卵巢组织深低温保存方法

摘要

本发明涉及生殖医学领域，具体而言，涉及卵巢组织深低温保存方法。该卵巢组织深低温保存方法，包括以下步骤：将待冷冻的卵巢组织用体积浓度为8-12％的透明质酸酶溶液在室温下培养10-15分钟，得到酶解后卵巢组织；将所述酶解后卵巢组织加入到冷冻保护剂中，在3-5℃预平衡10-15分钟，得到预平衡后卵巢组织；将所述预平衡后卵巢组织进行程序化冷冻，使其温度降至-150℃后，转入液氮罐进行储存。本发明提供的该卵巢组织深低温保存方法，与现有技术中常见的30-90分钟的预平衡时间相比，大幅缩短了预平衡的时间，避免了由于预平衡时间过长，进而导致其冷冻保护剂对卵巢组织的细胞毒性损伤。

说明书

技术领域

本发明涉及生殖医学领域，具体而言，涉及卵巢组织深低温保存方法。

背景技术

近年来，恶性肿瘤呈现出发病率增加和低龄化趋势，随着早期诊断以及放、化疗手段的进步，多种恶性肿瘤治愈率可达90％以上。但儿童期、青春期以及育龄期女性接受大剂量联合化疗和放疗后，其性腺毒性可能会导致卵巢早衰和生育力丧失，极大降低了治疗后长期生存的女性患者的生活质量，严重影响其社会家庭角色。因此，女性生育力保护和保存已成为生殖医学领域亟需解决的重大课题。在女性生育力保存中，卵巢组织深低温保存是最有潜力和最受关注的技术之一，已成为近年生殖医学领域研究的热点。

程序化慢速冷冻法是目前卵巢组织深低温保存的标准方法。该方法通常将卵巢组织在3-5℃下置于含有冷冻保护剂的溶液中预平衡，使冷冻保护剂充分渗透卵巢组织后，再放入含冷冻保护剂的冷冻管中，在相应的冷冻设备中按设定冷冻程序冷冻。其中，Gosden提出的二甲亚砜(DMSO)冷冻方案和Gook推荐的丙二醇(PROH)冷冻方案，是目前应用最多，效果较为理想的冷冻方案。

在Gosden提出的方案中，冷冻保护剂采用1.5M DMSO+0.1M蔗糖的程序化冷冻保护液；Gook推荐的PROH冷冻方案中使用含有1.5M PROH+0.1M蔗糖的程序化冷冻保护液。在上述的两种方案中，待保存的卵巢组织均需要加入到冷冻保护剂(液)中预平衡30-90分钟；然后再利用相应的冷冻设备进行深低温冷冻保存。

在相关技术中，由于卵巢组织结构致密，在冷冻中，为了使冷冻保护剂在卵巢组织的中心也能达到理想浓度，则必须延长卵巢组织在冷冻保护剂中的平衡时间，使保护剂充分渗透(目前通常将卵巢组织置于冷冻保护剂中平衡30-90分钟)。虽然冷冻保护剂在避免人卵巢组织冷冻过程中的冷冻损伤发挥重要作用，但其自身也存在组织细胞毒性，在预平衡的过程中，卵巢组织长时间(30-90分钟)地置于冷冻保护剂中，由于平衡的时间过长，冷冻保护剂往往会使卵巢组织受到细胞毒性损伤，影响冷冻效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种卵巢组织深低温保存方法，以解决卵巢组织在预平衡的过程中易被冷冻保护剂的细胞毒性造成损伤的技术问题。

在本发明的实施例中提供了卵巢组织深低温保存方法，包括以下步骤：

将待冷冻的卵巢组织用体积浓度为8-12％的透明质酸酶溶液在室温下培养10-15分钟，得到酶解后卵巢组织；

将所述酶解后卵巢组织加入到冷冻保护剂中，在3-5℃预平衡10-15分钟，得到预平衡后卵巢组织；

将所述预平衡后卵巢组织进行程序化冷冻，使其温度降至-150℃后，转入液氮罐进行储存。

本发明提供的这种卵巢组织深低温保存方法，在将待冷冻的卵巢组织进行预平衡之前，利用透明质酸酶溶液(体积浓度为8-12％)在室温下培养处理。卵巢组织由于含有大量的胶原结缔组织，使其本身具备结构致密的特性，而通过既定体积浓度的透明质酸酶溶液对其进行室温培养的操作，实现了透明质酸酶对胶原等组织进行酶解的效果，使致密的卵巢组织间质疏松，进而利于后续预平衡过程中冷冻保护剂的顺利渗透；为缩短后续在冷冻保护剂中的平衡时间奠定基础。通过酶解处理之后，在预平衡的过程中，仅用10-15分钟即可达到预平衡效果(冷冻保护剂渗透到卵巢组织中心)；与现有技术中常见的30-90分钟的预平衡时间相比，大幅缩短了预平衡的时间，避免了由于预平衡时间过长，进而导致其冷冻保护剂对卵巢组织的细胞毒性损伤。

可选的，在所述步骤将待冷冻的卵巢组织用体积浓度为8-12％的透明质酸酶溶液在室温下培养10-15分钟，得到酶解后卵巢组织之前，还包括：

收集卵巢组织，并将其置于含10％胎牛血清的L-15培养液；

将加入有卵巢组织的L-15培养液转至冰盒，在8-12分钟内转到无菌超净工作台内，更换新鲜的含10％胎牛血清的L-15培养液；

剪除所述卵巢组织的卵巢髓质，并将去除卵巢髓质的卵巢皮质剪成厚度为1-2毫米、面积为2-3平方毫米的块状，得到待冷冻的卵巢组织。

可选的，在所述步骤将待冷冻的卵巢组织用体积浓度为8-12％的透明质酸酶溶液在室温下培养10-15分钟，得到酶解后卵巢组织；

在所述透明质酸酶溶液中，按照体积份数计，包括0.8-1.2份透明质酸酶和8.8-9.2份含10％胎牛血清的L-15培养液。

可选的，在所述步骤将所述酶解后卵巢组织加入到冷冻保护剂中，在3-5℃预平衡10-15分钟，得到预平衡后卵巢组织中；

所述冷冻保护剂由二甲基亚砜和蔗糖组成；且在所述冷冻保护剂中，所述二甲基亚砜和所述蔗糖的浓度分别为1摩尔每升和0.1摩尔每升。

可选的，在所述步骤将所述酶解后卵巢组织加入到冷冻保护剂中，在3-5℃预平衡10-15分钟，得到预平衡后卵巢组织中，具体包括：

在每1毫升所述冷冻保护剂中加入2-3片酶解后的所述卵巢组织，并在4℃预平衡15分钟，得到预平衡后卵巢组织。

可选的，在所述步骤将所述预平衡后卵巢组织进行程序化冷冻，使其温度降至-150℃后，转入液氮罐进行储存中；

所述程序化冷冻利用程序冷冻仪完成。

可选的，在所述步骤将所述预平衡后卵巢组织进行程序化冷冻，使其温度降至-150℃后，转入液氮罐进行储存中，具体包括：

将装有预平衡后卵巢组织的冷冻管放入程序冷冻仪中，开始冷冻温度为4℃，以-2℃/min的降温速率降至-7℃，维持5分钟；

将浸过液氮的镊子夹在冷冻管外壁含有卵巢组织的保护液与空气的交界面，人工植冰，诱导产生冰晶，并维持10分钟；再以-0.3℃/min的降温速率降至-40℃；最后以-30℃/min的降温速率降至-150℃；将整个冷冻管转移至液氮罐进行储存。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例一提供的卵巢组织深低温保存方法流程图；

图2为本发明实施例二提供的卵巢组织深低温保存方法流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本发明中的具体实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

在叙述本发明的具体实施例之前，需要指出的是，在本发明中，含10％胎牛血清的L-15培养液；其是指在L-15培养基中，加入胎牛血清，使其体积含量达到10％；而L-15培养基是细胞生物学领域常用的一种培养基，在此不做赘述。

实施例一

本发明实施例提供的这种卵巢组织深低温保存方法，请参考图1，包括以下步骤：

步骤101：将待冷冻的卵巢组织用体积浓度为8-12％的透明质酸酶溶液在室温下培养10-15分钟，得到酶解后卵巢组织；

在步骤101中，是本发明最为关键的步骤，待冷冻的卵巢组织利用8-12％的透明质酸酶溶液室温培养10-15分钟之后，透明质酸酶可以将卵巢组织所含的胶原等组织进行酶解，酶解后，卵巢组织整体结构疏松，因此，非常利于后续预平衡过程中冷冻保护剂的渗透，直接缩短了预平衡过程的时间。进而有效地防止了由于平衡时间过长导致冷冻保护剂对卵巢组织造成的细胞毒性损伤。

步骤102：将所述酶解后卵巢组织加入到冷冻保护剂中，在3-5℃预平衡10-15分钟，得到预平衡后卵巢组织；

通过透明质酸酶处理之后，得到了酶解后卵巢组织，其组织结构疏松，利于冷冻保护剂渗透，在预平衡的过程中，将酶解后卵巢组织加入到冷冻保护剂中在4℃预平衡15分钟，此时，卵巢组织中心的冷冻保护剂即可达到理想的浓度，进而可以进行后续的程序冷冻操作。

步骤103：将所述预平衡后卵巢组织进行程序化冷冻，使其温度降至-150℃后，转入液氮罐进行储存。

通过程序冷冻的操作，对预平衡后的卵巢组织进行阶梯式降温，缓慢地将其温度降至-150℃，缓慢阶梯降温的方式可以使细胞充分脱水，从而阻止和减轻细胞内冰晶的形成。如果降温过快，水分来不及离开细胞，随着温度进一步降低，将不能阻止冰晶形成，造成细胞内结构损伤和破坏的现象。

本发明提供的这种卵巢组织深低温保存方法，在将待冷冻的卵巢组织进行预平衡之前，利用透明质酸酶溶液(体积浓度为8-12％)在室温下培养处理。卵巢组织由于含有大量的胶原结缔组织，使其本身具备结构致密的特性，而通过既定体积浓度的透明质酸酶溶液对其进行室温培养的操作，实现了透明质酸酶对胶原等组织进行酶解的效果，使致密的卵巢组织间质疏松，进而利于后续预平衡过程中保护剂的顺利渗透；为缩短后续在冷冻保护剂中的平衡时间奠定基础。通过酶解处理之后，在预平衡的过程中，仅用10-15分钟即可达到预平衡效果(冷冻保护剂渗透到卵巢组织中心)；与现有技术中常见的30-90分钟的预平衡时间相比，大幅缩短了预平衡的时间，避免了由于预平衡时间过长，进而导致其冷冻保护剂对卵巢组织的细胞毒性损伤。

为了使得本发明上述实施例的卵巢组织深低温保存方法得到更好的应用，更加有效应用到医学领域中，本发明还在上述实施例的基础之上提供了实施例二，实施例二给出了上述实施例的卵巢组织深低温保存方法进一步细化或者增加，现做详细的阐述和解释，请参考图2：

实施例二

请参考图2，在本实施例中，卵巢组织深低温保存方法的制备方法包括以下步骤：

步骤201：收集卵巢组织，并将其置于含10％胎牛血清的L-15培养液；

在该步骤中，卵巢组织置于10％胎牛血清的L-15培养液，以保证其营养的供给，进而保证其组织活性，另外，10％胎牛血清的L-15培养液，实现了血供效果，为卵巢组织的正常培养提供了充分的营养。

步骤202：将加入有卵巢组织的L-15培养液转至冰盒，在8-12分钟内转到无菌超净工作台内，更换新鲜的含10％胎牛血清的L-15培养液；

在步骤202中，为了尽量避免其被污染和离体时间过长造成的组织缺血损伤，加入有卵巢组织的L-15培养液从冰盒转移到无菌超净工作台的时间需尽可能短，整个更换新鲜10％胎牛血清的L-15培养液也在无菌超净工作台完成。

步骤203：剪除所述卵巢组织的卵巢髓质，并将去除卵巢髓质的卵巢皮质剪成厚度为1-2毫米、面积为2-3平方毫米的块状，得到待冷冻的卵巢组织；

更换新鲜培养液之后，对卵巢组织进行进一步的处理，将其卵巢髓质剪除，剔除不需要保存的髓质部分，同时使卵巢组织更薄，利于保护剂渗透。为了后续预平衡以及冷冻过程中，使得冷冻保护液便于渗入卵巢组织内部，剔除髓质之后，将其剪成厚度为1-2毫米、面积为2-3平方毫米的块状，得到待冷冻的卵巢组织，以备后用。

步骤204：将待冷冻的卵巢组织用体积浓度为10％的透明质酸酶溶液在室温下培养15分钟，得到酶解后卵巢组织；

在该步骤中，优选的，为了实现较好的酶解效果，在所述透明质酸酶溶液中，按照体积份数计，包括0.8-1.2份透明质酸酶和8.8-9.2份含10％胎牛血清的L-15培养液；具体的，在本实施例中，选用体积浓度为10％透明质酸酶溶液，另外，其可以通过常规的配置方法即可获得，如将1ml透明质酸酶加入9ml含10％胎牛血清的L-15培养基中，配成10％浓度的透明质酸酶的培养液。

步骤205：将所述酶解后卵巢组织加入到冷冻保护剂中，在4℃预平衡15分钟，得到预平衡后卵巢组织；

在本实施例中，优选的，采用二甲基亚砜和蔗糖组成的冷冻保护剂，另外，由于在上述步骤201-204中，对卵巢组织进行了酶解的操作，因此，在预平衡的过程中，二甲基亚砜不需要较高的摩尔浓度即可实现较好的平衡效果，例如在现有技术中，二甲基亚砜其浓度为1.5M，在冷冻保护剂中，其浓度越高，平衡时间越长，组织细胞毒性越大。因此，如何减少保护剂细胞毒性是困扰人卵巢组织冷冻的一个重要问题，也是常规程序化慢速冷冻体系的重要缺点；通过酶解之后，在冷冻保护剂中，二甲基亚砜的摩尔浓度可减低至1M，进一步地减少了其对卵巢组织的细胞毒性损伤。

因此，优选的，在本实施例中，所述冷冻保护剂由二甲基亚砜和蔗糖组成；且在所述冷冻保护剂中，所述二甲基亚砜和所述蔗糖的浓度分别为1摩尔每升和0.1摩尔每升。

而且，为了实施平衡充分，使得冷冻保护液能够完全渗入卵巢组织中，优选的，在预平衡的过程中，在每1毫升所述冷冻保护剂中加入2-3片酶解后的所述卵巢组织，并在4℃预平衡15分钟，得到预平衡后卵巢组织。

步骤206：将所述预平衡后卵巢组织进行程序化冷冻，使其温度降至-150℃后，转入液氮罐进行储存；

在步骤206中，优选的，具体的操作可以按照以下步骤进行：

将装有预平衡后卵巢组织的冷冻管放入程序冷冻仪中，开始冷冻温度为4℃，以-2℃/min的降温速率降至-7℃，维持5分钟；

将浸过液氮的镊子夹在冷冻管外壁含有卵巢组织的保护液与空气的交界面，人工植冰，诱导产生冰晶，并维持10分钟；再以-0.3℃/min的降温速率降至-40℃；最后以-30℃/min的降温速率降至-150℃；将整个冷冻管转移至液氮罐进行储存。

在步骤206中，将浸过液氮的镊子夹在冷冻管外壁含有卵巢组织的保护液与空气的交界面，人工植冰，诱导产生冰晶。该步骤主要目的是避免超冷现象的发生。超冷现象是指细胞温度降至冰点附近，如果细胞外液仍未发生冰晶形成，细胞外渗透压不能随之升高，细胞脱水就不能进行，严重影响冷冻效果。通过人工植冰，诱导产生冰晶，就能使细胞外渗透压进一步升高，细胞脱水就能顺利进行，从而完成冷冻过程。

另外，本发明实施例二的深低温保存方法，其与现有技术中常用的方法的参数以及效果做出对比，具体请参考表1和表2：

表1 本发明的深低温保存方法与现有技术对比1

表2 本发明的深低温保存方法与现有技术对比2

通过表1和表2可以看出，本发明提供的方法，其通过添加透明质酸酶溶液对卵巢组织进行酶解的操作即可大幅缩短预平衡的时间以及冷冻保护剂的浓度，且可以实现卵巢组织中心冷冻保护剂的理想浓度，从而减轻组织损伤，更好地冷冻保存人卵巢组织。

综上，本发明创新使用含透明质酸酶的培养液在卵巢组织冷冻前预处理15分钟，通过酶的作用使致密的卵巢组织更疏松，冷冻保护剂更易渗透组织。经酶预处理后，冷冻前只需将卵巢组织置于冷冻保护剂中平衡15分钟，冷冻保护剂就能充分渗透，大幅缩短组织在冷冻保护剂中的平衡时间。该方法解决了传统方案的两个重要缺陷：通过大幅缩短组织在冷冻保护剂中的平衡时间，减少保护剂自身的组织细胞毒性作用。另外，由于透明质酸酶处理后组织疏松，利于保护剂渗透，可以将冷冻保护剂浓度从目前1.5M降低到1.0M，通过降低保护剂浓度，进一步降低冷冻保护剂对组织的细胞毒性损伤。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。