一种皮肤模型低温保存的固体培养基及其保存方法

摘要

本发明公开了一种可用于组织工程皮肤模型的低温保存用固体培养基及保存方法。通过给表皮细胞常用培养基中添加低温保护剂，制成基础培养液，然后将该基础培养液与琼脂糖凝胶混合凝固后形成可适于皮肤模型的固体培养基；组织工程皮肤模型嵌入该培养基中，在4℃～8℃保存24h～72h后，用普通的表皮细胞培养液复苏，该固体培养基，可以最大限度的减少细胞及皮肤组织在低温保存条件下产生的组织活力下降及结构损伤。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种皮肤模型低温保存运输的固体培养基及其保存方法。

背景技术

随着体外替代科学的飞速发展，皮肤模型作为皮肤安全性测试的替代品，已被广泛的用于药品、化妆品等方面的测试。欧洲替代法委员会(ECVAM)已通过EpiDerm、EpiSkin两种皮肤模型产品的验证和相应的测试法案。

由于皮肤模型自身性能的特点，要求能够在体外保持其结构和活性，从而确保测试结果的准确性，因此模型的推广应用范围受到其保存运输条件的制约，同时还应最大限度地排除外来化学物的影响。因此开发一种适合组织工程皮肤模型保存运输的培养基意义重大。

目前常见的保存方法有低温保存和常温保存两种，低温保存又可以分为低温冷藏保存(4℃～8℃)和低温冷冻保存(-80℃和-196℃)，由于低温冷冻过程中易产生冰晶，而对细胞、组织造成损伤，若采用低温冷冻保护剂，因保护剂浓度过高会给模型带来毒性作用，影响产品应用效果；因此，组织工程皮肤模型常用的保存温度是4℃～8℃，保存时限为24h～72h。

然而，在4℃～8℃的低温条件下，尤其是在一个相对缺氧的无菌保存条件下，由于能量供给系统平衡被打破，导致皮肤模型中的细胞内外离子泵功能受阻，引起细胞内外Na⁺/K⁺比及Ca²⁺浓度失衡，细胞内部依赖该类离子的酶及生化反应过程受到影响，导致细胞生理活动受阻，细胞膜及细胞骨架损伤，表现为细胞肿胀、坏死或凋亡；另外，随着保存时间的加长，细胞也由有氧代谢途径转为无氧代谢途径，从而会产生大量的自由基和酸，自由基会选择性攻击细胞膜系统，加剧细胞低温损伤，最终造成皮肤模型失去活性。

针对上述问题，相继出现了许多组织低温保存液，如UW液(威斯康星大学研制的低温保存液，HTS-BASE(HYPOTHERMOL)，HTS-FRS，L-15液，DMEM等。但这些保存液主要用于保存离体器官，并且应用此类保存液要求将组织器官完全浸没其中，并需要一定的设备辅助完成保存。而皮肤模型主要用于化妆品药品中化学物质成分的安全性检测，在其表面不能接触任何可能会影响测试结果的化学物质，因此上述保存方法不适用。

中国专利200910078302.X中提到在基础培养液中加入营养物质和琼脂，制成固体培养基，用来保存组织工程皮肤，但该培养基仅限于常温保存，因地域、季节等多种因素，要维持常温保存条件需要特殊的温控设备，从而大幅度增加运输成本；若将该培养基用于低温保存运输，在长期低温缺氧状态下，细胞能量利用途径发生改变，由原来的有氧呼吸转为糖酵解，能量利用率大幅度降低，需要及时补充糖酵解所需代谢底物。同时需要补充能够提高各种生物酶活性的物质，对于糖酵解产生的大量的酸和自由基也应有抗氧化剂予以清除，而该培养基从成分上看仅包含能维持组织工程皮肤正常生理活动的物质，不具备能满足能量代谢转换，抑制代谢产物等损伤的成分，因而不具备有效减低低温缺氧损伤的作用，后果是细胞因为缺氧损伤及氧化损伤得不到抑制而导致整个组织活力下降，组织结构破坏，无法进行后续操作。

随着人们对低温损伤的不断研究，发现了很多可用于调节细胞离子转运、稳定细胞膜系统及细胞骨架，清除自由基，提高细胞能量代谢率等作用的化学物质，这些物质可发挥保护细胞、组织免受低温损伤的作用，据文献报道，海藻糖和蔗糖主要对维持细胞内外液体渗透压有重要作用；葡萄糖、腺苷及1，6-二磷酸果糖可以维持组织在有氧代谢及无氧代谢条件下的能量供应，保证细胞正常生理活动需要；去铁胺(DFO)可有效的降低细胞在低温保存复苏后凋亡及坏死比例，同时对于修复线粒体损伤，维持细胞骨架结构有很好的作用，加上甘氨酸、丙氨酸的对受损细胞的修复作用，可以有效的减少细胞及组织在低温缺氧状态下的损伤。α-生育酚(VE)属于抗氧化剂。而VC和VE协同作用可以更有效的发挥VE的抗氧化作用，降低自由基对细胞的损伤作用。

至今尚没有一种较理想的皮肤模型的低温保存运输培养基，该培养基应具有减少组织细胞低温缺氧损伤，有效保证皮肤模型测试结果的准确性，同时方便操作及长途运输的特点。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是针对组织工程皮肤在低温保存运输过程中存在的活力降低、结构损伤等问题，提供一种固体的低温保存运输培养基及使用方法。

本发明主要是通过以下技术方案来实现：

该组织工程皮肤低温保存运输固体培养基，其特征在于，其组分包括：细胞培养液及其添加成分。

所述细胞培养液,是指MCDB153，DMEM，HTS液，F12，或F12和DMEM混合培养液。F12和DMEM混合培养液的体积比1:1或1:3。

所述添加成分包括：缓冲体系HEPES、Agarose(Low melting gel)，低温保护剂海藻糖、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、α-生育酚、维生素C、去铁胺(DFO)、1,6-二磷酸果糖(FDP)。

上述各添加成分的浓度,分别为：缓冲体系HEPES 1～100mmol/L、琼脂糖0.25％～2％、海藻糖0.1～10mmol/L、蔗糖0.1～30mmol/L、甘氨酸1～100mmol/L、丙氨酸0.5～50mmol/L、腺苷1～100mmol/L、α-生育酚0.01～10mmol/L、维生素C 0.01～10mmol/L、去铁胺(DFO)0.01～10mmol/L、1,6-二磷酸果糖(FDP)0.1～10mmol/L。

该皮肤模型低温保存运输之固体培养基的配制方法如下：

一.制备A液、B液

A液：在细胞培养液中，分别加入HEPES、海藻糖、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、α-生育酚、维生素C、去铁胺(DFO)、1,6-二磷酸果糖(FDP)，添加无先后顺序，充分溶解后，过滤除菌；

B液：将低熔点(28-32℃成胶，62-68℃熔化)琼脂糖用去离子水溶解，灭菌备用。

二.振荡混匀

按照体积比1:1的比例在B液中缓慢加入A液，振荡混匀后，获得皮肤模型低温保存运输的固体培养基。

本发明之皮肤模型低温保存运输的固体培养基的使用方法：

1.将培养完成的皮肤模型连同外部培养小室嵌入固体培养基，注意避免产生气泡以影响保存效果；

2.将固体培养基连同皮肤模型置于无菌袋中封口，4℃～8℃条件下保存24～72小时；

3.在皮肤模型使用前，将组织工程模型放在表皮细胞培养液中，在二氧化碳培养箱中复苏18～24小时，即可用于后续检测项目。

本发明中的有效成分HEPES、海藻糖、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、α-生育酚、维生素C、去铁胺、1,6-二磷酸果糖等，均是低温缺氧状态下细胞及组织的良好保护剂：

首先，通过添加海藻糖和蔗糖这样的大分子物质，可以有效维持细胞内外渗透压，确保细胞正常的生理环境；低温缺氧条件下，细胞内的离子转运异常，表现为细胞内的动力工厂-线粒体损伤，细胞能量代谢无法正常进行，细胞膜肿胀等。本发明中的甘氨酸和丙氨酸，可以抑制钙离子信号的传导、降低肿胀细胞胞膜的通透性，防止离子转运异常情况的恶化，同时辅助应用去铁胺修复组织细胞在低温缺氧状态下造成的线粒体损伤，恢复细胞正常的能量供给及细胞内外离子平衡，增加细胞膜稳定性；同时由于低温缺氧保存过程中会产生大量的自由基和酸性物质，会进一步加剧细胞膜损伤，通过α-生育酚、维生素C两种较好的抗氧化剂的协同作用，以及HEPES缓冲剂建立的缓冲体系，可以有效的降低组织细胞在低温缺氧状态下及糖酵解过程中产生的大量自由基和酸，维持正常的细胞生长环境。

与现有技术相比，本发明通过优化低温保存液配方，较好地保持了组织工程皮肤模型在低温保存运输后的生物学活性及特异性功能。琼脂糖可以使培养基固化，便于组织工程模型长途运输，为组织工程皮肤模型的推广应用提供了便利，具有重要的实际应用价值。

目前，未见有文献或专利报道将海藻糖，蔗糖，磷酸果糖，腺苷，去铁胺(DFO)，甘氨酸，丙氨酸，VC，α-生育酚等组合应用于组织工程皮肤的低温保存培养基中。因此，本专利组合应用以上多种物质，开发一种新型固体培养基，该固体培养基能有效的降低组织工程皮肤模型在低温保存运输后损伤程度，提高组织工程皮肤模型在保存复苏后的效果，主要体现在以下三个方面：

1.该技术有效解决了皮肤模型保存运输问题，在保持皮肤模型生物活性的同时，不需特殊温控设备辅助即可完成皮肤模型的低温保存运输。

2.固体培养基保存可以有效避免因皮肤模型表面沾染其他化学物质而导致的测试结果不准确的问题。

3.整个操作过程简便易行，使用方便，保存方便，复苏方便。

附图说明

图1、组织工程皮肤模型低温保存复苏结果的对比坐标图；

图2、为新鲜组织工程皮肤的H&E染色结果(200倍放大)照片；

图3、为未添加保护剂仅用细胞培养液加琼脂糖保存72h后复苏的组织工程皮肤的H&E染色结果(200倍放大)照片；

图4、为应用该发明方法保存72h后复苏的组织工程皮肤的H&E染色结果(200倍放大)照片；

图5、组织工程皮肤模型HTS-FRS保存复苏结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明做进一步说明。

实施例1组织工程表皮皮肤低温保存

低温保存培养基制备：低温保存培养基以表皮细胞培养液MCDB153为基础，取100ml MCDB153培养基，按所示终浓度向其中添加：HEPES 100mmol/L、海藻糖0.1mmol/L、蔗糖30mmol/L、甘氨酸50mmol/L、丙氨酸0.5mmol/L、腺苷5mmol/L、α-生育酚1mmol/L、维生素C 0.01mmol/L、去铁胺(DFO)10mmol/L、1,6-二磷酸果糖(FDP)0.5mmol/L；溶解后与预先高压灭菌处理的0.5％的琼脂糖溶液按照1:1混合后制备成0.25％琼脂糖浓度的固体培养基。

配制方法如下：

A液：在细胞培养液中，分别加入HEPES、琼脂糖、海藻糖、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、α-生育酚、维生素C、去铁胺(DFO)、1,6-二磷酸果糖(FDP)，添加无先后顺序，充分溶解后，过滤除菌；

B液：将Agarose(Low melting gel)用去离子水溶解，灭菌备用。

在B液中缓慢加入A液，振荡混匀后，获得皮肤模型低温保存运输的固体培养基。

使用方法如下：

将构建成功的组织工程皮肤连同培养器具，嵌入固体培养基表面，无菌条件下封口后，置于4℃条件下保存72h。

保存结束后用37℃预温的MCDB153培养液对组织工程模型进行复温，18h后进行后续检测。

实施例2含黑色素细胞的组织工程皮肤低温保存

低温保存培养基制备：取F12/DMEM(1:1)培养基50ml，向其中加入后续保护物质，使其终浓度分别为：HEPES 1mmol/L、海藻糖10mmol/L、蔗糖0.1mmol/L、甘氨酸100mmol/L、丙氨酸50mmol/L、腺苷1mmol/L、α-生育酚10mmol/L、维生素C 10mmol/L、去铁胺(DFO)0.01mmol/L、1,6-二磷酸果糖(FDP)0.1mmol/L；溶解后与预先高压灭菌处理的2％的琼脂糖溶液按照1:1混合后制备成1％琼脂糖浓度的固体培养基。

将构建成功的含有黑色素细胞的组织工程皮肤连同培养器具，嵌入固体培养基表面，无菌条件下封口后，置于4℃条件下保存24h。

保存结束后用37℃预温的F12/DMEM(1:3)培养液对组织工程模型进行复温，18h后进行后续检测。

实施例3全层组织工程皮肤低温保存

低温保存培养基制备：低温保存培养基以表皮细胞培养液F12/DMEM(1:3)，取50ml的F12/DMEM(1:3)培养基，按所示终浓度，向其中添加：HEPES 50mmol/L、海藻糖5mmol/L、蔗糖10mmol/L、甘氨酸1mmol/L、丙氨酸10mmol/L、腺苷50mmol/L、α-生育酚0.01mmol/L、维生素C 5mmol/L、去铁胺(DFO)2.5mmol/L、1,6-二磷酸果糖(FDP)10mmol/L；溶解后与预先高压灭菌处理的3％的琼脂糖溶液按照1:1混合后制备成1.5％琼脂糖浓度的固体培养基。

配制方法如下：

A液：在细胞培养液中，分别加入HEPES、琼脂糖、海藻糖、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、α-生育酚、维生素C、去铁胺(DFO)、1,6-二磷酸果糖(FDP)，添加无先后顺序，充分溶解后，过滤除菌；

B液：将Agarose(Low melting gel)用去离子水溶解，灭菌备用。

在B液中缓慢加入A液，振荡混匀后，获得皮肤模型低温保存运输的固体培养基。

使用方法如下：

将构建成功的全层组织工程皮肤连同培养器具，嵌入固体培养基表面，无菌条件下封口后，置于4℃条件下保存72h。

保存结束后用37℃预温的DMEM培养液对组织工程模型进行复温，18h后进行后续检测。

实施例4全层组织工程皮肤低温保存

低温保存培养基制备：低温保存培养基以表皮细胞培养液F12/DMEM(1:1)为基础，取50ml F12/DMEM(1:1)培养基，按所示终浓度，向其中添加：HEPES 25mmol/L、海藻糖2.5mmol/L、蔗糖15mmol/L、甘氨酸30mmol/L、丙氨酸15mmol/L、腺苷100mmol/L、α-生育酚5mmol/L、维生素C 5mmol/L、去铁胺(DFO)5mmol/L、1,6-二磷酸果糖(FDP)2.5mmol/L；溶解后与预先高压灭菌处理的0.5％的琼脂糖溶液按照1:1混合后制备成0.25％琼脂糖浓度的固体培养基。

配制方法如下：

A液：在细胞培养液中，分别加入HEPES、琼脂糖、海藻糖、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、α-生育酚、维生素C、去铁胺(DFO)、1,6-二磷酸果糖(FDP)，添加无先后顺序，充分溶解后，过滤除菌；

B液：将Agarose(Low melting gel)用去离子水溶解，灭菌备用。

在B液中缓慢加入A液，振荡混匀后，获得皮肤模型低温保存运输的固体培养基。

使用方法如下：

将构建成功的全层组织工程皮肤连同培养器具，嵌入固体培养基表面，无菌条件下封口后，置于4℃条件下保存72h。

保存结束后用37℃预温的MCDB153培养液对组织工程模型进行复温，18h后进行后续检测。

实施例5全层组织工程皮肤低温保存

低温保存培养基制备：低温保存培养基以表皮细胞培养液MCDB153为基础，取50ml MCDB153培养基，按所示终浓度，向其中添加：HEPES 15mmol/L、海藻糖7.5mmol/L、蔗糖0.1mmol/L、甘氨酸25mmol/L、丙氨酸50mmol/L、腺苷50mmol/L、α-生育酚5mmol/L、维生素C 5mmol/L、去铁胺(DFO)1mmol/L、1,6-二磷酸果糖(FDP)10mmol/L；溶解后与预先高压灭菌处理的2％的琼脂糖溶液按照1:1混合后制备成1％琼脂糖浓度的固体培养基。

配制方法如下：

A液：在细胞培养液中，分别加入HEPES、琼脂糖、海藻糖、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、α-生育酚、维生素C、去铁胺(DFO)、1,6-二磷酸果糖(FDP)，添加无先后顺序，充分溶解后，过滤除菌；

B液：将Agarose(Low melting gel)用去离子水溶解，灭菌备用。

在B液中缓慢加入A液，振荡混匀后，获得皮肤模型低温保存运输的固体培养基。

使用方法如下：

将构建成功的全层组织工程皮肤连同培养器具，嵌入固体培养基表面，无菌条件下封口后，置于4℃条件下保存72h。

保存结束后用37℃预温的MCDB153培养液对组织工程模型进行复温，18h后进行后续检测。

以下是上述实施例的实验测试情况：

图1、组织工程皮肤模型低温保存复苏结果的对比坐标图

为运用本发明所示固体培养基对组织工程皮肤模型进行低温(4～8℃)保存并用普通表皮培养基复苏后的相对活力，其中正常对照为新制备的组织工程皮肤组，1为未添加保护剂组，2为添加各保护剂组，T型线表示的是实验的标准差。

验证结果显示，添加保护剂组2较未添加组1在保存及复苏后，组织工程皮肤活力保持较好，证明添加保护剂组可有效降低组织工程皮肤模型低温保存损伤，提高组织工程皮肤低温保存后复苏活力。

图2、图3分别为新鲜组织工程皮肤的H&E染色结果(200倍放大)照片和未添加保护剂仅用细胞培养液加琼脂糖保存72h后复苏的组织工程皮肤的H&E染色结果(200倍放大)照片。

通过图示可以看出，新鲜组织结果层次分明，细胞数量多，形态完整，而经过低温保存后组织工程皮肤出现组织结构层次不清晰，细胞数减少，出现细胞皱缩和空腔，说明低温保存对组织工程皮肤存在较严重的损伤作用。

图4为应用该发明方法保存72h后复苏的组织工程皮肤的H&E染色结果(200倍放大)照片。

图5为应用HTS-FRS对组织工程皮肤保存72h后复苏的H&E染色结果(200倍放大)照片；

由图4、图5比较可以看出，未添加保护剂组及商业化的HTS-FRS培养基均无法抵御低温缺氧状态下造成的组织工程皮肤损伤，而导致活力下降及组织结构破损。应用本发明中的方法低温保存72h后的组织工程皮肤在组织活力、细胞形态和组织结构上都与新制备的组织工程皮肤无显著差异。