋白N末端部分的75个氨基酸与 HIV-1-NDK的包膜糖蛋白一同造成了HIV-1-NDK在CD4+淋巴细胞中增强的致 融性以及HIV-1-NDK在一些CD4-细胞系中增强的感染性（出处同上）。

本领域需要慢病毒包装构建体来生成更高效价的经包装慢病毒载体，以减 少注射体积，提高剂量，降低疫苗接种的成本，并且增加能在一批次中治疗的 患者的数量。本发明满足了这一需要。

发明概述

用D亚型HIV-1的gag-pol基因替代慢病毒包装质粒(构建体p8.74)中的 HIV-1B亚型的gag-pol基因，以生成构建体pThV-GP-N。所述构建体用于慢病 毒载体的生成。相较于构建体p8.74，使用pThV-GP-N质粒获得约2倍高的效价。 因此，相对于B亚型病毒的Gag-Pol，D亚型病毒的Gag-Pol提高了慢病毒载体颗 粒的效价。本发明涉及包含D亚型gag-pol序列，尤其是来自HIV-1NDK的D亚 型gag-pol序列的慢病毒包装载体。在一个优选实施方式中，所述慢病毒包装载 体包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。在一个优选实施方式中，所述慢病毒包装 载体编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

SEQ ID NO1的核苷酸序列是：

atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggaaaattagatacatgggaaagaattcggttacggccaggag gaaagaaaaaatatgcactaaaacatttgatatgggcaagcagggagctagaacgatttacacttaatcctggccttttag agacatcagaaggctgtaaacaaataataggacagctacaaccatctattcaaacaggatcagaagaaattagatcatta tataatacagtagcaaccctctattgtgtacatgaaaggatagaggtaaaagacaccaaagaagctgtagaaaagatgg aggaagaacaaaacaaaagtaagaaaaagacacagcaagcagcagctgatagcagccaggtcagccaaaattaccc tatagtgcagaacctacaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaactttgaacgcatgggtaaaagtaata gaagaaaaggccttcagcccggaagtaatacccatgttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaaca ccatgctaaacacagtggggggacatcaagcagctatgcaaatgctaaaagagaccatcaatgacgaagctgcagaat gggacagattacatccagtgcatgcagggcctgttgcaccaggccaaatgagagaaccaaggggaagtgatatagca ggaactactagtacccttcaggaacaaatagcatggatgacaagcaacccacctatcccagtaggagaaatctataaaa gatggataatcctgggattaaataaaatagtaagaatgtatagccctgtcagcattttggacataagacagggaccaaag gaaccttttagagactatgtagaccggttctataaaactctaagagccgagcaagcttcacaggatgtaaaaaactggat gacagaaaccttgttggtccaaaatgcaaacccagattgtaaaactatcttaaaagcattgggaccacaggctacactag aagaaatgatgacagcatgccagggagtgggggggcccggccataaagcaagagttttggctgaggcaatgagcca agtaacaggttcagctactgcagtaatgatgcagagaggcaattttaagggcccaagaaaaagtattaagtgtttcaact gtggcaaggaagggcacacagcaaaaaattgcagggcccctagaaaaaagggctgttggaaatgcggaagggaag gacaccaaatgaaagattgcactgaaagacaggctaattttttagggaagatttggccttcccacaagggaaggccggg gaattttcttcagagcagaccagagccaacagccccaccagcagagagcttcgggtttggggaggagataaccccctc tcagaaacaggagcagaaagacaaggaactgtatcctttagcttccctcaaatcactctttggcaacgacccctcgtcac aataaagatagggggacagctaaaggaagctctattagatacaggagcagatgatacagtattagaagaaataaatttg ccaggaaaatggaagccaaaaatgatagggggaattggaggttttatcaaagtaagacagtatgatcaaatactcatag aaatctgtggatataaagctatgggtacagtattagtaggacctacacctgtcaacataattggaagaaatttgttgaccca gattggctgcactttaaattttccaattagtcctattgaaactgtaccagtaaaattaaagccaggaatggatggcccaaaa gttaaacaatggccattgacgaagaaaaaataaaagcattaacagaaatttgtacagaaatggaaaaggaaggaaaaat ttcaagaattgggcctgaaaatccatataatactccaatatttgccataaagaaaaaagacagtaccaagtggagaaaatt agtagatttcagagaacttaataagagaactcaagatttctgggaggttcaattaggaataccgcatcctgcagggctga aaaagaaaaaatcagtaacagtactggatgtgggtgatgcatatttctcagttcccttagatgaagattttaggaaatatac cgcatttaccatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatcagtacaatgtgctcccacagggatggaaag gatcaccggcaatattccaaagtagcatgacaaaaatcttagagccctttagaaaacaaaatccagaaatagttatctatc aatacatggatgatttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcatagaacaaaaatagaggaattaagagaacat ctattgaggtggggatttaccacaccagataaaaaacatcagaaagaacctccatttctttggatgggttatgaactccatc ctgataaatggacagtacagcctataaacctgccagaaaaagaaagctggactgtcaatgatatacagaagttagtggg gaaattaaactgggcaagccagatttatgcaggaattaaagtaaagcaattatgtaaactccttaggggaaccaaagcac taacagaagtagtaccactaacagaagaagcagaattagaactggcagaaaacagggaaattctaaaagaaccagtac atggagtgtattatgacccatcaaaagacttaatagcagaactacagaaacaaggggacggccaatggacataccaaat ttatcaagaaccatttaaaaatctaaaaacaggaaagtatgcaagaacgaggggtgcccacactaatgatgtaaaacaat taacagaggcagtgcaaaaaatagccacagaaagcatagtgatatggggaaagactcctaaatttaaactacccataca aaaggaaacatgggaaacatggtggatagagtattggcaagccacctggattcctgagtgggaatttgtcaatacccct cctttagtaaaattatggtaccagttagagaaggaacccataataggagcagaaactttctatgtagatggggcagctaat agagagactaaattaggaaaagcaggatatgttactgacagaggaagacagaaagttgtccctttcactgacacgacaa atcagaagactgagttacaagcaattaatctagctttacaggattcgggattagaagtaaacatagtaacagattcacaat atgcactaggaatcattcaagcacaaccagataagagtgaatcagagttagtcagtcaaataatagagcagctaataaa aaaggaaaaggtttacctggcatgggtaccagcacacaaaggaattggaggaaatgaacaagtagataaattagtcag tcagggaatcaggaaagtactatttttggatggaatagataaggctcaggaagaacatgagaaatatcacaacaattgga gagcaatggctagtgattttaacctaccacctgtggtagcgaaagaaatagtagctagctgtgataaatgtcagctaaaa ggagaagccatgcatggacaagtagactgtagtccaggaatatggcaattagattgtacacatctggaaggaaaagtta tcctggtagcagttcatgtagccagtggctatatagaagcagaagttattccagcagaaacggggcaagaaacagcata ctttctcttaaaattagcaggaagatggccagtaaaagtagtacatacagataatggcagcaatttcaccagtgctacagtt aaggccgcctgttggtgggcagggatcaaacaggaatttggaattccctacaatccccaaagtcaaggagtagtagaat ctatgaataaagaattaaagaaaattataggacaggtaagagatcaagctgaacatcttaagacagcagtacaaatggc agtatttatccacaattttaaaagaaaaggggggattgggggatacagtgcaggggaaagaataatagacataatagca acagacatacaaactagagaattacaaaaacaaatcataaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagat ccaatttggaaaggaccagcaaagcttctctggaaaggtgaaggggcagtagtaatacaagacaatagtgacataaag gtagtaccaagaagaaaagtaaagatcattagggattatggaaaacagatggcaggtgatgattgtgtggcaagtagac aggatgaggattaac(SEQ ID NO1).

SEQ ID NO2的氨基酸序列是：

MGARASVLSGGKLDAWERIRLRPGGKKKYALKHLIWASRELERIALNP GLLETSEGCKQIIGQLQPSIQTGSEELRSLYNTIATLYCVHERIEVKDTKEAVE KMEEEQNKSKKKTQQAAADSSQVSQNYPIVQNLQGQMVHQAISPRTLNAW VKVIEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETIND EAAEWDRLHPVHAGPVAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIAWMTSNPPIPVG EIYKRWIILGLNKIVRMYSPVSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQD VKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPQATLEEMMTACQGVGGPGHKARV LAEAMSQVTGSVTAVMMQRGNFKGPRKSIKCFNCGKEGHTAKNCRAPRKK GCWKCGREGHQMKDCSERQANFLGKIWPSHKGRPGNFLQSRPEPTAPPAES FGFGEEITPSQKQEQKDKELYPLASLKSLFGNDPSSQFFREDLAFPQGKAGEF SSEQTRANSPTSRELRVWGGDNPLSETGAEGQGTVSFSFPQITLWQRPLVTIK IGGQLKEALLDTGADDTVLEEMNLPGKWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEIC GYKAMGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNFPISPIETVPVKLKPGMDGPKV KQWPLTEEKIKALTEICTEMEKEGKISRIGPENPYNTPIFAIKKKDSTKWRKLV DFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFRK YTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPEIVIY QYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELREHLLRWGFTTPDKKHQKEPPFLWMGY ELHPDKWTVQPIKLPEKESWTVNDIQKLVGKLNWASQIYAGIKVKQLCKLL RGTKALTEVVPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAELQKQGDG QWTYQIYQEPFKNLKTGKYARTRGAHTNDVKQLTEAVQKIATESIVIWGKTP KFKLPIQKETWETWWIEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIIGAET FYVDGAANRETKLGKAGYVTDRGRQKVVPFTDTTNQKTELQAINLALQDSG LEVNIVTDSQYALGIIQAQPDKSESELVSQIIEQLIKKEKVYLAWVPAHKGIGG NEQVDKLVSQGIRKVLFLDGIDKAQEEHEKYHNNWRAMASDFNLPPVVAKE IVASCDKCQLKGEAMHGQVDCSPGIWQLDCTHLEGKVILVAVHVASGYIEA EVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVKVVHTDNGSNFTSATVKAACWWAGIK QEFGIPYNPQSQGVVESMNKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFKRK GGIGGYSAGERIIDIIATDIQTRELQKQIIKIQNFRVYYRDSRDPIWKGPAKLL WKGEGAVVIQDNSDIKVVPRRKVKIIRDYGKQMAGDDCVASRQDED(SEQ ID NO:2).

本发明涉及包含D亚型MA序列，尤其是来自HIV-1NDK的D亚型MA序列 的慢病毒包装载体。在一个优选实施方式中，所述慢病毒包装载体编码含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的MA蛋白。

SEQ ID NO3的氨基酸序列是：

MGARASVLSGGKLDTWERIRLRPGGKKKYALKHLIWASRELERFTLNP GLLETSEGCKQIIGQLQPSIQTGSEEIRSLYNTVATLYCVHERIEVKDTKEAVE KMEEEQNKSKKKTQQAAADSSQVSQNY(SEQ ID NO3).

优选地，相较于编码HIV-1BRU的HIV Gag MA蛋白的慢病毒包装载体(例 如，p8.74)，所述编码HIV Gag MA蛋白的慢病毒包装载体产生的经包装慢病毒 载体效价至少增至1.5倍，或至少增至2倍。优选地，所述慢病毒包装载体是复 制缺陷型的，并且缺乏Ψ位点。

在一个优选实施方式中，所述慢病毒包装载体编码的HIV Gag MA蛋白在 12位的氨基酸不是谷氨酸且在15位的氨基酸不是精氨酸。优选地，所述慢病毒 包装载体不会同时在第46位具有缬氨酸且在第61位具有亮氨酸。

在一个优选实施方式中，所述MA蛋白的第12位氨基酸是赖氨酸。在一个 优选实施方式中，第15位氨基酸是苏氨酸。在一个优选实施方式中，第15位氨 基酸是丙氨酸。在一个优选实施方式中，第46位氨基酸是亮氨酸。在一个优选 实施方式中，第61位氨基酸是异亮氨酸。在一个优选实施方式中，第61位氨基 酸是甲硫氨酸。

在一个实施方式中，所述载体不编码功能性Env蛋白。

本发明还涉及用于制备上述慢病毒包装载体的方法和使用这些慢病毒包 装载体的方法。

附图说明

通过参考附图更加完整地理解本发明。

图1描述HIV病毒的种系发生树。

图2A和B描述HIV GAG(A)和POL(B)蛋白的种系发生树。

GAG和POL蛋白的序列获自以下网址： http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/NEWALIGN/align.html。就各已知的 HIV进化枝而言，随机选择一名患者(进化枝B)或两名患者的病毒序列，并且将 GAG和POL蛋白序列与参比进化枝B蛋白 (B.FR.83.HXB2_LAI_IIIB_BRU.KO3455)作比较。使用Vector NTI高级11(英杰 公司(Invitrogen))来进行比对。

图3描述使用p8.74和pThV-GP-N质粒供载体生成所获得的效价。使用原病 毒质粒(pFLAP-CMV-GFP)、假型(pseudotyping)质粒(pTHV-VSV.G)以及常用的 包装质粒(源自BRU株系，p8.74)或NDK源性的包装质粒(pTHV-GP-N)来产生慢 病毒颗粒。各包装质粒进行18次独立转染，并且通过FACS分析来检测颗粒效 价。采用使用原病毒质粒的载体也获得相似结果，所述原病毒质粒包含驱动HIV 抗原表达的β2微球蛋白启动子。

图4描述野生型BRU和NDK病毒的生成，以及对其各自早期效率的评价。 用野生型BRU(pBRU)或NDK(pNDK-N)病毒的编码质粒转染293T细胞。48小时 后收集病毒上清液，并稀释以感染P4-CCR5细胞(包含稳定的荧光素酶报告基 因，该报告基因的表达由HIV LTR驱动，允许在TAT蛋白(由病毒带来)存在下 产生荧光素酶)。使用BRU或NDK病毒的系列稀释物来感染P4-CCR5细胞，并且 检测荧光素酶表达(A)或荧光素酶/P24比(B)。

图5描述采用源自包装质粒的不同比例的BRU(p8,74)和NDK(pThV GP-N) 的载体生成。就各条件而言(从0μg NDK+10μg BRU到10μg NDK+0μg BRU)， 检测效价(灰色柱)和P24水平(黑色方块)。

图6描述使用源自包装质粒的BRU(8.74)或NDK(pThV GP-N)所产生载体 上清液的Western印迹。使用NIH抗-P24MAB(183-H12-5C)来进行P24蛋白和前 体检测。图7描述进化枝B病毒(BRU;SEQ ID NO:3)和进化枝D病毒(NDK;SEQ ID NO:4)的N末端MA序列的序列比对。

图8描述多种进化枝B病毒的N末端MA序列的序列比对。图9描述多种进化 枝D病毒的N末端MA序列的序列比对。

图10描述进化枝B病毒(BRU)和其它进化枝病毒的N末端MA序列的序列比 对。

具体实施方式

B亚型HIV-1病毒与其它HIV-1亚型的不同之处在于，B亚型病毒似乎具有 较低的传播效率和不同的传播模式。不过，B亚型病毒已被广泛应用于HIV-1 慢病毒载体和慢病毒包装载体的生成。为了确定非B亚型病毒的Gag和Pol蛋白 是否能用于慢病毒包装载体的生成，将慢病毒包装质粒(构建体p8.74)中HIV-1B 亚型的gag-pol基因用D亚型HIV-1的gag-pol基因替代，以生成构建体 pThV-GP-N。所述构建体用于慢病毒载体生成。使用pThV-GP-N质粒获得的效 价约是构建体p8.74所得的2倍(图3)。因此，所述包装载体中的D亚型HIV-1 Gag-Pol提高所述慢病毒载体的效价，使其超过采用B亚型HIV-1Gag-Pol所观察 到的效价。

所述慢病毒载体效价的增加益处在于允许减少给定剂量慢病毒载体中的 污染物。这能促进减小注射体积和增加可用剂量。效价增加还通过减少达到特 定剂量所必需的材料和劳动量，以及增加单批慢病毒载体能够治疗的患者数 量，来促进降低疫苗接种成本。

HIV-1BRU和HIV-1NDK病毒的系列稀释物表明，HIV-1NDK病毒在病毒 生存周期的早期更为有效(图4)。通过混合不同量的B亚型和D亚型包装载体， 显示D亚型包装载体提高所述慢病毒载体制备物中的效价和p24水平(图5)。还观 察到，采用所述D亚型包装载体的慢病毒载体制备物中的p24的加工完成度较 低，显示更高水平的p24前体(图6)。因此，D亚型包装载体中的Gag显示与B亚 型包装载体有多种差异。

对于HIV-1Env，HIV-1-NDK基质(MA)蛋白自N末端部分起的75个氨基酸 是造成HIV-1-NDK在CD4+淋巴细胞中致融性增强的原因，并且造成 HIV-1-NDK在一些CD4-细胞系中增强的感染性。De Mareuil等，J.Virol.66:6797 (1992)。由于采用B亚型和D亚型包装载体的慢病毒载体生成中所用的Env蛋白 是相同的(即，VSV)，仅在B亚型和D亚型包装载体的HIV-1MA有差异。

检测来自不同进化枝的HIV-1病毒的M的N末端75个氨基酸的氨基酸保守 度和发散度。显示HIV-1NDK与来自HIV-1BRU的氨基酸具有10种差异(图7)。 然而，将HIV-1NDK与20种不同HIV-1B亚型病毒的组合作比较时，仅观察到 这些差异中的8种(图8)。将其它D亚型病毒纳入比较时，这些差异中仅有4种保 留(图9)。这些差异是：D亚型病毒的氨基酸第12位没有谷氨酸，氨基酸第15位 没有精氨酸，氨基酸第46位没有缬氨酸，以及氨基酸第61位没有亮氨酸。

将其它亚型的病毒纳入比较时，所述其它亚型似乎与D亚型对齐，保留了 几乎全部这些差异(图10)。几乎全部这些非B亚型病毒在第12位呈现赖氨酸。这 些非B亚型病毒中的许多在第15位呈现丙氨酸。几乎全部所述非B亚型病毒在第 46位呈现亮氨酸。几乎全部所述非B亚型病毒在第61位呈现甲硫氨酸或异亮氨 酸。所述非B亚型病毒显示普遍性，在第12位呈现赖氨酸，在第15位都呈现非 精氨酸的氨基酸，在第46位呈现亮氨酸，且在第61位呈现异亮氨酸或甲硫氨酸。

本发明涉及编码非B亚型Gag和/或Pol蛋白的包装载体，以及包含这些载体 的宿主细胞。本发明还涉及用于制备编码非B亚型Gag和/或Pol蛋白的包装载体 的方法。本发明还涉及使用这些包装载体用于生成慢病毒载体的方法，以及包 含非B亚型Gag和/或Pol蛋白的慢病毒载体。

包装载体

本发明涉及编码非B亚型Gag和/或Pol蛋白的包装载体。慢病毒“包装载体” 在本文中定义为下述核酸序列：在与包含包装所需慢病毒顺式作用信号的载体 共转染时，所述核酸序列不编码功能性HIV-1Env并且缺乏Ψ位点，但能够表达 可纳入病毒颗粒的慢病毒Gag和/或Pol蛋白。本发明的慢病毒包装载体无法通过 包装和逆转录其自身序列来自体复制。

所述包装载体可以是RNA载体或DNA载体。所述非B亚型Gag和Pol蛋白可 选自：A亚型、C亚型、D亚型、E亚型、F1亚型、F2亚型、G亚型、H亚型和J 亚型蛋白，及其重组子。优选的包装载体包含SEQ ID NO:1或编码SEQ ID NO:2。

本发明涉及编码非B亚型Gag蛋白的包装载体，以及包含这些载体的宿主细 胞。所述非B亚型Gag蛋白可选自：A亚型、C亚型、D亚型、E亚型、F1亚型、 F2亚型、G亚型、H亚型和J亚型蛋白，及其重组子。优选的包装载体编码SEQ ID NO:2的Gag蛋白部分。

本发明涉及编码非B亚型MA蛋白的包装载体，以及包含这些载体的宿主细 胞。所述非B亚型MA蛋白可选自：A亚型、C亚型、D亚型、E亚型、F1亚型、 F2亚型、G亚型、H亚型和J亚型蛋白，及其重组子。优选的包装载体编码SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的MA蛋白部分。

在不同实施方式中，所述包装载体包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有 至少95%、96%、97%、98%、99%相同性的核酸序列。在不同实施方式中，所 述包装载体编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3 具有至少95%、96%、97%、98%、99%相同性的氨基酸序列。

如本文所用，两种核酸序列的相同性百分比可通过比较序列信息来确定， 所述比较采用GAP计算机程序6.0版(由Devereux等描述(Nucl.Acids Res.12:387, 1984)，并且可获自威斯康星大学遗传学计算机团队(UWGCG))，采用GAP程序 的默认参数，包括：(1)针对核苷酸的一元比较矩阵(包括对相同取值为1，对不 同取值为0)，以及Gribskov和Burgess,Nucl.Acids Res.14:6745,1986的加权比较 矩阵(如Schwartz和Dayhoff编，Atlas of Protein Sequence and Structure(《蛋白序 列和结构图册》),国家生物医学研究基金会(National Biomedical Research Foundation)，第353-358页,1979所述)；(2)对各缺口的3.0的罚分和对各缺口标 志的额外0.10的罚分；以及(3)对末端缺口不罚分。

在不同实施方式中，所述载体包含编码HIV-1MA蛋白的序列，其具有一 种或多种以下特征：

在氨基酸第12位没有谷氨酸；

在氨基酸第15位没有精氨酸；

在氨基酸第46位没有缬氨酸；和

在氨基酸第61位没有亮氨酸。

在不同实施方式中，所述载体包含编码HIV-1MA蛋白的序列，其具有一 种或多种以下特征：

第12位氨基酸是赖氨酸；

第15位氨基酸是苏氨酸；

第15位氨基酸是丙氨酸；

第46位氨基酸是亮氨酸；

第61位氨基酸是异亮氨酸；和/或

第61位氨基酸是甲硫氨酸。

所述包装载体优选编码HIV-1Gag和Pol。最优选地，所述包装载体编码 HIV-1Gag MA蛋白。

所述包装载体可包含用于Gag和Pol表达的病毒性序列或非病毒序列。所述 包装载体可包含HIV-1LTR或HIV-1LTR的U3区域。在其它实施方式中，所述 包装载体不包含HIV-1LTR。可使用任何启动子来驱动Gag和Pol的表达。优选 地，所述启动子在人细胞中是强启动子。最优选地，所述包装载体包含巨细胞 病毒(CMV)启动子、CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子、劳斯氏肉瘤 病毒(RSV)启动子、人磷酸甘油酸激酶(hPGK)启动子或来自LTR的U3(例如，骨 髓增殖性肉瘤病毒(MPSV)U3)启动子来驱动所编码基因如gag和pol的表达。

优选地，所述包装载体包含聚腺苷酸化信号。可以是任何聚腺苷酸化信号。 优选地，所述聚腺苷酸化信号在人细胞中是强信号。最优选地，所述聚腺苷酸 化信号是人α2球蛋白或牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号。优选地，所述包装 载体包含Rev应答元件(RRE)。在一个优选实施方式中，所述包装载体表达HIV-1 Rev蛋白。在一个优选实施方式中，所述包装载体包含至少一个剪接供体位点 和至少一个剪接受体位点。在一个实施方式中，所述包装载体表达HIV-1Tat 蛋白。

在一个优选实施方式中，所述包装载体缺乏编码HIV-1Vif、Vpr、Vpu、 和/或Nef的序列。所述包装载体可包含编码具有一种或多种本文所述特征的 HIV-1MA蛋白的序列。

在一个实施方式中，所述包装载体仅编码1种HIV-1蛋白，Gag。在一个实 施方式中，所述包装载体仅编码2种HIV-1蛋白，Gag和Pol。在一个实施方式中， 所述包装载体仅编码3种HIV-1蛋白，选自Gag、Pol、Rev和Tat。在一个实施方 式中，所述包装载体仅编码4种HIV-1蛋白，Gag、Pol、Rev和Tat。

在一个实施方式中，所述载体包含(从5’至3’)：CMV启动子、编码HIV-1 Gag-Pol的核酸序列、编码Tat和Rev的部分的外显子、剪接供体位点、包含RRE 的内含子、剪接受体位点、编码Tat和Rev的部分的外显子，以及聚腺苷酸化信 号。优选地，所述HIV-1Gag-Pol是D亚型HIV-1Gag-Pol。

所述包装载体还可包含用于在细菌或真菌细胞中复制的起点。所述包装载 体可包含选择性标志物基因用以选择细菌或真菌细胞。

本发明涉及包含本发明包装载体的宿主细胞。所述宿主细胞可用本发明的 包装载体瞬时转染。所述宿主细胞可以是本发明包装载体已纳入所述宿主细胞 基因组的细胞系。多种不同的细胞是合适的宿主细胞。优选地，所述细胞是人 细胞，最优选地是永生化人细胞系。在一个实施方式中，所述细胞是HEK293T 细胞。在一个实施方式中，所述细胞是HeLA、HT1080或PER C6细胞(Delenda 等,Cells for Gene Therapy and vector Production(用于基因治疗和载体生成的细 胞),收录于Methods in Biotechnology(《生物技术方法》),第24卷：Animal Cell Biotechnology:Methods and Protocols(动物细胞生物技术：方法与方案)，第二版， R.Prtner编，新泽西州托托瓦的胡马纳出版公司(Humana Press Inc.))。

包装系统

本发明涉及慢病毒包装系统，所述慢病毒包装系统包含表达非B亚型Gag 和/或Pol蛋白的细胞。慢病毒“包装系统”在本文中定义为基于细胞的系统，所 述系统包含在Ψ位点缺失下至少表达慢病毒Gag和Pol蛋白，并且能够包装并逆 转录包含Ψ位点的外源核酸的细胞。所述慢病毒包装系统的细胞还能表达其它 病毒蛋白。优选地，所述慢病毒包装系统表达包膜蛋白。所述包膜蛋白可以是 慢病毒的(例如，HIV-1Env)或非慢病毒的(例如，VSV、辛德毕斯病毒、狂犬病 病毒)包膜蛋白。在不同的实施方式中，所述慢病毒包装系统表达HIV-1Tat和/ 或Rev蛋白。

在不同的实施方式中，所述慢病毒包装系统的细胞包含稳定整合进入其基 因组的编码HIV-1Gag和/或Pol的序列。在不同的实施方式中，所述慢病毒包装 系统的细胞包含稳定整合进入其基因组的编码包膜蛋白的序列。在不同的实施 方式中，所述慢病毒包装系统的细胞包含稳定整合进入其基因组的编码HIV-1 Tat和/或Rev的序列。

在不同的实施方式中，所述慢病毒包装系统的细胞瞬时表达HIV-1Gag和/ 或Pol蛋白。在不同实施方式中，所述慢病毒包装系统的细胞瞬时表达包膜蛋白。 在不同实施方式中，所述慢病毒包装系统的细胞瞬时表达HIV-1Tat和/或Rev蛋 白。

所述慢病毒包装系统的细胞可表达非B亚型Gag和Pol蛋白，选自A亚型、C 亚型、D亚型、E亚型、F1亚型、F2亚型、G亚型、H亚型和J亚型蛋白及其重组 子。在一个实施方式中，所述慢病毒包装系统的细胞包含SEQ ID NO:1或表达 SEQ ID NO:2。

在不同实施方式中，所述慢病毒包装系统的细胞表达非B亚型Gag蛋白。所 述非B亚型Gag蛋白可选自：A亚型、C亚型、D亚型、E亚型、F1亚型、F2亚型、 G亚型、H亚型和J亚型蛋白，及其重组子。

在不同实施方式中，所述慢病毒包装系统的细胞表达非B亚型MA蛋白。所 述非B亚型MA蛋白可选自：A亚型、C亚型、D亚型、E亚型、F1亚型、F2亚型、 G亚型、H亚型和J亚型蛋白，及其重组子。优选的包装载体编码SEQ ID NO:3 或SEQ ID NO:2的MA蛋白部分。

在不同实施方式中，所述慢病毒包装系统的细胞可包含本发明的任何慢病 毒载体。

在不同实施方式中，所述慢病毒包装系统的细胞包含SEQ ID NO:1或与 SEQ ID NO:1具有至少95%、96%、97%、98%、99%相同性的核酸序列。在不 同实施方式中，所述慢病毒包装载体的细胞表达具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少95%、96%、 97%、98%、99%相同性的氨基酸序列的蛋白质。

制备包装载体的方法

本发明涉及用于制备编码非B亚型Gag和/或Pol蛋白的包装载体的方法。所 述包装载体可具有任何本文所述特征。

在一个实施方式中，所述方法包括：将来自非B亚型HIV-1病毒的Gag和/ 或Pol序列插入受非HIV启动子(例如，CMV启动子)控制的质粒，以生成包装载 体。在一个实施方式中，所述包装载体仅编码1种HIV-1蛋白。在一个实施方式 中，所述包装载体仅编码两种HIV-1蛋白。在一个实施方式中，所述包装载体 仅编码3种HIV-1蛋白，选自Gag、Pol、Rev和Tat。在一个实施方式中，所述包 装载体仅编码4种HIV-1蛋白，Gag、Pol、Rev和Tat。

在不同实施方式中，所述质粒包含CMV启动子、编码Tat和Rev的部分的外 显子、剪接供体位点、包含RRE的内含子、剪接受体位点、编码Tat和Rev的部 分的外显子，和聚腺苷酸化信号中的一种或多种。

在不同实施方式中，所述包装载体包含CMV启动子、编码Tat和Rev的部分 的外显子、剪接供体位点、包含RRE的内含子、剪接受体位点、编码Tat和Rev 的部分的外显子，和聚腺苷酸化信号。

所述非B亚型HIV-1病毒可选自：A亚型、C亚型、D亚型、E亚型、F1亚型、 F2亚型、G亚型、H亚型，和J亚型病毒，及其重组子。

在一个实施方式中，所述方法包括提供包含HIV-1B亚型病毒的Gag序列的 包装载体，和用来自HIV-1非B亚型病毒的序列替代所述载体中的Gag序列。

所述非B亚型HIV-1病毒可选自：A亚型、C亚型、D亚型、E亚型、F1亚型、 F2亚型、G亚型、H亚型，和J亚型病毒，及其重组子。在一个优选实施方式中， 非B亚型HIV-1病毒是HIV-1NDK。

制备慢病毒载体的方法

本发明还涉及使用编码HIV-1非B亚型Gag和/或Pol蛋白的包装载体来生成 慢病毒载体的方法。在一个实施方式中，本发明涉及向具有慢病毒载体的细胞 给予编码HIV-1非B亚型Gag或Pol蛋白的包装载体。所述包装载体可具有任何本 文所述特征。

所述慢病毒载体包含用于包装和逆转录的顺式作用序列，包括Ψ位点和引 物结合位点。优选地，所述慢病毒载体包含两个HIV-1LTR序列。在一个实施 方式中，所述LTR之一被删除，用于U3和R序列。优选地，所述慢病毒载体包 含中心多嘌呤序列(cPPT)和中心终止序列(CTS)。所述慢病毒载体优选编码慢病 毒或非慢病毒蛋白，例如选择性标志物或肿瘤抗原。

在一个实施方式中，所述慢病毒载体包含一种或多种HIV抗原，优选HIV-1 抗原。最优选地，所述抗原是Gag、Pol、Env、Vif、Vpr、Vpu、Nef、Tat或Rev 抗原。所述抗原可以是来自这些蛋白质的单一抗原、抗原混合物、抗原性多肽 或抗原性多肽的混合物。在一个优选实施方式中，所述慢病毒载体包含HIV-1 p24Gag抗原。

在一个优选实施方式中，本发明涉及包含含有NIS的启动子的慢病毒载体。 “含有NIS的启动子”包含NF-Kb结合位点、干扰素刺激应答元件(ISRE)和SXY组 件(SXY)。天然产生的含有NIS的启动子的示例有β2m启动子和MHC I类基因启 动子。这些天然产生的含有NIS的启动子一般克隆或再生自以下基因的启动子 区：β2m蛋白或MHC I类蛋白的编码基因，或基因组数据库(如：NCBI多核苷酸 数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/dna-rna)中推定为编码此类蛋白质的基 因。β2m和I类MHC蛋白都进入主要组织相容性复合体(MHC)。β2m和I类MHC 启动子序列在基因组数据库中也常如此提及，即，注释为β2m和I类MHC的启动 子序列。

MHC I类和β2-微球蛋白启动子包含含有NIS的启动子的共有结构同源性。 这些启动子也共有在树突细胞中被强激活的能力，以及，在大多数其它人体组 织中以较低强度激活的能力。

在一个实施方式中，所述包装载体和慢病毒载体被一同引入细胞，以允许 形成包含由所述包装载体产生的Gag蛋白和由所述慢病毒载体产生的核酸的慢 病毒载体颗粒。优选地，这通过用所述包装载体和所述慢病毒载体共转染细胞 来实现。所述细胞还可转染有编码Env蛋白(优选VSV糖蛋白G)的核酸。优选地， 所述慢病毒载体颗粒能够进入合适的宿主细胞，并在所述宿主细胞内逆转录和 表达。

在一个实施方式中，所述包装载体或慢病毒载体稳定地整合入细胞，并且 将非整合载体转染入所述细胞，以允许形成慢病毒载体颗粒。

在一个实施方式中，所述方法还包括收集由所述细胞生成的慢病毒载体。

在一个实施方式中，所述方法还包括选择包装载体，所选择的包装载体包 装的慢病毒载体效价高于编码B亚型Gag或Pol蛋白的相同包装载体。优选地， 所述效价相对于编码B亚型Gag或Pol蛋白的包装载体而言增加至至少1.5倍或2 倍。

慢病毒载体颗粒

本发明还涉及包含HIV-1非B亚型Gag和/或Pol蛋白的慢病毒载体颗粒。所 述非B亚型Gag和Pol蛋白可具有本文所述的任何特征。

所述慢病毒载体颗粒包含含有用于包装和逆转录的顺式作用序列的核酸， 包括与Gag、Pol和Env蛋白相关联的Ψ位点和引物结合位点。优选地，所述核酸 包含两个HIV-1LTR序列。在一个实施方式中，所述LTR之一被删除，用于U3 和R序列。优选地，所述慢病毒载体颗粒的核酸包含中心多嘌呤序列(cPPT)和 中心终止序列(CTS)。所述核酸优选编码慢病毒或非慢病毒蛋白，例如选择性 标志物或肿瘤抗原。优选地，所述慢病毒载体颗粒包含VSV糖蛋白。

优选地，所述慢病毒载体包含含有NIS的启动子。在一个实施方式中，所 述启动子是β2m启动子。

在一个实施方式中，所述慢病毒载体包含一种或多种HIV抗原，优选HIV-1 抗原。最优选地，所述抗原是Gag、Pol、Env、Vif、Vpr、Vpu、Nef、Tat或Rev 抗原。

可将本发明的慢病毒载体给予宿主细胞(包括人宿主)。

所述慢病毒载体颗粒可包含针对特定细胞类型的靶向机制。参见，例如， Yang等,Targeting lentiviral vectors to specific cell types in vivo(体内靶向慢病毒 载体到特定细胞类型),PNAS113(31):11479-11484(2006)，其通过引用纳入本 文。靶向可通过与细胞上的细胞表面蛋白结合的抗体来实现。靶标细胞类型优 选是树突细胞、T细胞、B细胞。优选靶向树突细胞类型，并且可通过与DC表 面蛋白特异性结合的包膜蛋白来实现。参见，例如，Yang等,Engineered  Lentivector Targeting of Dendritic Cells for In Vivo(工程改造的慢病毒载体对树 突细胞的体内靶向),Nat Biotechnol.2008March;26(3):326–334，其通过引用纳 入本文。本发明还涉及本发明的慢病毒载体，尤其是慢病毒载体颗粒形式，用 于制备治疗性组合物或疫苗的应用，所述治疗性组合物或疫苗能够诱导或造成 针对表位发生免疫反应或该反应的增强，所述免疫反应更特定地是针对由存在 于所述载体中的转基因编码的那些表位。

实施例

实施例1.质粒构建

gag-pol基因采用通过PCR扩增得到，使用两个引物并以HIV-1NDK的克隆 pNDK-N作为模板。为了获得pThV-GP-N质粒，所得PCR产物用EagI/SalI消化并 插入同样用EagI/SalI消化的包装构建体p8.74。

实施例2.通过转染生成慢病毒载体

使用pFLAP CMV GFP bis和pTHV-VSV.G(INDI-CO)bis联合p8.74或 pThV-GP-N。进行了36次转染，18次采用p8.74且18次采用pThV-GP-N。所有上 清液贮存在-80℃。

质粒pFLAP-CMV GFP bis编码绿色荧光蛋白(GFP)，其表达可通过流式细 胞术来检测。

实施例3.慢病毒载体产量的滴定检测

载体效价通过293T细胞中GFP表达的频率来测定。细胞在24孔板内培养于 含有10%FBS的DMEM中，直至其达到1×10⁵细胞/孔的密度。然后，用内含不 同体积载体上清液的300μL终体积转导细胞。2小时后，向各孔添加700μl含有 10%FBS的新鲜培养基。转导后72小时，移去培养基并在Dulbecco磷酸盐缓冲 盐水(DPBS;吉布可公司(Gibco))中洗涤细胞。用0.05%Trypsin-EDTA(吉布可 公司)移出细胞。通过添加300μl完全DMEM来停止胰酶消化，并将细胞转移至 管以供FACS，此后采用FACSCalibur(BD生命科学公司)用509nm的激发波长对 表达GFP的细胞计数。仅考虑30%以下的GFP阳性细胞百分比。

结果见图3。观察到pThV-GP-N和p8.74载体产量之间有显著差异，采用 pThV-GP-N质粒获得较高效价。事实上，采用包装质粒pThV-GP-N所得载体效 价是采用常规应用的质粒p8.74所得载体效价的两倍(据斯氏检验：p<0.001)。

实施例4.采用pThV-GP-N的慢病毒载体效价增加

HIV-1BRU和HIV-1NDK病毒由293T细胞制备，并且用于转导P4CCR5细 胞。这些细胞包含HIV LTR控制下的稳定的荧光素酶基因：若其被转导了TAT 蛋白(这是其被野生型HIV感染的情况)，LacZ基因被表达并且能够测得荧光素 酶表达。检测HIV-1Gag p24和荧光素酶表达。结果示于图4，并且确定野生型 NDK病毒的转导率高于野生型BRU病毒。

实施例5.采用pThV-GP-N使p24和效价增加

采用不同比例的p8,74和pSD GP NDK包装载体来生成慢病毒载体颗粒。对 于各比例，检测效价和P24水平。结果示于图5，并且证明存在NDK包装质粒， 其造成产出效价和P24水平的升高。

实施例6.采用pThV-GP-N使p24加工减少

采用包装载体p8.74和pTHV-GP-N来生成包含慢病毒载体颗粒的上清液。 使用NIH抗-P24MAB(183-H12-5C)对所述上清液进行Western印迹实验。结果 示于图6，并且根据P24蛋白和前体的产量确定NDK和BRU包装质粒之间有差 异，NDK看来产生更高的P24合成(在病毒上清液中存在P24前体)，而BRU在病 毒上清液中仅显示有P24。