一种用于检测五常大米主要品种的引物对、检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种用于检测五常大米主要品种的引物对、检测试剂盒及其检测方法，所述引物对，包括：特征DNA片段S48-468引物对，核苷酸序列为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；特征DNA片段S75-632/692引物对，核苷酸序列为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示；特征DNA片段S43-1000引物对，核苷酸序列为SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示；特征DNA片段SBE1引物对，核苷酸序列为SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示；特征DNA片段S73-2438引物对，核苷酸序列为SEQIDNO：9和SEQIDNO：10所示。本发明可实现通过一次多重PCR反应进行五常大米主要品种鉴定的目的，从而实现对五常大米品种的快速检测。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学方法检测领域，尤其是涉及一种用于检测五常大米主要品种的引物对及其检测方法。

 

背景技术

一、五常大米主要品种

按GB/T19266-2008《地理标志产品 五常大米》标准的规定，五常大米可使用的品种被界定为“五优稻、松粳系列及通过审定的其它符合五常种植条件的优质粳稻品种”，据估计，五常大米有40多个品种。按照文献及网上数据库查询到的信息，五常大米的主要品种有：（1）五优稻系列：包括由田永太育成的五优稻1号及五优稻4号（五优稻4号为目前五常大米主栽品种），以及不同育种单位以五优稻1号为亲本选育出的大米品种，如五常市龙凤山长粒香水稻研究所和五常市种子公司育成的五优稻3号（五优C），黑龙江省农业科学院五常水稻研究所育成的五优稻A，黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所育成的龙稻7号、龙香稻2号，东北农业大学育成的东农425、东农426、东农427、东农428、东农429、东农430，黑龙江省五常种子公司和哈尔滨工业大学生命科学工程所育成的五工稻1号，黑龙江省监狱管理局农业科学研究所育成的龙盾106，这些品种在遗传上均为五优稻1号的后代。（2）松粳系列：包括由黑龙江省农业科学院第二水稻所育成的松粳3、松粳6、松粳7、松粳8、松粳9、松粳10、松粳12，黑龙江省农业科学院五常水稻研究所育成的松粳香1号、松粳香2号，松粳系列的部分品种与五优稻1号具有遗传亲缘关系。

从遗传系谱看，五优稻1号骨干亲本是从松粳3号品系变异个体中经系统选育成，而以五优稻1号为亲本培育出的品种有：五工稻1号、五优稻3号、五优稻4号、松粳7号、松粳8号、松粳9号、松粳12号、龙稻7号、东农425、东农426、东农427、东农428、东农429、东农430、龙盾106。因而，上述这些品种与五优稻1号及五优稻4号亲缘关系相近。

二、五常大米主栽品种五优稻4号的特征

据专家估计，五常市的200万亩水稻种植田中，约90%的稻田种植五优稻4号，五优稻4号是五常大米的主栽品种。五优稻4号由黑龙江省五常市中粮美裕长粒香水稻研究所的田永太于1999年育成，是从五优稻1号优良变异株中经4代系统选育而成的常规种，并于2009年通过审定（审定编号为黑审稻2009005）。五优稻4号为晚熟品种，生育期138-140天，所需活动积温2800℃，株高98-105cm，穗长25cm，穗粒数110粒，千粒重28g，分蘖能力中上，抗病性强，抗倒能力中等。受产区独特的地理、气候等影响，五优稻4号干物质积累多、水稻成熟期产区昼夜温差大，大米中可速溶的双链糖积累较多。但五优稻4号存在熟期晚，抗倒能力差等缺点，栽培方法不当就可能导致成熟期拖后、倒伏而严重减产。

综合多个研究资料，五优稻4号糙米率为82～84%，精米率为70～76%，整精米率为65～70%，长宽比为2.5～2.7，垩白度为1～3%，胶稠度为67～73mm，直链淀粉为17～18%，蛋白质含量为6.0～6.6%，食味评分为85～93分，属于一级优质米。五优稻4号品种粒型细长，五优稻4号的米粒为长粒，青白透明，蒸煮时具备特有的清香味，饭粒表面有油光，口感绵软略粘、微甜、略有韧性，冷却后仍保持良好口感，剩饭不回生。与五优稻4号在米粒型状相似的品种出现较多（如松粳6号、松粳7号、松粳9号、五优稻1号），但远不及五优稻4号食味好。

三、五常大米的常见掺假手段

五常市水稻种植面积不是很大，年产仅80万吨，而每年国内市场销售的五常大米达1000多万吨，可见市面上销售的五常大米存在较多的掺假造假现象。据报道，不法商家使用639或非五常产的普通长粒米冒充“稻花香”，或将仙桃香米和五常圆江米混合冒充“五常稻花香”，或在普通大米中添加香精冒充“五常稻花香”。五常大米主栽品种五优稻4号的出米率最高为每100斤出米58斤，收购价在2.4-2.7元/斤，价格在10元/斤以上的才有可能是100%纯正的五优稻4号。因而，由于五常大米（特别是五优稻4号）独特和美味的品质及口感，正宗的五常大米价格较为昂贵，给了不法大米企业及商家有利可图的造假动机。 

五常市共有290多家大米生产企业，目前核准允许使用地理标志保护产品专用标志的大米企业为92家，仍有一些企业在第二批申请使用地理标志保护产品专用标志。在米业公司实际生产和销售过程中，存在较多不规范行为：（1）由于五优稻4号的稻谷收购价常年较低，因而米业公司一般会默许农民掺入其它的米。当米业公司生产的米掺杂有其它的品种时，米业公司常见的解决方法是不使用地理标志保护产品专用标志，而改用较模棱两可的标志，厂址注明为五常市，并经常使用“稻花香”等非正规命名，以规避标签不合格情况。（2）由于地理环境条件相近，吉林省榆树县及黑龙江省尚志县种植的五优稻4号与五常市的五优稻4号口感相差不大，但由于吉林省榆树县及黑龙江省尚志县不属于五常大米地理标志产品保护区域，因而此两个地方产出的五优稻4号多卖入五常市，并由五常市加工出售。（3）不法商家直接使用非五常大米品种进行冒充或掺杂。

常用于掺入五优稻4号的大米品种有639、东农425、东农428、吉林101、农阳16号。在掺假的品种中，由于639不抗病，现在种植较少，而东农425、东农428最常用于五常大米的掺假。由于东农425、东农428与五优稻4号遗传亲缘关系近，米粒外型极为相近，给鉴定工作带来极大难度。

五常大米掺假造假现象非常严重，不仅造成了消费者的经济损失，也严重损害了“五常大米”的品牌形象，破坏了“地理标志”产品的信誉，影响了市场秩序，给监管工作带来极大的困难。

四、现有的五常大米品种鉴定方法

五常大米品种的鉴定仅是由育种专家的肉眼观察和经验判断，目前仍无有效的鉴定方法，主要原因在于：（1）五常大米主要品种众多，达40多种，且多数品种亲缘关系相近，部分品种的大米外观极为相近（如东农425、东农428与五优稻4号的大米外观相近），感官鉴定方法的准确度在很大程度上依赖于育种专家的知识水平和经验，很容易出现误判结果。（2）网络数据库上无五常大米主要品种的DNA序列，因而无法直接通过五常大米主要品种的DNA序列设计引物，以达到通过DNA方法鉴别五常大米主要品种的目的。（3）五常大米的品种多，需要搜集五常大米主要品种以及掺杂至五常大米的常见大米品种的难度较大。

 

发明内容

本发明目的在于提供用于检测五常大米主要品种的引物对及其试剂盒和检测方法。本发明使用随机扩增多态性DNA（RAPD）对五常大米主要品种（五优稻4号及其衍生品种、五优稻1号、东农425、东农428、松粳9号、松粳6号、松粳3号、松粳香2号）以及掺杂至五常大米的常见品种（639、绥精4号等）进行PCR扩增，从中筛选出各品种特异性条带，开发成SCAR标记，可实现通过一次多重PCR反应进行五常大米主要品种鉴定的目的，从而实现对五常大米品种的快速检测。

为实现本发明的目的，采用的技术方案为：

1、一种用于检测五常大米主要品种的引物对，包括：

特征DNA片段S48-468引物对，所述引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

特征DNA片段S75-632/692引物对，所述引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

特征DNA片段S43-1000引物对，所述引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；

特征DNA片段SBE1引物对，所述引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；

特征DNA片段S73-2438引物对，所述引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。

2、包括前述引物对的五常大米主要品种检测试剂盒。

一种检测五常大米主要品种的方法，包括步骤：

（1）配制PCR反应体系，进行多重PCR扩增；

（2）PCR扩增条件为：95℃ 3min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，35个循环，72℃ 10min；

（3）凝胶电泳检测扩增产物。

所述PCR反应体系为：

10×PCR buffer                             2μL

dNTP mixture（各2.5mM）        1.6μL

MgCl₂（25mM）                          1.2μL

Taq酶（5U/μL）                          0.1μL

引物1（10uM）                           各0.1μL

引物2（10uM）                           各0.2μL

DNA模板（50ng/μL）                       2μL

灭菌超纯水                                    11.9μL

总体积                                           20μL。

注：引物1指SEQ ID NO：1～8；引物2指SEQ ID NO：9～10；10×PCR buffer含100mM Tris-HCl（pH8.3）、500mM KCl。

 

附图说明

图1特征DNA片段S48-468引物扩增结果。注：M：100bp DNA Ladder Marker；C：PCR空白对照；1-23：五优稻4号-1、五优稻4号-2、五优稻4号-19、五优稻4号-20、五优稻1号、东农425、东农428、639、松粳9号、松粳6号、松粳3号、松粳香2号、清荷香1号、长粒香、绥粳4号、绥香5号、五优稻4号-6、沃科收05-97、五优稻4号（早2）、五优稻4号-16、沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1号。

图2特征DNA片段S75-632/692引物扩增结果。注：M：1kb plus DNA Ladder；C：PCR空白对照；1-23：五优稻4号-1、五优稻4号-2、五优稻4号-19、五优稻4号-20、五优稻1号、东农425、东农428、639、松粳9号、松粳6号、松粳3号、松粳香2号、清荷香1号、长粒香、绥粳4号、绥香5号、五优稻4号-6、沃科收05-97、五优稻4号（早2）、五优稻4号-16、沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1号。

图3特征DNA片段S43-1000引物扩增结果。注：M：1kb plus DNA Ladder；C：PCR空白对照；1-23：五优稻4号-1、五优稻4号-2、五优稻4号-19、五优稻4号-20、五优稻1号、东农425、东农428、639、松粳9号、松粳6号、松粳3号、松粳香2号、清荷香1号、长粒香、绥粳4号、绥香5号、五优稻4号-6、沃科收05-97、五优稻4号（早2）、五优稻4号-16、沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1号。

图4特征DNA片段SBE1引物扩增结果。注：M：100bp DNA Ladder Marker；C：PCR空白对照；1-23：五优稻4号-1、五优稻4号-2、五优稻4号-19、五优稻4号-20、五优稻1号、东农425、东农428、639、松粳9号、松粳6号、松粳3号、松粳香2号、清荷香1号、长粒香、绥粳4号、绥香5号、五优稻4号-6、沃科收05-97、五优稻4号（早2）、五优稻4号-16、沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1号。

图5特征DNA片段S73-2438引物扩增结果。注：M：1kb plus DNA Ladder；C：PCR空白对照；1-23：五优稻4号-1、五优稻4号-2、五优稻4号-19、五优稻4号-20、五优稻1号、东农425、东农428、639、松粳9号、松粳6号、松粳3号、松粳香2号、清荷香1号、长粒香、绥粳4号、绥香5号、五优稻4号-6、沃科收05-97、五优稻4号（早2）、五优稻4号-16、沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1号。

图6特征DNA片段引物多重PCR扩增结果。注：M：1kb plus DNA Ladder；C：PCR空白对照；1-23：五优稻4号-1、五优稻4号-2、五优稻4号-19、五优稻4号-20、五优稻1号、东农425、东农428、639、松粳9号、松粳6号、松粳3号、松粳香2号、清荷香1号、长粒香、绥粳4号、绥香5号、五优稻4号-6、沃科收05-97、五优稻4号（早2）、五优稻4号-16、沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1号。

图7 五常大米主要品种的特征DNA指纹图谱。从左到右，第一排分别是：五优稻4号及其衍生品种；东农425、东农428；松粳9号；五优稻1号、松粳6号；松粳香2号；从左到右，第二排分别是：639、松粳3号、绥香5号、沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1号；绥粳4号；长粒香；沃科收05-97。

具体实施方式

一、五常大米主要品种特征DNA片段开发

（1）本研究使用的五常大米品种

五常大米主要品种：五优稻4号、五优稻1号、东农425、东农428、松粳9号、松粳6号、松粳香2号、清荷香1号、五优稻4号（早2）。

其它品种有：639、长粒香、绥粳4号、绥香5号、沃科收05-97、沃科收05-97、沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1号。

在五常大米主要品种中，目前主栽品种为五优稻4号，五常市的200万亩水稻种植田中，约90%的稻田种植五优稻4号。

（2）DNA模板的制备

用粉碎机粉碎样品，称取约100mg，加入800μL 2%CTAB提取液，65℃水浴3h；12000rpm离心5min，将上清液转移至新离心管；加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混合成均匀相，12000rpm离心10min，将上清液转移至新离心管；加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），混合成均匀相，12000rpm离心10min，将上清液转移至新离心管；加入1/10体积3mol/L 乙酸钠（pH5.2）和等体积异丙醇，-20℃沉淀过夜；12000rpm离心15min，倒去上清；使用70%乙醇洗涤沉淀两次，超净台中吹干；加入50μL灭菌去离子水（含1mg/mL RNase）溶解沉淀，37℃水浴30min；使用紫外分光光度计测定分光，准确稀释到50ng/μL，-20℃储存备用。

（3）特征DNA片段筛选及引物设计

通过使用100个RAPD引物对上述五常大米品种进行RAPD-PCR反应，从中筛选出可用于五常大米品种鉴定的5个特征DNA片段，5个特征DNA片段分别为S48-468、S75-632/692、S43-1000、SBE1、S73-2438，并在此5个特征DNA片段的基础上设计SCAR引物。

引物设计使用DNAMAN软件进行，考虑到进行多重PCR反应，引物设计时考虑的因素为：（1）将该片段的两端RAPD引物设置为SCAR引物的5’端或3’端，从而保证SCAR引物与RAPD引物具有相同的特异性；（2）各条引物的Tm值统一为62℃左右，以保证在同一退火温度下各引物的扩增效果一致；（3）各引物形成的二聚体少，以减少引物二聚体损耗；（4）引物在NCBI数据库进行Blast比对时特异性好，以保证方法的有效性。

（4）单重PCR反应液配制

10×PCR buffer2μLdNTP mixture（各2.5mM）1.6μLTaq酶（5U/μL）0.1μLMgCl₂（25mM）1.2μL上游引物（10uM）0.5μL下游引物（10uM）0.5μLDNA模板（50ng/μL）2μL灭菌超纯水12.1μL总体积20μL

注：10×PCR buffer含100mM Tris-HCl（pH8.3）、500mM KCl。

（5）反应条件

普通PCR仪上的运行条件为：95℃ 3min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，35个循环，72℃ 10min。

（6）特征DNA片段单重PCR扩增结果

特征DNA片段S48-468：位于水稻染色体10，片段长度为468bp，Blast比对结果显示该片段为Putative disease resistance protein的内含子，五优稻4号与与日本晴序列相比有多个缺失及碱基突变。在所分析的五常大米品种中，该片段为五优稻4号、松粳香2号、清荷香1号、五优稻4号（早2）、沃科收05-97的特征DNA片段。

特征DNA片段S75-632/692：位于水稻染色体6，Blast比对结果表明为putative strictosidine synthase（甘蓝型油菜异胡豆苷合成酶）内含子。在所分析的五常大米品种中，五优稻4号、五优稻1号、东农425、东农428、松粳6号、松粳香2号、清荷香1号、五优稻4号（早2）扩增出632bp片段，639、松粳9号、松粳3号、绥香5号、沃科收05-97、沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1号扩增出692bp片段，长粒香、绥精4号同时扩增出632bp和692bp片段。

特征DNA片段S43-1000：位于水稻染色体3，具体功能未知，在所分析的五常大米品种中，东农425、东农428扩增出1000bp片段，其余品种扩增出1300bp片段，该片段为东农425、东农428特征DNA片段。

特征DNA片段SBE1：位于水稻染色体6，为水稻淀粉分支酶I基因的调控区，松粳9号、松粳香2号和长粒香扩增出548bp片段，其余品种扩增出882bp片段，该片段为松粳9号、松粳香2号及长粒香的特征DNA片段。

特征DNA片段S73-2438：位于水稻染色体8，片段长度为2438bp，Blast结果表明为hypothetical ORF，但具体功能未知。所分析的五常大米品种中，五优稻1号、东农425、东农428、639、松粳9号、松粳6号、松粳3号、长粒香、绥粳4号、绥香5号、沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1号有扩增，该片段为这些品种特征DNA片段。

 

二、特征DNA片段的多重PCR检测

（1）多重PCR反应液配制

10×PCR buffer2μLdNTP mixture（各2.5mM）1.6μLTaq酶（5U/μL）0.1μLMgCl₂（25mM）1.2μL引物1（10uM）各0.1μL引物2（10M）各0.2μLDNA模板（50ng/μL）2μL灭菌超纯水11.9μL总体积20μL

注：引物1指SEQ ID NO：1～8；引物2指SEQ ID NO：9～10；10×PCR buffer含100mM Tris-HCl（pH8.3）、500mM KCl。

（2）反应条件

普通PCR仪上的运行条件为：95℃ 3min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，35个循环，72℃ 10min。

（3）标准大米品种扩增图谱建立

使用标准大米品种，提取样品DNA，并进行多重PCR反应，从而构建了标准大米品种扩增图谱（图6）。按扩增图谱的差异，可分为（表1）：（1）五优稻4号及其衍生品种（五优稻4号、清荷香1号、五优稻4号（早2））；（2）东农425、东农428；（3）松粳9号；（4）五优稻1号、松粳6号；（5）松粳香2号；（6）长粒香；（7）绥粳4号；（8）沃科收05-97；（9）639、松粳3号、绥香5号、沃科收05-38、沃科收05-98、通粘1号。

因而，通过本专利的多重PCR方法，可实现：（1）从五常大米中鉴定出五优稻4号及其衍生品种，而五优稻4号为目前五常大米主栽品种；（2）从五常大米中鉴定出其它常用品种，如东农425、东农428、松粳9号、松粳香2号、五优稻1号等；（3）从五常大米中鉴定出常用于掺假的品种，如639、绥精4号。

 

（4）混合样品检出限

将五优稻4号与松粳9号按不同比例混合，混合比例为0%，1%，2%，5%，10%，25%，50%，75%，90%，95%，98%，99%，100%，结果表明，混合样品的检出限为10%。

（5）样品检测实验

于黑龙江省五常市采集60个五优稻4号大米样品，使用本多重PCR方法进行检测，结果表明，60个样品中，22个样品为100%五优稻4号，15个样品为五优稻4号掺杂有松粳9号或长粒香，4个样品为五优稻4号掺杂五优稻1号或松粳6号，7个样品为五优稻4号掺杂639等品种，1个样品为五优稻4号掺杂松粳香2号，或是纯松粳香2号，11个样品为五优稻4号掺杂未知大米品种。

于市面购买66个五优稻4号大米样品，使用本多重PCR方法进行检测，结果表明，仅有14个大米样品为100%五优稻4号，6个大米样品为松粳9号，1个大米样品为639，15个样品为五优稻4号混杂有松粳9号或长粒香，4个样品为五优稻4号混杂639等品种，1个样品为五优稻4号混杂松粳香2号，或为松粳香2号，25个样品为五优稻4号混杂未知品种。

通过对总共126个样品的检测实验表明，使用本多重PCR方法，可用于对大米样品进行检测，可鉴定出五常大米产品是否为五常大米主要品种，也可确定大米产品是否有混杂其它品种以及混杂的品种名称。

大米品种鉴定的DNA指纹图谱技术或蛋白质指纹图谱技术均需要使用多对引物或多种蛋白，如国家标准GB/T20396使用SSR指纹图谱技术进行三系杂交水稻及亲本真实性和品种纯度鉴定时，需要使用12对SSR引物，从而需要进行多次PCR反应及电泳。

本发明采集了五常大米主要品种及掺杂至五常大米的常见品种，从100个RAPD引物中筛选出5对特征DNA片段，并设计出SCAR引物，进行多重PCR反应，可通过一次PCR反应及一次电泳检测即可快速检测五常大米品种。

传统大米品种鉴定方法是通过大米育种专家的肉眼观察和经验判断，结果的准确度在很大程度上依赖于育种专家的知识水平和经验，容易出现误判结果。本发明设计了多重PCR反应，通过五常大米品种不同扩增图谱进行判读，结果直观客观，可避免人为判断，对操作人员的经验要求不高，操作方便快捷，可大大减少错误判断的概率。

 

核苷酸序列表

<110>深圳市质量检测研究院

<120>一种用于检测五常大米主要品种的引物对、检测试剂盒及其检测方法

<160> 10

<210> 1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 1

5’-GTGTGCCCCAGGGATATAAGT-3’

<210> 2

<211> 19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>  2

5’-GTGTGCCCCACGCTATACC-3’

<210> 3

<211> 19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>  4

5’-GACGGATCAGATAGTGGTGGA-3’

<210> 4

<211> 19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

5’-GACGGATCAGCTCGGTTTG-3’

<210>5

<211> 19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

5’-ATCGTCGCCGTCAGATAACT-3’

<210> 6

<211> 19

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 6

5’-GTCGCCGTCAAATGTAAATGT-3’

<210> 7

<211> 19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

5’-GAGTTGAGTTGCGTCAGATC-3’

<210> 8

<211> 19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

5’-AATGAGGTTGCTTGCTGCTG-3’

<210>9

<211> 19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

5’-GTCCTATTGTCCCTTTACGTT-3’

<210> 10

<211> 19

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 10

5’-GCATAAAGCCTCGTCTATTAAG-3’