N-(2-氯-6-甲基苯基)-2(2-甲基嘧啶-4-基)氨基噻唑-5-甲酰胺化合物及其制备方法和用途

摘要

本发明属药物合成领域，涉及通式(Ⅰ)的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2[(2-甲基嘧啶-4-基)氨基]噻唑-5-甲酰胺化合物，尤其涉及一种嘧啶6位四元杂环或螺环取代的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2[(2-甲基嘧啶-4-基)氨基]噻唑-5-甲酰胺化合物，及其制备方法和在医学上的应用。本发明的化合物通过体外ABL激酶抑制活性和抗肿瘤活性测试，结果显示，所述的化合物具有良好的ABL激酶抑制活性和抗肿瘤活性，可进一步制备新的抗肿瘤药物。

说明书

技术领域

本发明属药物合成领域，涉及新的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2[(2-甲基嘧啶-4-基)氨基]噻唑-5-甲酰胺化合物，制备方法和应用。具体涉及一种嘧啶6位四元杂环或螺环取代的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2[(2-甲基嘧啶-4-基)氨基]噻唑-5-甲酰胺化合物，及其制备方法和在医学上的应用。 

背景技术

现有技术公开了慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）是发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病，也是4种最常见的白血病之一，约占白血病病例的15％-20％，发病率为1.6/10万, 在各年龄段均可发病，以中老年病例为常见。据报道，在美国，CML患者每年新增约5000例，男女比例为1.4:1，生存超过20年的不到10％。 

研究显示，人体9号染色体上的癌基因c-ABL链接到22号染色体上的断点簇集区（breakpoint cluster region，BCR），形成p210 BCR-ABL融合基因和p185 BCR-ABL融合基因，BCR-ABL融合基因表达BCR-ABL 蛋白激酶，该激酶在细胞信号转导和转化中发挥重要作用，它通过磷酸化和活化一系列下游底物，引起细胞增殖、黏附和生存性质的改变，导致产生慢性粒细胞白血病和急性粒细胞白血病的发生。由于BCR-ABL 激酶在正常细胞中不表达，因此，本领域研究人员认为其是治疗CML 理想的药物靶标。 

20世纪90年代初，诺华公司（Novartis）通过对化合物库的高通量筛选得到嘧啶类先导化合物，在此基础上合成了一系列以2-苯氨基嘧啶为主体的小分子化合物，在1992年发现能够特异性的抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的活性化合物STI571，经过约十年的时间开发，伊马替尼（Imatinib，商品名Gleevec）于2001年5月10日被美国FDA批准用于CML的治疗，这是首个治疗CML的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂，具有划时代的意义，被美国《科学》杂志列入2001年度十大科技新闻。 

尽管伊马替尼的上市获得了巨大的成功，但是突变株的产生导致伊马替尼耐药性的发生，在伊马替尼上市后的几年中，有部分患者病情复发，甚至出现死亡。 

达沙替尼于2006年6月28日通过美国FDA审批，用于治疗CML和费城染色体阳性的急性淋巴细胞性白血病(ph+ALL)。达沙替尼源于一种Src-家族的淋巴细胞酪氨酸激酶（lymphocyte cell kinase，LCK）抑制剂，它在纳摩尔浓度下不仅可抑制BCR-ABL激酶，而且几乎可抑制所有的ABL突变体（T315I突变体除外）。 

尽管上述两种BCR-ABL激酶抑制剂显示有较好的疗效，但由于不断增长的抗药性，以及治疗人群个体之间的差异，迫使业内研究者需不断研究和发展新的安全有效的小分子化合物用以抑制ABL激酶。 

发明内容

本发明的目的是提供具有良好抗肿瘤活性的新的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2[(2-甲基嘧啶-4-基)氨基]噻唑-5-甲酰胺化合物，具体涉及一种嘧啶6位四元杂环或螺环取代的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2[(2-甲基嘧啶-4-基)氨基]噻唑-5-甲酰胺化合物。 

本发明的另一目的是提供上述新的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2[(2-甲基嘧啶-4-基)氨基]噻唑-5-甲酰胺化合物的制备方法，尤其涉及制备嘧啶6位四元杂环或螺环取代的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2[(2-甲基嘧啶-4-基)氨基]噻唑-5-甲酰胺化合物的方法。 

本发明的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2[(2-甲基嘧啶-4-基)氨基]噻唑-5-甲酰胺化合物具有下述通式(Ⅰ)的结构： 

其中

  R =         或                                

   n ＝1 或 2 

X = O或 S 或 SO 或SO₂ 或NCH₂CH₂OH

R₁ = OH或 OCH₃或 F或 NHBoc，

R₂ = H或 F，

本发明中，优选的化合物具有下述化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的结构：

      

1                                                                  2      

    

3                                            4

     

5                                                          6

   

7                                            8

    

9                                               10

本发明的嘧啶6位四元杂环或螺环取代的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2[(2-甲基嘧啶-4-基)氨基]噻唑-5-甲酰胺化合物的制备方法中，以N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[(6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基]噻唑-5-甲酰胺为原料，以N,N-二异丙基乙胺为碱，在1,4-二氧六环中与不同的胺进行亲核取代反应得到所述的化合物。

本发明中，以化合物1为例，其制备过程如下： 

本发明制得的化合物进行了ABL激酶抑制活性测试和体外抗肿瘤活性测试，结果显示，所述的化合物具有良好的ABL激酶抑制活性和抗肿瘤活性，可进一步研制开发为新型的抗肿瘤药物。

本发明对ABL激酶进行抑制活性测试，结果显示，所述的化合物显示出较好的ABL激酶抑制活性，所有化合物对ABL激酶抑制活性IC₅₀均小于0.6nM，其中化合物1和8对于ABL激酶抑制活性IC₅₀值小于0.2nM，与抗肿瘤药物达沙替尼类似。 

本发明的化合物可进一步制备ABL激酶抑制剂。 

本发明通过初步药效学研究，对K562白血病肿瘤细、PC3前列腺癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞进行体外抗肿瘤活性测试，结果显示，本发明的化合物对K562白血病肿瘤细、PC3前列腺癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞具有较强抗肿瘤活性，IC₅₀值均为nM级，其中，化合物1、7、8和10对K562白血病肿瘤细胞的体外抗肿瘤IC₅₀值均小于1nM，化合物2和10对PC3前列腺癌细胞的体外抗肿瘤IC₅₀值均小于100nM，化合物1对MDA-MB-231乳腺癌细胞的体外抗肿瘤IC₅₀值小于300nM，与抗肿瘤药物达沙替尼接近。 

本发明的化合物可进一步制备新的抗肿瘤药物。 

本发明中，所采用的药效学试验方法，是本领域技术与人员所熟知的方法。 

本发明中，所采用的ABL激酶和K562白血病肿瘤细、PC3前列腺癌细、MDA-MB-231乳腺癌细胞是本领域技术人员可通过市购的途径所获得的。 

鉴于BCR–ABL致癌基因是费城染色体的产物，费城染色体为慢性粒细胞白血病的临床诊断标志物,  约有95℅的慢性粒细胞白血病人和25%的急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL)成年人和5%的ALL儿童体内存在费城染色体，Bcr/abl致癌基因编码具酪氨酸激酶活性的蛋白(P210)，这种蛋白与细胞信号传导蛋白相互作用，扰乱细胞信息传递过程，使CML细胞增殖和分化失控。因此，本发明的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2[(2-甲基嘧啶-4-基)氨基]噻唑-5-甲酰胺化合物尤其可制备治疗酪氨酸激酶功能失调所致相关疾病的药物，所述的该BCR-ABL酪氨酸激酶功能失调所致相关疾病包括，慢性髓性白血病（CML）、胃癌、胃肠道基质瘤、急性淋巴细胞白血病、难治性或复发的Ph 染色体阳性的急性淋巴细胞性白血病、胃肠道基质细胞瘤以及初治的系统性肥大细胞增多症及其并发症。 

  

具体实施方式：

实施例1：合成化合物1，N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺

在室温搅拌下，将2-氧-6氮螺[3,3]庚烷草酸盐（0.92 g，0.8 mmol）加入2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)-N-(2-氯-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺（0.3 g，0.76 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（0.56 mL，1.6 mmol）的1,4-二氧六环（10 mL）溶液中，升温至回流，反应过夜，TLC监测原料消失。停止反应降至室温，除去溶剂，所得固体分别用甲醇、乙醚洗涤两次，柱色谱层析，得到白色固体（20 mg，产率6%）。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.47 (br s, 1H), 9.88 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.40 (dd, J = 7.5, 1.6 Hz, 1H), 7.35 – 7.20 (m, 2H), 5.69 (s, 1H), 4.72 (s, 4H), 4.15 (s, 4H), 2.39 (s, 3H), 2.23 (s,3H)。

  

实施例2：合成化合物2，N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-(2-硫杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺 

在室温搅拌下，将2-硫-6氮螺[3,3]庚烷草酸盐（128mg，0.4mmol）加入2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)-N-(2-氯-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺（158mg，0.4mmol）和N,N-二异丙基乙胺（0.56mL，1.6mmol）的1,4-二氧六环（5mL）溶液中，升温至回流，反应过夜，TLC监测原料消失。停止反应降至室温，除去溶剂，所得固体分别用甲醇、乙醚洗涤两次，柱色谱层析，得到白色固体（10mg，产率5%）。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.49 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.40 (dd, J = 7.2, 1.2 Hz, 1H), 7.34 – 7.19 (m, 2H), 5.69 (s, 1H), 4.04 (s, 4H), 3.40 (s, 4H), 2.40 (s, 3H), 2.24 (s, 3H)。

  

实施例3：合成化合物3，N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-(2-氧-2-硫杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺

在室温搅拌下，将2-氧杂-6-硫杂螺[3.3]庚烷-6-氧化物草酸盐（55，359 mg，1.02 mmol）加入2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)-N-(2-氯-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺（52，200 mg，0.51 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（0.356 mL，2.04 mmol）的1,4-二氧六环（5 mL）溶液中，升温至回流，反应过夜，TLC监测原料消失。停止反应降至室温，除去溶剂，所得固体分别用甲醇、乙醚洗涤两次，高效液相色谱分离制备，得到淡黄色固体（10 mg，产率4%）。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.50 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.40 (dd, J = 7.6, 1.6 Hz, 1H), 7.34 – 7.19 (m, 2H), 5.68 (s, 1H), 4.05 (s, 4H), 3.99 (dd, J = 9.2, 3.1 Hz, 2H), 3.61 – 3.42 (m, 2H), 2.39 (s, 3H), 2.24 (s, 3H)。

  

实施例4：合成化合物4， N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6 –(2,2-二氧代-2-硫杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)-2-甲基嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺

在室温搅拌下，将2-氧杂-6-硫杂螺[3.3]庚烷6,6-二氧化物草酸盐（56，300 mg，1.27 mmol）加入2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)-N-(2-氯-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺（52，300 mg，0.76 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（0.58 mL，3.3 mmol）的1,4-二氧六环（5 mL）溶液中，升温至回流，反应过夜，TLC监测原料消失。停止反应降至室温，除去溶剂，所得固体分别用甲醇、乙醚洗涤两次，高效液相色谱分离制备，得到淡黄色固体（10 mg，产率2.6%）。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.67 (br s, 1H), 9.97 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 7.40 (dd, J = 7.5, 1.6 Hz, 1H), 7.33 – 7.20 (m, 2H), 5.75 (s, 1H), 4.51 (s, 4H), 4.23 (s, 4H), 2.41 (s, 3H), 2.24 (s, 3H)。

  

实施例5：合成化合物5，N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)-2-甲基嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺

在室温搅拌下，将3-甲氧基氮杂环丁烷（57，70 mg，0.8 mmol）加入2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)-N-(2-氯-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺（52，158 mg，0.4 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（0.14 mL，0.8 mmol）的1,4-二氧六环（5 mL）溶液中，升温至回流，反应过夜，TLC监测原料消失。停止反应降至室温，除去溶剂，所得固体分别用甲醇、乙醚洗涤两次，高效液相色谱分离制备，得到淡黄色固体（10 mg，产率5.6%）。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.50 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.40 (dd, J = 7.2, 1.6 Hz, 1H), 7.34 – 7.20 (m, 2H), 5.71 (s, 1H), 4.38 – 4.23 (m, 1H), 4.28 – 4.09 (m, 2H), 3.92 – 3.69 (dd, J = 9.6, 4.0 Hz, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.24 (s, 3H), 1.34 – 1.26 (m, 3H)。

  

实施例6：合成化合物6，N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-)-2-甲基嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺

在室温搅拌下，将3,3-二氟氮杂环丁烷盐酸盐（58，104 mg，0.8 mmol）加入2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)-N-(2-氯-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺（52，158 mg，0.4 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（0.14 mL，0.8 mmol）的1,4-二氧六环（5 mL）溶液中，升温至回流，反应过夜，TLC监测原料消失。停止反应降至室温，除去溶剂，所得固体分别用甲醇、乙醚洗涤两次，高效液相色谱分离制备，得到淡黄色固体（10 mg，产率5.5%）。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.66 (s, 1H), 9.91 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.42 (dd, J = 7.2, 1.6 Hz, 1H), 7.34 – 7.20 (m, 2H), 5.86 (s, 1H), 4.45 (t, J = 12.4 Hz, 4H), 2.45 (s, 3H), 2.25 (s, 3H)。

  

实施例7：合成化合物7，叔丁基(1-(6-((5-((2-氯-6-甲基苯基)氨基甲酰基)噻唑-2-)氨基)-2-甲基嘧啶-4-)氮杂环丁烷-3-)氨基甲酸叔丁酯

在室温搅拌下，将氮杂环丁烷-3-基氨基甲酸叔丁酯（59，138 mg，0.8 mmol）加入2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)-N-(2-氯-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺（52，158 mg，0.4 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（0.14 mL，0.8 mmol）的1,4-二氧六环（5 mL）溶液中，升温至回流，反应过夜，TLC监测原料消失。停止反应降至室温，除去溶剂，所得固体分别用甲醇、乙醚洗涤两次，高效液相色谱分离制备，得到淡黄色固体（10 mg，产率4.7%）。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.47 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.59 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.42 (dd, J = 7.6, 1.6 Hz, 1H), 7.32 – 7.16 (m, 2H), 5.68 (s, 1H), 4.40 (br s, 1H), 4.20 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 3.88 – 3.67 (m, 2H), 2.40 (d, J =5.6 Hz, 3H), 2.24 (s, 3H), 1.40 (s, 9H)。

  

实施例8：合成化合物8，N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[6-(2-羟乙基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-]-2-甲基嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺

在室温搅拌下，将2-(2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-)乙醇（60，86 mg，0.6 mmol）加入2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)-N-(2-氯-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺（52，158 mg，0.4 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（0.14 mL，0.8 mmol）的1,4-二氧六环（5 mL）溶液中，升温至回流，反应过夜，TLC监测原料消失。停止反应降至室温，除去溶剂，所得固体分别用甲醇、乙醚洗涤两次，高效液相色谱分离制备，得到淡黄色固体（10 mg，产率5%）。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.48 (br s, 1H), 9.91 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.40 (dd, J = 7.6, 1.6 Hz, 1H), 7.33 – 7.18 (m, 2H), 5.69 (s, 1H), 4.07 (s, 4H), 3.64 (s, 6H), 3.17 (s, 1H), 2.69 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.39 (s, 3H), 2.24 (s, 3H)。

  

实施例9：合成化合物9，N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-(3-羟基氮杂环丁烷-1-)-2-甲基嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺

在室温搅拌下，将3-羟基氮杂环丁烷（61，58 mg，0.8 mmol）加入2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)-N-(2-氯-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺（52，158 mg，0.4 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（0.14 mL，0.8 mmol）的1,4-二氧六环（5 mL）溶液中，升温至回流，反应过夜，TLC监测原料消失。停止反应降至室温，除去溶剂，所得固体分别用甲醇、乙醚洗涤两次，高效液相色谱分离制备，得到淡黄色固体（10 mg，产率5.8%）。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.45 (br s, 1H), 9.87 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.52 – 7.35 (m, 1H), 7.35 – 7.14 (m, 2H), 5.75 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.68 (s, 1H), 4.59 (m, 1H), 4.19 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.70 (q, J = 4.4 Hz, 2H), 2.39 (s, 3H), 2.24 (s, 3H)。

  

实施例10：合成化合物10，N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.4]辛烷-6-)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺 

在室温搅拌下，将2-氧杂-6-氮杂螺[3.4]辛烷（62，50 mg，0.44 mmol）加入2-((6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)-N-(2-氯-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺（52，158 mg，0.4 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（0.14 mL，0.8 mmol）的1,4-二氧六环（5 mL）溶液中，升温至回流，反应过夜，TLC监测原料消失。停止反应降至室温，除去溶剂，所得固体分别用甲醇、乙醚洗涤两次，高效液相色谱分离制备，得到淡黄色固体（10 mg，产率5.3%）。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.45 (s, 1H), 9.87 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.40 (dd, J = 7.6, 1.6 Hz, 1H), 7.36 – 7.17 (m, 2H), 5.80 (s, 1H), 4.60 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.50 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.60 (br s, 2H), 3.42 (br s, 2H), 2.41(s, 3H), 2.25 (s, 5H)。

  

实施例11：体外激酶抑制活性测试

化合物对ABL激酶的体外抑制活性测试利用微流体芯片技术的迁移率检测技术（Mobility-Shift Assay）完成；ABL激酶购自Carna Biosciences公司。

微流体芯片技术的迁移率检测技术（Mobility-Shift Assay）将毛细管电泳的基本理念应用到微流体环境中，用于实验的底物是带有荧光标记的多肽，在反应体系中酶的作用下，底物转变为产物，其所带的电荷也发生了相应的变化，Mobility-Shift Assay正是利用底物和产物所带电荷的不同，将二者进行分离，并分别进行检测。 

在微流体芯片中对样品进行分离的力量来源于两个不同的方面，电动力学和液体压力。工作时， 384孔板中的反应体系在负压的作用下通过芯片底部的吸样针被吸入芯片内部的管路中；由于芯片中分离管路上被施加了电压，带有荧光标记的多肽底物和反应产物由于电荷的不同被分离，然后在检测窗口进行信号的激发和检测；在检测每一个样品时，都可以同时看到底物和产物的信号；产物的量通过计算Conversion值，即产物峰的高度比上底物峰和产物峰高度之和（Product peak height/（Substrate＋Product peak height）），来进行评估。 

本实施例中，分别测定了阳性药物达沙替尼和所制得的化合物在10000nM，3333nM，1111nM，370nM，123nM，41nM，14nM，4.6nM，1.5nM和0.51nM十个不同浓度下对ABL激酶的抑制活性；对ABL采用ATP Km 值为12μM；计算得到化合物对ABL激酶抑制活性IC₅₀值，具体结果如表1所示；实验结果表明，本发明的化合物显示出较好的ABL激酶抑制活性，所有化合物对ABL激酶抑制活性IC₅₀均小于0.6nM，其中化合物1和8对于ABL激酶抑制活性IC₅₀值小于0.2nM，与阳性对照抗肿瘤药物达沙替尼类似；所述的化合物可制备ABL激酶抑制剂，作为新的抗肿瘤药物。 

  

实施例12：体外抗肿瘤细胞活性测试

取处于指数增长期的肿瘤细胞种在96孔板里，培养24 h使细胞贴壁，去除上清，加200 μL /孔带药新鲜培养基：所制得的化合物先溶解在DMSO或者生理盐水里，测试时用完全培养基稀释成所需浓度，每个浓度设6个复孔，并设空白对照孔(只加培养基)和阴性对照，同样设6个复孔；继续培养至试验设计时间，终止培养，去除上清, 每孔加10% 三氯乙酸200μL，4℃条件固定l h，用二次蒸馏水冲洗5遍，自然晾干后每孔加入4 mg /mL SRB溶液，室温下染色15min，弃上清，用1%乙酸冲洗5遍以去除非特异性结合的染料，每孔加入100μL 10mM Tris溶液，在A490波长下测OD值，并按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率。

 对照组OD值-治疗组OD值 

 抑制率=     ×100%

                         对照组OD值                       

并以化合物浓度的对数和抑制率作回归方程，计算IC₅₀；结果表明，本发明的化合物均显示出较好的抗肿瘤的活性（如表1所示），对K562白血病肿瘤细、PC3前列腺癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞的体外抗肿瘤活性IC₅₀值均为nM级，其中化合物1、7、8和10对K562白血病肿瘤细胞的体外抗肿瘤IC₅₀值均小于1nM，化合物2和10对PC3前列腺癌细胞的体外抗肿瘤IC₅₀值均小于100nM，化合物1对MDA-MB-231乳腺癌细胞的体外抗肿瘤IC₅₀值小于300nM，与阳性对照抗肿瘤药物达沙替尼接近。本发明的化合物可进一步制备新型抗肿瘤药物。

  

表1是本发明的化合物对ABL激酶抑制活性和体外抗肿瘤细胞活性结果。

表1