用于圆锥形角膜治疗的由离子透入法递送的改良的交联组合物

摘要

本发明涉及含有作为角膜胶原的交联剂的核黄素的眼科组合物的改良制剂，其通过角膜离子透入给药，能够保证角膜基质的核黄素渗透能力的增加，并且因此在圆锥形角膜的治疗中有更强的治疗功效。

说明书

本发明涉及医药学领域，并且更具体地涉及用于局部眼科应用制剂领域， 其通过离子透入的方式给药，以进行用于圆锥形角膜治疗的角膜胶原的交联( CXL)，本发明尤其是涉及含有核黄素的眼科组合物的改良制剂。

由核黄素和UV-A诱导的胶原交联是在眼科学中广泛使用的实践，其包括 基质胶原纤维的光聚合，目的是由来自UV-A型发光器的紫外光的辐射，通过 光敏剂与吸光物质(更具体地是核黄素)的组合作用，增加其刚性和对圆锥形 角膜的累进角膜突出的抗性。

本发明的目的是提供作为改良的交联剂的核黄素的眼科溶液，其在圆锥形 角膜或其它扩张型角膜疾病的治疗实践中通过离子透入的方式给药，该溶液在 角膜基质中具有改善的渗透和穿透特征，显著减少治疗所需的时间并且改善性 能和治疗结果。

与大脑相似，眼睛受到生物屏障(血-眼屏障，血-玻璃体屏障)的保护， 这使得以足够浓度给予药物变得困难，尤其是在眼的后段。通过系统给药(通 过口服或静脉给药)，只有一小部分的原始量的药物可以被递送到内部眼组织 中，所以其是不足的。

滴眼剂的局部应用无法治疗眼的后段，其渗透是非常有限的(通常低于5％ )，已经开发了用于向眼睛局部给予药物的技术并且经过不断努力研究来改善 其效率。直接在眼球周围(眼球周、眼球后)或在眼球内(眼内)注射是严重 创伤性的。光动力学治疗，包括药物的注射及其使用特定波长的激光的原位系 统激活，具有角膜透明度的优点，但是其缺点在于患者必须保持在黑暗中，药 物必须通过加入防止活性成分在其由光激活之前发挥作用的光敏试剂来改性， 还需要使用特定和昂贵的仪器来进行该治疗。已经开发了在眼表面上放置的设 计用于通过使用药物罐以连续或程序化的方式递送药物的各种装置，所述的装 置因此是非侵入性的，或是在结膜囊中的镜片或环的形式。然而，向眼的后段 输送物质是受限制的，因此这些装置的应用限于眼前段病理的治疗，例如，用 于结膜炎的治疗。经外科手术位于玻璃体液中的用于程序化释放药物的眼内植 入物具有通过接触破坏视网膜的严重风险，因为其需要相对大的切口(5mm )来放置植入物。另一个明显的缺点涉及可能需要替换植入物，或随着疾病对 于治疗发反应干涉以中断或改变治疗。

为了改善核黄素的角膜吸收(核黄素常用作在角膜交联过程中的光敏试剂 和固化剂)而不必须采用角膜上皮的去除，并且以这样的方式得到非侵入性角 膜交联、消除或减少麻醉和产生更快的愈合，专利申请WO2010/023705已经提 出使用吸收增强剂，其包含与氨基丁三醇交联的EDTA和/或与氨基丁三醇交联 的EDTA的盐，来形成以滴加到角膜表面的滴眼液的形式给药的眼科组合物。

另一个可能的解决方案是使用眼部离子透入。

这是另一个用于给予活性成分治疗作用的技术，其允许减少其它用于眼部 给药的技术的大多数缺点。事实上，其使得以非侵入性的方式实现在眼中的浓 度和停留时间，以及因此实现等于或超过用本领域的其它技术所得到的转移效 率成为可能。

离子透入背后的原理涉及向含有至少一种药物的电解质组合物施加电场， 以将体内的药物或多种药物传输通过生物膜。该技术已经在皮肤病、骨关节疾 病的治疗中长期临床使用，但是最近被证明特别适用于向眼中传输活性组分和 药物。

然而，因为眼与大多数其它身体部分的器官极为不同，眼部离子透入必须 接受与其它类型的离子透入的技术特异性不同的技术特异性(强度和电流密度 、施加电场的持续时间和控制、待给予的化学物质的物理方面、在给药期间溶 液中出现的电化学现象)。

具体地，国际专利申请WO2011/130356要求保护一种在眼的至少一个部 分中激活交联的方法，该方法包含向眼部分运输带电的交联剂，使用离子透入 过程使其在深度推入，以及向目镜元件传送原始元件的交联剂的激活，其中目 镜元件是角膜、角膜缘、巩膜和视网膜。按照所述专利申请的教导，诸如核黄 素的交联剂可以各种浓度与其它试剂如EDTA、苯扎氯铵或醇组合来促进进一 步传输穿过角膜表面。然而，该描述并没有限定交联剂的各组分的量或浓度。

在眼科领域存在正在进行的关于转移角膜核黄素来进行角膜胶原的交联 的最佳方式的争论，临床研究的结果表明核黄素的离子透入施加应该减少了处 理时间并且消除了对治疗前去除角膜上皮的依赖。George Waring的文件的互联 网出版物“旧技术，新递送(Old technique，new delivery)”Ophthalmology Times  Conference Brief(眼科新进展会议简报)，2011年10月22日，URL： http：//ophthalmologytimes.modernmedicine.com/ophthalmologytimes/ModernMedi  cine+Now/Old-technique-new-delivery/ArticleStandard/Article/detail/745363，揭示 了加速核黄素转移的离子透入治疗消除了角膜上皮去除的需要。

本发明的申请人已经在2011年12月1日提交的专利申请WO2012/095877 中揭示了离子透入法递送眼科组合物的应用，该组合物优选含有核黄素或其它 促进交联的试剂，该组合物被设计在圆锥形角膜和其它眼部的扩张型疾病的治 疗中的胶原的角膜交联的实践中渗透角膜基质。由于通过电流促进的转移效率 的增加，给药的时间显著减少，并且过程对于患者更为舒适。

在前述的专利申请中所述的眼科组合物被专门设计通过离子透入的方式 来增加它们在眼内和穿过眼部的转移能力。具体地，所述的组合物是基于 0.1-1％的核黄素，或同时还有由缓冲性质表征的其它交联剂，如磷酸钠。以这 种方式，在圆锥形角膜或其他其他角膜扩张型疾病的治疗中，通过交联角膜的 方式，所述的组合物在不必进行角膜上皮除去的情况下，改善了角膜基质中的 渗透和穿透。按照所述的专利申请，待通过离子透入的方式转移的眼科溶液必 须有5-8范围的初始pH，来起到缓冲剂的作用并且达到不超过9的终值。另外， 葡聚糖的存在保证了对眼部表面的良好粘附，确保更好的接触并且因此更好地 由核黄素溶液渗透角膜基质。

然而，尽管由眼部离子透入给药提供了显著的改善，总是存在特定的感觉 ，即需要通过离子透入的方式改善眼部转移的效率来进一步降低在组织中造成 灼烧、刺激和一般毒性现象的风险，这些可能限制眼部离子透入的长期应用。 希望进一步减少实施离子透入的时间来减少在该处理的执行期间的潜在风险 并且改善患者的舒适度。

专家能够干预来改善眼部离子透入过程的效率和成功率的参数有很多并 且性质不同，事实上，它们涉及：施加电场的区域是巩膜而不是角膜，后者是 特别娇嫩的；最小化电场的密度，施加面积和电极面积；控制施加的电场的强 度来实现良好的再现性；限制施用；和最后，待转移的溶液的特征。

发明描述

因此本发明的目的是提供用于圆锥形角膜的治疗、基于核黄素、适于通过 离子透入给药的新的制剂，其特征在于与本领域的制剂相比在角膜基质中更好 的跨上皮渗透。

在圆锥形角膜或其它角膜扩张型疾病的治疗的实践中，通过角膜交联的方 式改善的渗透和透入角膜基质而不必进行角膜上皮去除的能力，是以与现有技 术的制剂相比用本发明的制剂处理的眼的角膜刚性的增加作为参数来评估。

因此，从CXL治疗的角度来看，本发明的一个目的是提供适于角膜渗透的 、基于核黄素的特定产物的制剂，其必须通过离子透入的方式被传输至角膜并 且随后由UV光辐射。更具体地，本发明的一个目的是提供特别适于通过离子 透入给药的溶液，该溶液的pH值和渗透压能够确保最优渗透流并且其是相对于 核黄素溶液转移的合适方向上的，其必须响应UV的辐射来操控角膜基质的胶 原纤维的交联。

因为离子透入基本上是通过电场的施加促进带电的物质穿过生物膜的运 动，渗透压和pH是溶液通过离子透入的方式的转移效率的非常重要的和决定性 的物理参数。当在膜上施加电场，并且产生含有中性或离子物质的溶液的移动 时，建立了电渗流，其与待转移的活性组分的离子或中性物质的浓度成正比。 电渗流的方向发生在膜电荷的抗衡离子的方向上。在生理pH值下(pH＝7.4)， 皮肤，如同包括角膜和巩膜在内的大多数生物膜是带负电的。因此，电渗电流 加强了带正电的药物的阳极转移(+)，同时带负电的药物的阴极转移(-) 被延迟。在低pH值下，生物表面的电荷转换为正电并且渗透流发生反转。这解 释了通过离子透入给药的溶液的pH值的重要性，其还防止了对于结膜和角膜的 破坏(眼可以耐受相当宽的pH范围并且眼科溶液的pH可以在4.5-11.5之间变化 ，然而用于防止角膜破坏的pH值的范围是6.5-8.5)，同时将渗透流的相对贡献 维持在合适的水平和方向上。另外，如果保持施加的电流的持续时间短，则在 溶液中的离子物质的数量是稳定的。

在本发明的优选实施方式中，基于核黄素磷酸盐的制剂已经被鉴定显示相 对于pH和渗透压的测量值的最优参数。具体地，按照本发明的制剂具有6.5-8 的pH值，优选的制剂pH值是6.9-7.2，甚至更优选pH值是7.0，同时制剂的渗透 压的值是90mOsm/l-300mOsm/l，优选96mos/l。

按照本发明的具体实施方式，制剂不含葡聚糖。事实上，令人惊讶的是， 由本发明的申请人进行的近期研究已经显示在圆锥形角膜或其它扩张型角膜 疾病的治疗的实践中由作为CXL治疗后角膜刚性的函数的后验(posteriori)来 评估的，在不必进行角膜上皮的去除的情况下核黄素在角膜基质中渗透和透入 特征通过使用溶液明显改善，该溶液与之前已经假定的不同，其不含葡聚糖或 氯化钠。

本发明的其它优点和特征也会如纯粹通过示例而非限制地参考附图的本 发明的详细描述所示。

图1显示在用本发明的制剂处理的眼的压力与张力曲线中所得的实验结果 ，处理的眼的角膜的抵抗，和因此用于圆锥形角膜病症的治疗性溶液的转移效 率，并且在不含NaCl的制剂的情况下其进一步显著增加，进一步证明通过离子 透入处理转移的治疗性溶液的渗透压的重要性。

令人惊讶地，在按照本发明的组合物的制剂中缺少葡聚糖和NaCl是特征的 和创新的，并且与通过离子透入给予并且用于圆锥形角膜的治疗中的眼科溶液 的领域中现有技术所述的组合物的功效相比提供了意料之外的优势。

具体地，由于缺少氯化钠导致的非常低的渗透压值，使得组合物表征为显 示出以用按照基于核黄素的溶液的离子透入转移的角膜交联处理的眼的增强 的抵抗表示的最佳性能。

按照本发明的溶液还可以包含缓冲体系来维持pH值在6.9-7.2的最优范围 内。多种缓冲体系为本领域技术人员所知并且可以用于按照本发明的一些实施 方式中。然而，在本发明的一些优选的实施方式中，磷酸二氢钠/磷酸氢二钠体 系提供了足够的缓冲能力以将pH维持在希望的范围内。

本发明的眼科组合物还含有眼科可接受的形式的EDTA的盐，其可以是与 也被称为氨基丁三醇的三-(羟甲基)氨基甲烷交联的，或非交联的。

本发明的眼科组合物能通过洗眼剂和滴眼剂、胶、以及按照已知的技术能 够在角膜施用之后实施离子透入的所有药学形式中的任意情况的技术形式制 备；下文是为说明目的提供的实施例，不对本发明构成任意限制。在本发明的 范围内的其他方面、优点和改良对本发明的技术领域的技术人员是显而易见的 。

药物组合物

下面提供了按照本发明的制剂的药物组合物，其中单个组分的剂量以重量 百分比表示。

实施例1-制剂A

实施例2-制剂B

成分 重量％ 核黄素磷酸钠 0.147 EDTA钠 0.1 三-(羟甲基)氨基甲烷 0.05 NaH₂PO₄·2H₂O 0.385 Na₂HPO₄.2H₂O 0.217 H₂O 高至100ml的量 pH7   渗透压 96mOsm/kg

实验数据

为了评估通过离子透入的方式递送的基于核黄素的制剂与现有技术的已 知的制剂相比在兔眼中改善的跨上皮渗透的能力，考虑转移对角膜刚性的影响 进行以下的初步研究。

对于实验研究，其实施符合欧盟委员会和视觉与眼科研究协会(ARVO) 的眼科和视觉研究中动物使用的声明，使用12只兔，品系GD79b(有颜色的) ，2-3月龄并且重量为2.0-2.5kg。在到达时所有的动物通过耳部标签来鉴别并 且在测试之前检查，向眼的情况给予特别的关注。在经过实验过程之前，观察 所有的动物至少3天并且仅在没有疾病信号的情况下使用。

12个有颜色的兔子GD79b品系被随机分为4组，每组2个动物，各组对应于 本研究中考虑的4种类型的治疗。

下面的表1汇总了在4个治疗组中动物的分配。

表1

-组1在右眼中通过离子透入5分钟并且在1mA电流强度下接受角膜给药 0.1％的专利申请RM2008A00472中所述的溶液。

-组2在右眼中通过离子透入5分钟并且在1mA电流强度下接受角膜给药 0.1％的PREP A溶液。

-组3在右眼中通过离子透入5分钟并且在1mA电流强度下接受角膜给药 0.1％的PREP B溶液。

-组4在右眼中通过被动扩散30分钟接受角膜给药0.1％的专利申请 RM2008A00472中所述的溶液。

离子透入过程

动物在右眼中经过离子透入，同时左眼作为未处理的对照，使用由两个一 次性组件组成的离子透入装置：眼部施加器和返回电极，其与可重复使用的发 生器结合。用医用泡沫PUR(先进医用溶液(Advanced Medical Solutions)BV -refMCF03)和通过电缆与生成器(阴极)连接的不锈钢电极(AISI304)来 填充由10mm直径和4.5mm高度的聚碳酸酯储器组成的眼部施加器。返回电极 是插入到动物的颈部并且通过夹和电缆与生成器(阳极)连接的皮内针25G。 生成器递送调节范围为0.25mA-2.5mA(对于0.25mA的电流，具有10个增量 )的恒定电流，并且维持0.5分钟-5分钟(0.5分钟，具有10个增量)。在该过 程中，用万用表测量施加的电压。

UV辐射

使用由CSO眼科公司(CSO Ophthalmic)构造的医学装置VEGA CBM  X-Linker来实施用于用核黄素交联角膜胶原的UV-A的辐射。该装置装配有用于 发射370nm波长的光的一排LED、能够改变待处理的面积的光圈、用两个间歇 的红色LED聚焦的系统、具有LCD监测器来捕获过程的实时图像的微型相机、 结合在相机上的使患者维持合适的对准的同轴固定光。用功率计控制能量并且 维持在3.0mW/cm²。

总共辐射所有的动物30分钟，使用6个阶段的辐射，每个阶段持续5分钟。 如果需要，每当辐射的角膜变干，给予一滴盐水。在每个辐射步骤结束时，用 盐水溶液洗涤角膜并且在各辐射步骤开始之前加入一滴待给予的溶液。

在辐射之后，用过量静脉注射戊巴比妥来杀死动物，快速取样两只眼睛并 且用于生物机械试验。

经过4种类型的治疗的眼的生物机械评价的结果提供了在角膜胶原纤维的 交联过程之后眼的抵抗并且突出了由使用的4种类型的治疗和三种具有不同组 成的溶液产生的效果的差异。

所得的数据示于下表2。

表2

CCT＝中心角膜厚度

RICROLIN TE＝专利申请RM2008A00472中所述的组合物所对应的溶液的 商品名

已经在图1所示的图中表示数据，其中压力表示为伸长或张力的函数。

压力指示样品的机械性质，由施加在样品的给定区域的力除以该区域的表 面的比值计算，同时伸长代表物体承受的长度变化除以其原始长度。

如原始数据所示，其由图1中的压力与张力的曲线表示，经过对应于含有 核黄素磷酸钠、EDTA钠和磷酸盐缓冲液和水的制剂B的核黄素溶液通过离子 透入递送治疗的眼(实验组3)，其具有超过对照眼约3倍的中心角膜厚度，和 已经在UV-A辐射之前经过接受也含有葡聚糖的核黄素制剂A的溶液通过离子 透入的方式(实验组2)、或包含NaCl和葡聚糖的溶液通过离子透入的方式( 实验组1)或通过简单吸收(实验组4)的方式递送的角膜交联的眼，如之前在 专利申请RM2008A00472、PCT/IT2009/000392、PCT/IT2011/000010中分别描 述。在实验组3的眼中鉴定的较大的中心角膜厚度是制剂B溶液在促进能够向角 膜提供更大刚性的角膜胶原纤维的交联中更大的效果的结果。在这个方式中， 在圆锥形角膜和其它相关的角膜疾病的治疗中，制剂B溶液的使用是治疗上更 有优势的。

与通过角膜交联处理的眼的增加的抵抗相关，以及因此与本发明的不含氯 化钠的目标组合物，(制剂B溶液)渗透和透入角膜相关的实验数据似乎与基 于离子透入机制的概念所期望的相反：事实上，氯化钠在待通过离子透入转移 的溶液中的存在应该涉及增加的电导率，并且溶液的良好电导率通常导致带电 物质的良好转移速率。

与所期望的相反，可能在待通过离子透入转移的组合物中解离形式的氯化 钠的存在，使经过离子透入的膜饱和中发挥出对于活性成分(核黄素磷酸盐) 的竞争效应；或者，氯化钠的解离电荷的存在中和了在实验的pH值下带负电的 核黄素磷酸盐或在组合物中作用为增强剂的其它化学物质(例如，眼科可接受 的形式的EDTA的盐)的电荷，导致较低的通过离子透入促进的活性成分的有 效转移。

最近，本专利申请的申请人基于已经观察到的现象正在进行目标为理 解物理-化学机制理解的进一步研究。