天山云杉体细胞胚愈伤组织的诱导培养方法及其专用诱导培养基

摘要

本发明公开了天山云杉体细胞胚愈伤组织的诱导培养方法，是分别于6月下旬、7月下旬和9月分别采集天山云杉球果或种子，消毒并清洗后，分别取出带胚乳的未成熟合子胚、不带胚乳的未成熟合子胚和成熟合子胚接种于培养基上进行诱导培养，得到胚性愈伤组织；同时还提供了专用的诱导培养基。本发明的有益效果为：此诱导方法的建立和培养基的制备，为进入后期天山云杉体细胞胚遗传转化导入实用性目的基因，及克隆奠定了基础，为天山云杉种质保存、人工种子、原生质体培养、树种改良和生态环境建设提供有利条件。

说明书

 

技术领域

本发明涉及植物组培领域，具体涉及天山云杉体细胞胚愈伤组织的诱导培养方法及其专用诱导培养基。

背景技术

天山云杉(Picea schrenkiana Fisch. at Mey.)属松科云杉属，为中亚和亚洲中部山地特有种，在中国仅分布于天山，是新疆山区最重要的森林树种之一，面积约52.84万hm2，占全疆天然有林地总面积44.9%，是新疆山地森林中分布最广、蓄积量最大、经营活动最多、用途最广、材质优良的主要用材树种，对天山的水源涵养、水土保护、林区生态系统的形成和维护发挥着不可替代的作用。

由于天山云杉分布区人类活动频繁及不合理的经营管理和林牧矛盾等因素造成天山云杉林生态系统结构严重受损，导致了天山云杉林的衰退。天然更新不良或天然更新困难等问题的出现已成为长期困惑林业工作者的一大难题。云杉树种生长较慢，种子成熟率很低，繁殖和品种选育有很大困难。从种子萌发到长成可以移栽的小苗，又需经过4-5年，所以通过自然繁殖进行育种和选择优良基因型效率太低。采用嫁接、扦插等营养繁殖的方法既消耗大量的时间和劳动力，又受季节的限制。

目前天山云杉主要通过有性繁殖产生后代，无性繁殖一直受到各国林业决策部门的重视与林木育种工作者以及森林经营者的特别关注，尤其是现代生物技术的蓬勃发展，如植物组织培养及体细胞胚胎发生技术，具有繁殖效率高、周期短、不受自然条件制约、稳定、选育优良品种，对造林工程具有重大意义等特点。通过体细胞胚胎发育途径实现植株再生不仅可以解决无性繁殖的问题，对于生物技术在云杉属中的具体应用及其树种的品质改良也具有十分重要的意义。在天山云杉体细胞胚胎发生过程中，经由组织培养方法诱导愈伤组织，并由愈伤组织获得体细胞胚胎，是目前人工种子研究和生物技术中广泛应用的手段之一。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了天山云杉体细胞胚愈伤组织的诱导培养方法及其专用诱导培养基。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：天山云杉体细胞胚愈伤组织的诱导培养方法，包括以下步骤：

1）于6月下旬采集天山云杉球果，即带胚乳的未成熟合子胚，作为材料，将球果用质量百分浓度为0.2% 的HgCl₂溶液消毒10分钟后，用无菌水冲洗3次；用摄子从球果中取出未成熟种子，从侧部划开种壳,取出种仁，划破内种皮，挑开胚乳，将嫩胚同胚乳一起接种于天山云杉体细胞胚愈伤组织的诱导培养基上；每皿培养基中接种4个，重复20次，在温度为23±2℃下暗培养15-25天，得到白色半透明的胚性愈伤组织；

2）于7月下旬采集天山云杉球果，即不带胚乳的未成熟合子胚，作为材料，将球果用质量百分浓度为0.2% 的HgCl₂溶液消毒10分钟后，用无菌水冲洗3次；用摄子从球果中取出基本成熟种子，从纵向裂开种子，取出种胚，接种于天山云杉体细胞胚愈伤组织的诱导培养基上；每皿培养基中接种4个，重复20次，在温度为23±2℃下暗培养15-25天，得到白色半透明的胚性愈伤组织；

3）于9月采集天山云杉成熟种子，即成熟合子胚，作为材料，将种子用质量百分浓度为0.2%的HgCl₂溶液消毒5分钟后，用无菌水冲洗3次；用摄子从种子中取出成熟合子胚，接种于天山云杉体细胞胚愈伤组织的诱导培养基上；每皿培养基中接种4个，重复20次，在培养温度为23±2℃下暗培养15-25天，得到白色半透明的胚性愈伤组织。

进一步的，上述的天山云杉体细胞胚愈伤组织的诱导培养方法，所述步骤1）-3）中所用的天山云杉体细胞胚愈伤组织的诱导培养基为添加有植物生长素2,4-D和植物细胞分裂素BAP的DCR培养基。

进一步的，上述的天山云杉体细胞胚愈伤组织的诱导培养方法，所述天山云杉体细胞胚愈伤组织的诱导培养基中，植物生长素2,4-D的浓度为20μM，植物细胞分裂素BAP的浓度为5μM。

本发明的第二个目的是提供了天山云杉体细胞胚愈伤组织的专用诱导培养基，所述培养基为添加有植物生长素2,4-D和植物细胞分裂素BAP的DCR培养基；其中，植物生长素2,4-D的浓度为20μM，植物细胞分裂素BAP的浓度为5μM。

本发明的有益效果为：本发明提供的天山云杉体细胞胚愈伤组织的诱导培养方法及其专用诱导培养基，是通过筛选天山云杉体细胞胚进行诱导，针对其体细胞发生情况，分析影响天山云杉体细胞胚的诱导率，从而建立的适合天山云杉体细胞胚的诱导方法和诱导培养基。此诱导方法的建立和培养基的制备，为进入后期天山云杉体细胞胚遗传转化导入实用性的目的基因，并进行克隆奠定基础，为天山云杉种质保存、人工种子、原生质体培养、树种改良和生态环境建设提供有利条件。首先有助于从细胞水平上了解体细胞胚诱导机理和提高胚状体的发生频率；其次，进一步了解天山云杉体细胞胚愈伤组织的发生规律，为建立天山云杉体细胞胚再生体系提供理论依据。

附图说明

图1为六种激素浓度组合的诱导培养基对天山云杉成熟合子胚愈伤组织的诱导率。

其中，所得结果为平均值。

具体实施方式

实施例1：

1、试验材料和方法：

A：6月下旬采集天山云杉球果（带胚乳的未成熟合子胚：未完全形成合子胚是指合子胚未进入第一发育阶段）作为材料。将球果用质量百分浓度为0.2%的HgCl₂溶液消毒10分钟后，用无菌水冲洗3次。用摄子从球果中取出未成熟种子，从侧部划开种壳,取出种仁，划破内种皮，挑开胚乳，将嫩胚同胚乳一起接种于培养基上；每皿接种4个，重复20次，材料在温度为23±2℃下暗培养。15-25天根据诱导愈伤组织颜色、形态、结构等特征及显微观察结果区分出白色半透明的胚性愈伤组织。

B：7月下旬采集天山云杉球果(不带胚乳的未成熟合子胚：合子胚的第一至第三发育阶段)作为材料。将球果用质量百分浓度为0.2%的HgCl₂溶液消毒10分钟后，用无菌水冲洗3次。用摄子从球果中取出基本成熟种子，从纵裂种子，取出种胚，接种于培养基上；每皿接种4个，重复20次，材料在温度为23±2℃下暗培养。15-25天根据诱导愈伤组织颜色、形态、结构等特征及显微观察结果区分出白色半透明的胚性愈伤组织。

C：9月份采集天山云杉成熟种子(成熟合子胚)作为材料。将种子用质量百分浓度为0.2%的HgCl₂溶液消毒5分钟后，用无菌水冲洗3次。用摄子从种子中取出成熟合子胚，接种于培养基上；每皿接种4个，重复20次，体细胞胚胎的诱导过程在培养温度为23±2℃下暗培养。15-25天根据诱导愈伤组织颜色、形态、结构等特征及显微观察结果区分出白色半透明的胚性愈伤组织。

基本培养基：培养基是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基培养才有可能成功。

诱导培养基：

天山云杉体细胞胚愈伤组织的诱导培养基为DCR (GUPTA & DURZAN，1985)，首先添加大量元素（10-40倍浓缩）和微量元素（100倍浓缩）的储备液。然后添加铁盐，88 mM的蔗糖，有机成分和生长调节剂等的溶液，然后加蒸馏水定容。调pH值先用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的稀NaOH或稀HCI溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，一直到培养基的pH调整到5.8±0.02为止，最后倒入含有3g/L Gelrite（卡拉胶）为固化剂的瓶中，封口准备消毒。灭菌温度在121℃下，2x107Pa的压力下进行15分钟高压灭菌。作为高温，如4.8mML-谷氨酰胺的结果可能会受到影响的物质，所以过滤灭菌，然后高压灭菌后，在最高温度为60℃的介质。用美国Corning Costar公司生产的孔径为0.22μm过滤被用。灭菌后培养器皿中培养基自然冷却凝固，最好放置1d后再使用。

体细胞胚的诱导,一般在含有较高浓度的生长素和较高浓度的细胞分裂素的固体培养基上进行。它的诱导与外植体的年龄、生理状态、培养基的组成、激素的种类和浓度、培养条件等有关。合子胚的发育时期是培养物诱导的一个重要因素。培养基中激素浓度组合，设计6种分化培养基的对比试验，了解天山云杉体细胞愈伤组织的最佳培养基，当2,4-D作为生长素添加，而BAP和TDZ作为细胞分裂素添加，6种激素浓度组合的诱导培养基具体方案如表1所示。

表1

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2、结果与分析：

天山云杉体细胞胚在DCR含有浓度为20μM的2,4-D（作为生长素）和浓度为5μM的BAP（细胞分裂素）的环境下接种诱导培养7天后，外植体膨大，颜色变化明显，10-15天即有不同类型的愈伤组织产生。其中，部先膨大，随后从基部产生白色略黄、透明的丝状愈伤组织，为胚性愈伤组织诱导百分率可达带胚乳的未成熟合子胚为32.4%,不带胚乳的未成熟合子胚为83%和成熟合子胚为60%。顶部膨大产生的浅黄白色、结构稍松、质地软、颗粒状愈伤组织，为非胚性愈伤组织百分率可达带胚乳的未成熟合子胚为10.6%、不带胚乳的未成熟合子胚为6.8%和成熟合子胚为40%。本研究结果为今后体细胞胚胎发育研究奠定了基础。研究表明，天山云杉体细胞胚胎发生的各发育阶段（带胚乳的未成熟合子胚、不带胚乳的未成熟合子胚和成熟合子胚）的体细胞胚诱导愈伤组织的发生是完全可能的；天山云杉体细胞胚性愈伤组织的诱导率与采集时间密切相关。

天山云杉体细胞胚（带胚乳的未成熟合子胚、不带胚乳的未成熟合子胚和成熟合子胚）愈伤组织的诱导结果如表2所示。

表2

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实验结果六个星期后处理*表示无污染数的百分率

3、六种激素浓度组合的诱导培养基对天山云杉成熟合子胚愈伤组织的诱导：

如图1所示，天山云杉成熟合子胚在DCR含有浓度为无激素、10μM 2,4-D和5μM BAP；20μM 2,4-D和5μM BAP、20μM 2,4-D和10μM BAP、40μM 2,4-D和10μM BAP、20μM 2,4-D 和10μM TDZ等培养基上均进行了培养。10μM 2,4-D和5μM BAP上诱导率最小为18%；在20μM 2,4-D和10μM TDZ；20μM 2,4-D和5μM BAP培养基上的诱导率分别为43%和53%。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。