巨大戟烷型二萜化合物及含有它的用于治疗或预防病毒感染疾病的药物组合物

摘要

本发明涉及从甘遂得到的巨大戟烷型二萜化合物，以及包含该巨大戟烷型二萜化合物的用于治疗或预防病毒感染疾病的药物组合物，预防或改善病毒感染疾病的健康功能食品和增强干扰素-γ产生的组合物。此外，本发明涉及治疗或预防病毒感染疾病的方法，包括对有病毒感染疾病发生或者有其风险的患者施与治疗有效剂量的该组合物。

说明书

技术领域

本发明涉及从甘遂(Euphorbia kansui Liou)得到的巨大戟烷型二萜(ingenane-typediterpene)化合物，以及包含该巨大戟烷型二萜化合物的用于治疗或预防病毒感染疾病的药物组合物，用于预防或改善病毒感染疾病的健康功能食品和用于增强干扰素-γ产生的组合物。此外，本发明涉及用于治疗或预防病毒感染疾病的方法，包括对有病毒感染疾病发生或者有其风险的患者施与治疗有效剂量的该组合物。

技术背景

免疫细胞中干扰素-γ(IFN-γ)的产生是抗病毒和细菌感染早期自身防御和肿瘤控制中的重要步骤(Biron，C.A.等，免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)1999，17，189-220)。IFN-γ在天然杀伤细胞(NK)和天然杀伤细胞T(NKT)中产生,其一般在调节免疫反应中用作效应细胞(Schoenborn，J.R.等，高级免疫学(Adv.Immunol.)2007，96，41-101)。IFN-γ表达特别与促炎状态(pro-inflammatory state)相关。细胞因子IFN-γ在防御系统中的作用是公知的，并且该作用与病毒复制和免疫刺激的直接抑制相关(Gessani，S.等，细胞因子和生长因子综述(Cytokine & Growth F.R.)1998，9，117-123；Goodbourn，S.等，病毒学杂志(J.Gen.Virol.)2000，81，2341-2364)。

由于收入、老龄人群的增长，慢性病相关药增长的需求，寿命期增长等等，药物市场全球性增长，结果，国内外制药工业对生物药物的研究和开发增长。在其它方面，对抗病毒治疗剂相关的研究有增长的需求，其是开发艾滋病治疗剂,肝病和流行性感冒疾病治疗剂的基础，其是为了全人类，为了利用研究成果而开发治疗剂，为了开发制药技术和提高生活质量技术而需要解决的问题，需求增长。

病毒是一种小的感染剂(平均0.1μm或更小)，其比细菌更小，因此即使用细菌滤器(0.22μm)也不能过滤，是一种只有核酸(DNA或RNA)和少量作为存活所必需物质的蛋白质的生物体，因此是依赖于宿主的。作为病毒引起疾病的治疗剂，减弱或杀死感染到体内的病毒作用的药物被称作抗病毒治疗剂。

使用疫苗的免疫治疗目前是病毒感染疾病治疗主流。具体地，用于衣原体(巨大病毒)引起感染性疾病例如颗粒性结膜炎和第四性病(性病)的治疗剂的例子包括四环素和氯霉素，用于A-型流感病毒的预防剂的例子包括三环癸胺，疱疹净(IDU)眼浴滴液被开发为用于角膜炎疱疹的保护剂，阿糖腺苷/阿昔洛韦作为单纯疱疹脑炎(脑炎)或免疫抑制剂受到了关注。特别地，干扰素是用于病毒感染疾病的最有前途的药物，目前正在检验其应用性。

近来，在治疗或预防健康领域对于天然物质的优先选择全球性增长。这种趋势影响着制药公司，使得他们制备从植物中提取的新抗微生物剂。因此，全球持续进行从上千种植物类型开发新的抗病毒物质的研究，已经鉴定出具有抗病毒活性的各种各样的植物化学物质，例如类黄酮，萜类化合物，木酚素，硫化物，多酚，香豆素，皂角苷，生物碱，聚炔烃，噻吩，蛋白质和肽。一般使用的可食用草药，香料和香草茶的几种挥发性香精油也具有抗病毒活性。但是，除了上述几种新的化合物组之外，对于具有抗病毒活性的药用植物活性物质的大多数研究处于其初始阶段。

甘遂(大戟科(Euphorbiaceae))广泛分布于中国和韩国大陆。甘遂的干燥的根，也称作“kansui”，被用作浮肿和腹水(Wang，L.Y.等，天然产物杂志(J.Nat.Prod.)2003，66，630-633)，和癌症(Wang，L.Y.等，天然产物杂志(J.Nat.Prod.)2002，65，1246-1251)的草药疗法。通过对甘遂的前期研究，已经从甘遂的提取物中鉴定了下面物质的存在：大量大戟烷型(euphan-type)三萜(Chang，J.S.等，药用植物(Planta Med.)2010，76，1544-1549)，巨大戟烷型二萜(Pan，Q.等，天然产物杂志(J.Nat.Prod.)2004，67，1548-1551)和麻风树碱烷型(jatrophane-type)二萜(Zheng，W.F.等，药用植物(Planta Med.)1998，64，754-756)。另外，样品已经被证明具有抗癌作用(Pan，Q.等，天然产物杂志(J.Nat.Prod.)2004，67，1548-1551)，抑制细胞生长作用(Chang，J.S.等，药用植物(Planta Med.)2010，76，1544-1549)和抗变应性作用(Ott，H.H.等，经验(Experientia.)1981，37，88-91)。

发明内容

【技术问题】

如上所述，本发明人做了大量努力来鉴定具有抗病毒活性的来自天然产物的材料，作为结果，从甘遂分离到了巨大戟烷型二萜化合物，然后证实该化合物增强NK92细胞中干扰素-γ(IFN-γ)的产生，完成本发明。

【技术方案】

本发明的第一个目的是提供化学式1表示的化合物或者其药学可接受的盐。

本发明的第二个目的是提供一种治疗或预防病毒感染疾病的药物组合物，其包含化学式2表示的化合物或者其药学可接受的盐作为活性成分。

本发明的第三个目的是提供一种预防或减轻病毒感染疾病的健康功能食品，其包含化学式2表示的化合物或者其生理可接受的盐作为活性成分。

本发明的第四个目的是提供一种增强干扰素-γ产生的组合物，其包含化学式2表示的化合物或者其药学可接受的盐作为活性成分。

本发明的第五个目的是提供一种治疗或预防病毒感染疾病的方法，包括对有病毒感染疾病发生或者有其风险的患者施与治疗有效剂量的权利要求2－4任一项的组合物。

【有益效果】

本发明提供一种从甘遂的根部区分离的巨大戟烷型新二萜化合物，和从甘遂得到的巨大戟烷型新的二萜为基础的化合物，包括具有诱导NK细胞中IFN-γ产生活性的新化合物，因此在治疗或预防病毒感染疾病中是有效的。

附图说明

图1显示化合物1的IR光谱。

图2显示化合物1的高分辨率FABMS的结果。

图3和图4显示化合物1的正HRFABMS的结果。

图5显示化合物1的¹H-NMR光谱数据。

图6显示化合物1的¹³C-NMR光谱数据。

图7显示化合物1的HMQC光谱数据。

图8显示化合物1的HMBC(H→C)相关性和COSY(H-H)相关性。

图9显示化合物1的绝对构型。这里，2个MPTA酯1a和1b的Δδ值(δ_S-δ_R)以赫兹单位表示。

图10显示化合物1的NOESY()相关性。

图11是显示化合物1－6和8对人天然杀伤细胞(NK92)中IFN-γ产生的作用的图。这里，佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)被用作阳性对照组。每个数值是通过进行三次培养获得的平均值±标准偏差值。

具体实施方式

如上所述，本发明提供下面化学式1表示的化合物或者其药学可接受盐。

[化学式1]

在本发明中，通过化合物1代表化学式1表示的化合物，其名称是5-O-(2,3-二甲基丁酰基)-13-O-十二烷酰基-20-O-脱氧巨大戟二萜醇。

化合物1是一种巨大戟烷型二萜化合物，是本发明人从甘遂根部分离的新物质。化合物1具有促进或增强细胞中干扰素-γ产生的活性。

另外，本发明提供用于治疗或预防病毒感染疾病的药物组合物，其包含下面化学式2所表示的化合物或者其药学可接受盐作为活性成分。

[化学式2]

在结构式中,

R₁是H，R₂是H，R₃是OCO-(CH₂)₁₀-CH₃和R₄是CO-CH(CH₃)-CH(CH₃)₂,

R₁是CO-CH(CH₃)-CH(CH₃)₂，R₂是H，R₃是OCO-(CH₂)₁₀-CH₃和R₄是H，

R₁是H，R₂是OCO-(CH₂)₈-CH₃，R₃是H和R₄是H，

R₁是CO(CH＝CH)-(CH₂)₄-CH₃，R₂是OAc，R₃是H和R₄是H，

R₁是CO-CH(CH₃)-CH(CH₃)₂，R₂是OCO-(CH₂)₁₄-CH₃，R₃是OCO-(CH₂)₁₀-CH₃和R₄是H，或者

R₁是CO-CH(CH₃)-CH(CH₃)₂，R₂是OH，R₃是OCO-(CH₂)₁₀-CH₃和R₄是H。

在本发明中，化学式2表示的巨大戟烷型二萜化合物可以从甘遂分离,优选从甘遂的根部分。

除了从甘遂分离的化学式2表示的化合物外，本发明的药物组合物可以包含化学式2表示的化学合成的化合物或者其药学可接受盐。

本发明不仅包括化学式2表示的化合物和其药学可接受盐，还包括能从中制备的所有溶剂化物，水合物或外消旋物。

术语“预防”在本发明中意思是通过施用组合物而抑制病毒感染疾病或者延迟疾病发作的所有作用。

术语“治疗”在本发明中意思是通过施用组合物而能使病毒感染症状改善或者变得更好的所有作用。

在本发明中，病毒感染疾病可以是由选自下面组成的组中的一种或几种病毒引起的疾病：流感病毒，A型流感病毒亚型H1N1，禽流感病毒，鼻病毒，腺病毒，冠状病毒，副流感病毒，呼吸道合胞病毒，疱疹病毒(HSV)，人免疫缺陷病毒(HIV)，轮状病毒和肝炎病毒，但是病毒并不局限于这些。

另外，病毒感染疾病可以是选自下面组成的组中的一种或几种病毒感染疾病：轮状病毒感染疾病，腺病毒感染疾病，流感，感冒，喉咙痛，支气管炎，肺炎，禽流感，眼睛发炎，脑炎，获得性免疫缺陷综合征，肝炎和严重急性呼吸综合征(SARS)，但是病毒感染疾病并不局限于这些。

本发明的化学式2表示的化合物可以有药学可接受盐的形式,作为盐,通过药学可接受游离酸形成的酸加成盐是有用的。从无机酸，例如盐酸，硝酸，磷酸，硫酸，氢溴酸，氢碘酸，亚硝酸或亚磷酸，和无毒有机酸,例如一元脂肪酸和二元脂肪酸，苯基-取代的链烷酸，羟基链烷酸和链烷双酸，芳香酸，脂肪族和芳香族磺酸获得酸加成盐。这样的药学无毒盐包括硫酸盐，焦硫酸盐，硫酸氢盐，亚硫酸盐，亚硫酸氢盐，硝酸盐，磷酸盐，磷酸一氢盐，磷酸二氢盐，偏磷酸盐，焦磷酸盐，氯化物，溴化物，碘化物，氟化物，乙酸盐，丙酸盐，癸酸盐，辛酸盐，丙烯酸盐，甲酸盐，异丁酸盐，己酸盐，庚酸盐，丙炔酸盐，草酸盐，丙二酸盐，琥珀酸盐，辛二酸盐，癸二酸盐，富马酸盐，马来酸盐，丁烯-1,4-二酸盐，己烷-1,6-二酸盐，苯甲酸盐，氯苯甲酸盐，甲基苯甲酸盐，二硝基苯甲酸盐，羟基苯甲酸盐，甲氧基苯甲酸盐，邻苯二甲酸盐，对苯二甲酸盐，苯磺酸盐，甲苯磺酸盐，氯苯磺酸盐，二甲苯磺酸盐，苯基乙酸盐，苯基丙酸盐，苯基丁酸盐，柠檬酸盐，乳酸盐，β-羟基丁酸盐，羟乙酸盐，苹果酸盐，酒石酸盐，甲磺酸盐，丙磺酸盐，萘-1-磺酸盐，萘-2-磺酸盐或扁桃酸盐。

通过普通方法可以制备根据本发明的酸加成盐，例如将化学式2的化合物溶解于过量的酸水溶液中，并且使用水混溶性有机溶剂例如甲醇，乙醇，丙酮或乙腈沉淀这种盐。

另外，使用碱可以制备药学可接受金属盐。通过，例如，将化合物溶解于过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中，过滤不溶解的化合物盐，干燥滤液并干燥得到的产物，获得碱金属盐或碱土金属盐。这里，制备钠盐，钾盐或钙盐作为金属盐是药学上合适的。此外，通过使碱金属或碱土金属盐与合适的银盐(例如硝酸银)反应，获得相应于这种的银盐。

本发明的组合物可以包含药学可接受载体。包含药学可接受载体的组合物可以具有各种各样的口服或非口服剂型。配制时，使用通常所使用的填料，填充剂，粘合剂，湿润剂，崩解剂，稀释液，例如表面活性剂或稀释剂制备组合物。口服给药的固体剂型包括片剂，药丸，粉末剂，颗粒剂，胶囊等，通过将一种或几种化合物与至少一种或几种稀释剂，例如淀粉，碳酸钾，蔗糖或乳糖和明胶混合来制备这些固体剂型。另外，除了简单的稀释剂外还使用润滑剂，例如硬脂酸镁和滑石。用于口服给药的液体剂型包括悬浮液，口服溶液，乳状液，糖浆等，除了通常使用的稀释液例如水和液体石蜡外，其中可以包含各种稀释剂，例如湿润剂，甜味剂，调味剂和防腐剂。非口服给药的剂型包括灭菌水溶液，非水溶剂，悬浮液，乳状液，冻干制剂和栓剂。非水溶剂和悬浮液可以包含丙二醇，聚乙二醇，植物油，例如橄榄油和可注射酯，例如油酸乙酯。作为栓剂的基质，可以使用Witepsol，聚乙二醇，Tween61，可可脂，月桂精油，甘油胶冻等。

同时，本发明提供预防或治疗病毒感染疾病的方法，包括对有病毒感染疾病发生或者有其风险的患者施与治疗有效剂量的本发明组合物。

术语“患者”在本发明中意思是已经被感染或者有被病毒感染可能性的所有动物包括人类，通过对患者施用本发明的组合物,疾病能被有效地防止和治疗。

本发明的组合物可以与用于病毒感染疾病的存在的治疗药物联合给药。组合物可以通过任何常规途径给药，只要组合物到达靶组织。根据目的，通过腹膜内给药，静脉内给药，肌肉给药，皮下给药，皮内给药，口服给药，鼻内给药，肺部给药或者直肠给药可以施用本发明的组合物，但是给药方法不局限于此。另外，通过能将活性材料运动至靶细胞的任何器械可以施用组合物。

以治疗有效剂量施用本发明的组合物。术语“治疗有效剂量”意思是足以以可用于医学治疗的合理利益/风险之比治疗疾病的量，根据包括患者类型，严重程度，年龄，性别，感染病毒类型，药物活性，对药物的敏感性，给药时间，给药途径和排泄率，治疗周期和同时使用的药物，以及药学领域公知的其它因素，可以确定有效剂量的水平。本发明的组合物可以作为单独的治疗剂或者作为与其它治疗剂联合给药，本发明的组合物可以与已经存在的治疗剂连续施用或者同时施用。另外，本发明的组合物可以一次或多次给药施用。考虑上述所有因素，以没有副作用的最小量能获得最大效果的量给药是重要的，本领域熟练技术人员可以容易确定这个量。

发明的组合物可以单独使用或者与例如手术，激素治疗，药物治疗和使用生物应答修饰剂这样的方法联合用于预防和治疗病毒感染。

在本发明的实施例中，从甘遂分离并鉴定了下面化学式2表示的化合物，下面化学式3表示的化合物，下面化学式4表示的化合物和下面化学式5表示的化合物。

[化学式2]

[化学式3]

[化学式4]

[化学式5]

在结构式中,

R₁是H，R₂是H，R₃是OCO-(CH₂)₁₀-CH₃和R₄是CO-CH(CH₃)-CH(CH₃)₂，

R₁是CO-CH(CH₃)-CH(CH₃)₂，R₂是H，R₃是OCO-(CH₂)₁₀-CH₃和R₄是H，

R₁是H，R₂是OCO-(CH₂)₈-CH₃，R₃是H和R₄是H，

R₁是CO(CH＝CH)-(CH₂)₄-CH₃，R₂是OAc，R₃是H和R₄是H，

R₁是CO-CH(CH₃)-CH(CH₃)₂，R₂是OCO-(CH₂)₁₄-CH₃，R₃是OCO-(CH₂)₁₀-CH₃和R₄是H，或者

R₁是CO-CH(CH₃)-CH(CH₃)₂，R₂是OH，R₃是OCO-(CH₂)₁₀-CH₃和R₄是H。

在本发明中，化合物1代表其中R₁是H，R₂是H，R₃是OCO-(CH₂)₁₀-CH₃和R₄是CO-CH(CH₃)-CH(CH₃)₂的化学式2表示的化合物，化合物2代表其中R₁是CO-CH(CH₃)-CH(CH₃)₂，R₂是H，R₃是OCO-(CH₂)₁₀-CH₃和R₄是H的化学式2表示的化合物，化合物3代表其中R₁是H，R₂是OCO-(CH₂)₈-CH₃，R₃是H和R₄是H的化学式2表示的化合物，化合物4代表其中R₁是CO(CH＝CH)-(CH₂)₄-CH₃，R₂是OAc，R₃是H和R₄是H的化学式2表示的化合物，化合物5代表其中R₁是CO-CH(CH₃)-CH(CH₃)₂，R₂是OCO-(CH₂)₁₄-CH₃，R₃是OCO-(CH₂)₁₀-CH₃和R₄是H的化学式2表示的化合物，化合物6代表其中R₁是CO-CH(CH₃)-CH(CH₃)₂，R₂是OH，R₃是OCO-(CH₂)₁₀-CH₃和R₄是H的化学式2表示的化合物，化合物7代表化学式3表示的化合物，化合物8代表化学式4表示的化合物，化合物9代表化学式5表示的化合物。

化合物1的名称是5-O-(2,3-二甲基丁酰基)-13-O-十二烷酰基-20-O-脱氧巨大戟二萜醇，化合物2的名称是3-O-(2,3-二甲基丁酰基)-13-O-十二烷酰基-20-O-脱氧巨大戟二萜醇，化合物3的名称是20-O-十二烷酰基巨大戟二萜醇，化合物4的名称是20-O-乙酰基巨大戟二萜醇-3-O-(2'E,4'Z)癸二烯酸酯，化合物5的名称是gansuiphorin A，化合物6的名称是3-O-(2,3-二甲基丁酰基)-13-O-十二烷酰基巨大戟二萜醇，化合物7的名称是甘遂宁F(gansuinine F)，化合物8的名称是(20R,23E)-大戟-8,23-二烯-3b,25-二醇，及化合物9的名称是大戟二烯醇。

在本发明的实施例中，利用ELISA分析研究了化合物(1至9)对NK92细胞中IFN-γ表达的作用，证实化合物1至6和8诱导NK92细胞中IFN-γ的产生(图10)。这些结果显示本发明中鉴定的化合物1至6通过促进或增强细胞中IFN-γ的产生可以被用作有用的抗病毒剂。

此外，本发明提供用于预防或改善病毒感染疾病的健康功能食品，其包含化学式2表示的化合物或者其生理可接受盐作为活性成分。换句话说，为了预防或改善病毒感染疾病的目的可以向食品添加化学式2表示的化合物或者其生理可接受盐。

在本发明中，“预防”意思是通过健康功能食品的摄入而抑制病毒感染疾病或者延迟疾病发生的所有作用，而“治疗”意思是通过健康功能食品的摄入而使得病毒感染症状改善或变得更好的所有作用。

本发明的健康功能食品包括所有形式，例如功能健康食品，营养补充品，营养品，药用食品，健康食品，营养制品，设计食品，食品添加剂和饲料添加剂。

当加入化学式2的化合物或者其生理可接受盐作为健康功能食品的添加剂时，化合物或者其生理可接受盐可以单独加入或者与其它食品或食品成份一起加入，并且可以根据常规方法适当地使用。根据使用的目的(用于预防或改善)可以适当地确定混合的活性成分的量。

食品的类型没有特别限制，其例子包括肉，香肠，面包，巧克力，糖果，小吃，饼干，批萨，味千拉面，其它面条，口香糖，奶制品，包括冰激凌，各种汤，饮料，茶，健康饮品，酒精饮料和维生素复合物等，包括可接受意义的所有健康功能食品。

除了上述外，本发明的健康功能食品可以包含各种营养品，维生素，电解质，矫味剂，着色剂，果胶酸及其盐，褐藻酸及其盐，有机酸，保护性表观粘度剂，pH调节剂，稳定剂，防腐剂，甘油，醇，在碳酸饮料中使用的碳酸化剂等等。

此外，除了这些，本发明的健康功能食品可以含有用于制备天然果汁，果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。

病毒感染疾病和上述的一样。

另外，本发明提供用于增强干扰素-γ产生的组合物，其包含化学式2表示的化合物或者其药学可接受盐作为活性成分。

用于增强干扰素-γ产生的组合物可以进一步包含药学可接受载体，药学可接受载体和上述的一样。

在本发明的实施例中，当对NK92细胞施用化学式2表示的化合物时，证实NK92细胞中IFN-γ表达增强(图10)。因此，化学式2表示的化合物或者其药学可接受盐增强细胞中IFN-γ产生，优选NK细胞，因此最终在预防或治疗感染性疾病中是有用的。

下面，参照实施例更详细地描述本发明的构成和效果，然而，这些实施例只是详细描述的目的，不将本发明的范围限制于此。

实施例1:材料和方法

一般实验程序

在微量取样Kofler器(Kofler micro-hostage)上测量熔点。使用Jasco P-1020偏光计测定旋光性。在UV-VIS分光计2400上获得UV数据，使用Jasco FT/IR-4200获得FT-IR光谱。在Varian UNITY400和Brucker DMX-800MHz FT-NMR分光计上使用四甲基硅烷作为内标物质记录NMR谱。分别在Waters Q-Tof Premier分光计和JEOL JMS-HX110分光计上进行HRESIMS和HRFABMS。在Gilson泵305上使用UV/VIS-155探测器进行HPLC分离。

植物材料

甘遂的根是来自中国的进口产品，购自七星公司(Chilsung公司)，韩国草药销售公司。其标准(PB-3755)保存在韩国生物科学和生物技术研究所植物提取物银行(Plant ExtractBank of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)。

细胞培养

从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得NK92细胞(人NK淋巴瘤)。NK92细胞保持在含有20％胎牛血清(Invitrogen)，2mM L-谷氨酸，100mg/mL青霉素和100mg/mL链霉素(Invitrogen)的α-MEM(美国杰英生命技术有限公司(Invitrogen)，美国)中，用100U/mL IL-2(派普泰克公司(Peprotech)，美国)补充。在培养基中在37℃在5％CO₂湿度环境下进行NK92细胞培养。使用分析盒(Endogen，沃本(Woburn)，美国)根据供应商的方案，分析人IFN-γ的量。

实施例2:提取和分离

将实施例1的MeOH提取物(1kg)悬浮于H₂O中，然后连续用CHCl₃，EtOAc，和n-BuOH分配，得到230.0g的CHCl₃-可溶性提取物，4.5g的EtOAc-可溶性提取物和41.0g的n-BuOH-可溶性提取物。CHCl₃-可溶性级分被证实在IFN-γ生产中有最高的活性。CHCl₃-可溶性级分(100g)用硅胶柱色谱分离，使用正己烷:EtOAC(50:1至1:1v/v)逐步浓度梯度混合物，然后再次进行硅胶柱色谱，使用CHCl₃:MeOH(5:1至1:1v/v)逐步浓度梯度混合物，得到22个级分(KC16-1至KC16-22)。接着，将级分KC16-7中的物质结晶，得到化合物9(10g)。在RP C-18(3.5x40cm，40C₁₈-PREP)柱上将级分KC16-12(5.7g)色谱分离，使用中等压力液体色谱(MPLC)系统，用MeOH:H₂O(4:1至4.5:1，然后100％MeOH)洗脱，得到20个级分(KC16-12-1至KC16-12-20)。使用Sephadex LH-20色谱柱(2.5x170cm)，用90％MeOH的H₂O溶液将级分KC16-12-18(485mg)分级分离，得到3个级分(KC16-12-18-1至KC16-12-18-3)。通过制备HPLC(YMC J'sphere ODS-H80，250x20mm，4μm，100％MeOH，10mL/min)使用反相柱纯化级分KC16-12-18-2(198mg)，得到化合物1(10.0mg，t_R13.2min)和2(60.0mg，t_R17.1min)。级分KC16-12-20(777mg)在硅胶MPLC柱上色谱分离，用正己烷:EtOAC(5:1至1:1v/v)洗脱，得到8个级分(KC16-12-20-1至KC16-12-20-8)。级分KC16-12-20-1(366mg)通过Sephadex LH-20柱色谱法(2.5x170cm)分级分离，用90％MeOH的H₂O溶液洗脱，得到4个级分(KC16-12-20-1-1至KC16-12-20-1-4)。级分KC16-12-20-1-2(100mg)通过制备HPLC(YMC J'sphere ODS-H80，250x20mm，4mm，100％MeOH，10mL/min)纯化，使用反相柱，得到化合物7(4mg，t_R62.1min)。活性级分KC16-14(2.8g)在RP C-18柱(3.5x40cm，40C₁₈-PREP)上通过MPLC色谱分离，用MeOH:H₂O(1:1至4.5:1，然后100％MeOH)洗脱，得到18个级分(KC16-14-1至KC16-14-18)。级分KC16-14-10(153mg)在硅胶上通过MPLC柱色谱法(3:1v/v，3.5x40cm)色谱分离，用正己烷:EtOAC洗脱，得到4个级分(KC16-14-10-1至KC16-14-10-4)。级分KC16-14-10-1(36mg)通过制备HPLC(YMC J'sphere ODS-H80，250x20mm，4mm，88％MeOH的H₂O溶液，10mL/min)纯化，使用反相柱，得到化合物4(9mg，t_R23.5min)和5(4mg，t_R32.6min)。

使用Sephadex LH-20柱色谱法(2.5x170cm)将级分KC16-14-12(295mg)分级分离，用80％MeOH的H₂O溶液洗脱，得到5个级分(KC16-14-12-1至KC16-14-12-5)。级分KC16-14-12-2(150mg)通过制备HPLC(YMC J'sphere ODS-H80，250x20mm，4mm，83％MeOH的H₂O溶液，10mL/min)纯化，使用反相柱，得到化合物3(40mg，t_R31.3min)。

使用Sephadex LH-20柱色谱法(2.5x170cm)将级分KC16-14-15(144mg)分级分离，用80％MeOH的H₂O水溶液洗脱，得到6个级分(KC16-14-15-1至KC16-14-15-6)。通过制备HPLC(YMC250x20mm，4mm，70％MeCN的H₂O溶液，10mL/min)，使用反相柱，将级分KC16-14-15-6(55mg)纯化，得到化合物8(25mg，t_R15.4min)。

通过MPLC柱色谱法，在硅胶柱上，将级分KC16-21(1.2g)色谱分离，用正己烷:EtOAC(5:1至1:1v/v，3.5x40cm)洗脱，得到18个级分(KC16-21-1至KC16-21-18)。使用SephadexLH-20柱色谱法(2.5x170cm)将级分KC16-21-8(242mg)分级分离，用正己烷-二甲基氯-MeOH(10:10:1v/v，2.5x170cm)洗脱，得到6个级分(KC16-21-8-1至KC16-21-8-6)。使用Sephadex LH-20柱色谱法(2.5x170cm)将细分级分KC16-21-8-3(130mg)分级分离，使用90％MeOH的H₂O溶液洗脱，得到8个级分(KC16-21-8-3-1至KC16-21-8-3-8)。通过制备HPLC(YMC J'sphere ODS-H80，250x20mm，4mm，100％MeOH，10mL/min)，使用反相柱，将级分KC16-21-8-3-8(40mg)纯化，得到化合物6(4.5mg，t_R12.6min)。

实施例3:化合物1的R-和S-MTPA酯衍生物的制备

将化合物1(2.0mg)溶解于2mL无水CH₂Cl₂中。向上述溶液加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-(三氟甲基)苯乙酰氯(3mL)和N,N-二甲基-4-氨基吡啶。将混合物在室温下搅拌24小时。反应完全后，对残余物进行硅胶柱色谱[1x7cm，正己烷:EtOAc(15:1)]，得到R-MTPA衍生物。

应用相同程序制备S-MTPA衍生物，除了用其它的立体异构体代替。

实施例4:化合物鉴定

获得无色胶状化合物1。其IR光谱显示由于存在羟基官能团(3446cm^-1)和羰基官能团(1732cm^-1)的吸收带(图1)。化合物1的高分辨FABMS在m/z651.4271的[M+Na]⁺峰，相应于C₃₈H₆₀O₇的分子式(图2)。另外，化合物1的HRFABMS(正的)显示在m/z513[M+H-116]⁺和429[M+H-200]⁺的2个特征离子片段峰，分别表明2,3-二甲基丁酸根单元和十二烷酸根单元从母核分子脱离(图3和图4)。化合物1的¹H-NMR光谱数据(图5)显示属于2,3-二甲基丁酸根基团的质子信号δ_H2.38(1H，m)，2.0(1H，m)，1.14(3H，d，J＝7.2Hz)，0.98(3H，d，J＝4.8Hz)，和0.94(3H，d，J＝6.5Hz)ppm。十二烷酸根光谱在δ_H2.19(2H，t，J＝7.6Hz)，1.57(2H，m)，1.25[重叠信号，16H]，和0.88(3H，t，J＝6.8Hz)显示信号。与5个甲基基团在δ_H1.83，1.64，1.24，1.07，和0.99形成的，与1个亚甲基基团在δ_H2.76和2.15形成的，与7个次甲基在δ_H5.88，5.85，4.18，2.52和1.25(包括2个烯烃)，和与2个氧化次甲基在δ_H5.24和3.81形成的其它质子信号被分析是巨大戟二萜醇型结构部分。另外¹³C-NMR(图6)和HMQC(图7)分光光谱数据解析也支持这个分析。根据收集的数据，显示化合物1与3-O-(2,3-二甲基丁酰基)-13-O-十二烷酰基-20-O-脱氧巨大戟二萜醇(2)具有部分相似性。证实两个化合物之间的主要差异是2,3-二甲基丁酸部分的位置。根据H-5(δ_H5.24)和C-1'(δ_C176.1)之间的HMBC相关性证明化合物1的2,3-二甲基丁酰基基团存在于C-5(图8)。

另外，为了确定化合物1的结构中C-3的绝对构型，根据实施例3制备Mosher衍生物(1R和1S)。如图9所示，观察差异(Δδ_S-R)，H-1和H-19的正值和H-5，H-7，和H-20的负值清晰证明C-3的绝对构型是S。作为结论，化合物1的结构被证实是(3S)-5-O-(2,3-二甲基丁酰基)-13-O-十二烷酰基-20-O-脱氧巨大戟二萜醇。

为了鉴定化合物1的绝对立体化学，应用NOESY进行另外的实验。NOE光谱显示H-5，H-20，H-8，H-17，和H-11之间的相关性，这表明H-5是β-取向的。因此，鉴定5-O-(2,3-二甲基丁酰基)-13-O-十二烷酰基-20-O-脱氧巨大戟二萜醇(1)是(3S，5R，16R，17S，18R，19S，20R)(图10)。

从相同氯仿提取物中分离的另外8种化合物根据与相应化合物的开放分光光谱数据相比较，各自鉴定为3-O-(2,3-二甲基丁酰基)-13-O-十二烷酰基-20-O-脱氧巨大戟二萜醇(2)，20-O-癸酰基巨大戟二萜醇(3)，20-O-乙酰基巨大戟二萜醇-3-O-(2'E,4'Z)癸二烯酸酯(4)，gansuiphorin A(5)，3-O-(2,3-二甲基丁酰基)-13-O-十二烷酰基巨大戟二萜醇(6)，甘遂宁F(7)，(20R,23E)-大戟-8,23-二烯-3b,25-二醇(8)，和大戟二烯醇(9)。

化合物1的物理化学特性和分光光谱数据显示如下:无色胶状物(CHCl₃)；[α]²⁶_D-30°(c0.1，CHCl₃)；UV(EtOH)λ_max nm(logε)210(3.91)，282(3.08)；IR(thin film)cm^-1:3346，1732。FABMS m/z651[M+Na]⁺，629[M+H]⁺，513[M+H-116]⁺，429[M+H-200]⁺，HRFABMS m/z651.4271[M+Na](对于C₃₈H₆₀O₇Na计算，651.4237)。

此外，¹H-NMR(CDCl₃)和¹³C-NMR(CDCl₃)数据如下面表1所示。

[表1]

实施例5:对本发明化合物IFN-γ生产能力和细胞毒性的研究

为了检测IFN-γ，在48-孔培养板中接种2x10⁵NK92细胞/mL，并且在含有20％FBS和IL-2的α-MEM培养基中用各分离的化合物培养12小时。应用ELISA方法分析培养上清液中释放的IFN-γ。在微量培养板读数器上测量吸光率，并且将对所有化合物的处理和分析重复两次。通过MTT分析评价化合物处理过的NK92细胞的细胞毒性。

结果见图11。

如图11所示，显示只有化合物1至6和8诱导NK92细胞中IFN-γ的产生。另外，各化合物对于IFN-γ产生的有效剂量非常不同。化合物4和6(10nM)显示对IFN-γ产生有显著作用，与相同剂量的佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)相比类似。化合物3(100nM)，1(每份1.25μM)，5和8(每份5μM)当对NK92细胞处理时对于诱导IFN-γ产生也具有活性。根据这些结果，证实本发明中从甘遂的根分离的巨大戟烷型二萜化合物作为IFN-γ诱导剂是有用的。