胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401作为制备治疗囊型包虫病药物的应用

摘要

本发明涉及胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401技术领域，是一种胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401作为制备治疗囊型包虫病药物的应用。本发明胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401是一种新型的抗包虫病药物；体内和体外两方面的药效学实验数据，均表明PQ401是一种高效的抗包虫病药物分子，能够破坏细粒棘球蚴囊泡组织结构，导致囊泡细粒棘球蚴囊泡细胞大量坏死；体内药效学实验数据表明该药物与临床常用的阿苯达唑治疗囊型包虫病的药效相当；鉴于临床包虫病患者长期服用阿苯达唑会导致耐药性，因此该药物可作为阿苯达唑的替代品进行治疗包虫病。

说明书

技术领域

本发明涉及胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401技术领域，是一种胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401作为制备治疗囊型包虫病药物的应用。

背景技术

囊型包虫病危害严重，临床缺乏有效治疗药物

包虫病（Echinococcosis）是由棘球绦虫的蚴虫寄生于人体所致的一种严重的人畜共患寄生虫疾病，95%病例为细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus, Eg）的蚴虫囊泡，在人体内寄生所致囊型包虫病（Cystis Echinococcosis, CE）。该病呈全球分布，我国西部七省区（新疆、青海、宁夏、甘肃、西藏、四川、内蒙古）为高流行区，受威胁人口达6600万，每年造成经济损失逾30亿元，是西部农牧民“因病致贫，因病返贫”的主要原因之一，也是倍受关注的严重公共卫生问题，2006年该病被列入国家免费救助计划。

包虫病临床治疗的主要途径是手术切除病灶，术后为预防复发或无法外科手术CE病人，多采用口服阿苯达唑片剂或脂质体进行治疗，但是由于药物治疗存在吸收差、病灶区药物浓度低等缺陷而疗效欠佳，因此寻找新的药物靶点和非手术治疗方法，对于防治包虫病具有重要的意义。

胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401具有抗肿瘤的药效，尚未见报道其可应用于治疗非肿瘤的疾病；作为受体型蛋白酪氨酸激酶家族的一员,胰岛素生长因子1受体(IGF-IR)抑制剂可以用作抗肿瘤细胞生长的抑制剂。近年来，以IGF-IR为靶点的小分子激酶抑制剂已被多家国际知名药厂关注，并进入临床I-Ⅲ期实验阶段。

目前胰岛素生长因子1受体(IGF-IR)抑制剂大致分为苯并咪唑类、吡咯并嘧啶类、吡咯-5-甲醛类、吡啶并嘧啶类、咪哇并吡嗪类、天然来源小分子抑制剂和二芳基脲等七类化合物。以上抑制剂均能够阻断PI3K/Akt信号通路，抑制肿瘤细胞扩散，减小肿瘤组织体积的作用，对前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等类型肿瘤均具有较好的疗效。

 PQ401属于二芳基脲类化合物，该类化合物通过抑制IGF-IR的活性的同时降低了半胱天冬酶凋亡途径的活化通路中的磷酸化过程从而介导的细胞凋亡。动物实验表明该药物对于乳腺癌、头颈癌、非小细胞肺癌等肿瘤的生长具有较好的治疗作用，且毒性较低。目前，胰岛素样受体抑制剂仅用于肿瘤的治疗研究，在寄生虫领域尚未见报道。

包虫病药物研发进展

目前治疗包虫病的首选药物为苯并咪唑类药物,其代表药物有甲苯咪唑和阿苯达唑。多年临床使用及动物体内和体外培养实验均证明该类药物对包虫病有效。甲苯达唑和阿苯达唑是WHO推荐治疗棘球蚴病仅有的两种药物。苯并咪唑类药物(包括甲苯达唑和阿苯达唑)能选择性地与线虫和绦虫细胞质内的微管蛋白相结合，影响微管的形成，导致细胞质内的微管消失，阻断分泌泡的转运，影响营养物质的输送、消化和吸收，抑制虫体摄取葡萄糖，使虫体生发成细胞糖原耗竭，内质网小体变性，溶酶体增加，最终导致虫体死亡。但由于其存在肠道吸收差，血药、肝药浓度较低，化疗效果仍不令人满意；在化疗后随访一年仅有30%的患者被治愈, 30%至50%改善，其余无效，并且疗效也很不稳定, 存在个体差异性。甚至有的学者指出：对于泡球蚴病的大多数病例，阿苯达唑的效用主在抑虫( parasitistatic)而非杀虫( parasiticidal activity )。另外，动物实验和临床病例报告均表明，长期服用阿苯达唑药物，会导致细粒棘球蚴虫产生耐药性。因此，包虫病新药的研发是具有极其重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401作为制备治疗囊型包虫病药物的应用，是一种高效的抗包虫病药物分子，能够破坏细粒棘球蚴囊泡组织结构，导致囊泡细粒棘球蚴囊泡细胞大量坏死；与临床常用的阿苯达唑药效相当。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401作为制备治疗囊型包虫病药物的应用。

本发明胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401是一种新型的抗包虫病药物；体内和体外两方面的药效学实验数据，均表明PQ401是一种高效的抗包虫病药物分子，能够破坏细粒棘球蚴囊泡组织结构，导致囊泡细粒棘球蚴囊泡细胞大量坏死；体内药效学实验数据表明该药物与临床常用的阿苯达唑治疗囊型包虫病的药效相当；鉴于临床包虫病患者长期服用阿苯达唑会导致耐药性，因此该药物可作为阿苯达唑的替代品进行治疗包虫病。

附图说明

附图1为细粒棘球蚴囊泡经PQ401体外干预的存活率图。

附图2为阴性组对细粒棘球蚴囊泡的电镜图。

附图3为DMSO组对细粒棘球蚴囊泡的电镜图。

附图4为PQ401干预组1对细粒棘球蚴囊泡的电镜图。

附图5为PQ401干预组2对细粒棘球蚴囊泡的电镜图。

附图6为PQ401干预组3对细粒棘球蚴囊泡的电镜图。

附图7为PQ401干预组4对细粒棘球蚴囊泡的电镜图。

附图8为PQ401干预组5对细粒棘球蚴囊泡的电镜图。

附图9为囊湿重统计分析图。

附图10为细粒棘球蚴囊泡个数统计分析图。

附图11为PQ401高剂量组对细粒棘球蚴囊泡的透射电镜图。

附图12为PQ401低剂量组对细粒棘球蚴囊的泡透射电镜。

附图13为阳性药物组对细粒棘球蚴囊泡的透射电镜图。

附图14为模型组对细粒棘球蚴囊泡的透射电镜图。

附图15为溶剂组对细粒棘球蚴囊泡的透射电镜图。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。

实施例1，该胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401作为制备治疗囊型包虫病药物的应用。

该胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401作为制备治疗囊型包虫病药物的应用，其应用试验如下：

一. 胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401体外实验（胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401简称PQ401）

1.1 PQ401体外实验

1.1.1实验目的：探索实验周期为2天的各浓度下PQ401体外干预细粒棘球蚴囊泡死亡率。

 1.1.2实验分组（概况）：

本次实验共分7组，分别为PQ401干预组1、PQ401干预组2、PQ401干预组3、PQ401干预组4、PQ401干预组5、阴性组和DMSO组；每组做3个副孔；实验周期共设置2天。

 1.1.3母液配置

称取2mgPQ401溶于200ulDMSO中得到10mg/ml的母液①；将母液①用DMSO稀释4倍后得到2.5 mg/ml的母液②；将母液②用DMSO稀释2倍后得到1.25mg/ml的母液③；将母液③用DMSO稀释2倍后得到0.625 mg/ml的母液④；将母液④用DMSO稀释2倍后得到0.3125mg/ml的母液⑤；将母液⑤用DMSO稀释2倍后得到0.15625mg/ml的母液⑥。

 1.1.4细粒棘球蚴培养液的配置

将胎牛血清和双抗加入到RPMI1640培养基中混匀后得到细粒棘球蚴培养液，胎牛血清在细粒棘球蚴培养液的体积百分比为10%，双抗在细粒棘球蚴培养液的体积百分比为1%。

 1.1.5细粒棘球蚴囊泡的制备

从新疆乌鲁木齐市屠宰场新鲜采集自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏。在无菌条件下，采集原头蚴，并用含有青链霉素的无菌PBS液（pH7.3）洗3次，加入1％pepsin（pH 2.0），37℃消化30 min，期间每隔5 min，轻摇、翻转试管，使原头蚴从育囊中散出，同时用无菌PBS液漂洗3次。取活力大于95%的原头蚴，于细粒棘球蚴培养液中培养2个月至3个月后形成直径为2mm至3 mm的细粒棘球蚴囊泡。培养条件为37℃、5％CO2的细胞培养箱，每隔5天更换细粒棘球蚴培养液1次。

 1.1.6 PQ401干预组1、PQ401干预组2、PQ401干预组3、PQ401干预组4、PQ401干预组5、阴性组和DMSO组的配置

在990μl的细粒棘球蚴培养液中加入10μl的母液②混匀后得到PQ401干预组1；在990μl的细粒棘球蚴培养液中加入10μl的母液③混匀后得到PQ401干预组2；在990μl的细粒棘球蚴培养液中加入10μl的母液④混匀后得到PQ401干预组3；在990μl的细粒棘球蚴培养液中加入10μl的母液⑤混匀后得到PQ401干预组4；在990μl的细粒棘球蚴培养液中加入10μl的母液⑥混匀后得到PQ401干预组5；取1000μL细粒棘球蚴培养液得到阴性组；在990μl的细粒棘球蚴培养液中加入10μl的DMSO混匀后得到DMSO组。

 1.1.7实验步骤

将直径为2 mm 至3 mm的细粒棘球蚴囊泡分别加入24孔培养板上，每个孔中15个至20个细粒棘球蚴囊泡，然后在装有细粒棘球蚴囊泡的24孔培养板上分别加入PQ401干预组1（25 μg/ml PQ401）、PQ401干预组2 （12.5 μg/ml PQ401）、PQ401干预组3 （6.25 μg/ml PQ401）、PQ401干预组4（3.125 μg/ml PQ401）、PQ401干预组5（1.5625 μg/ml PQ401）、阴性组（NC）和DMSO组（DMSO）进行培养，每个实验组3个复孔，为该次实验做好孔板基础(设计第0天是为了方便换液和计数的时间而言)。不算第0天，该次实验周期为2天，第2天进行孔内照相实验观察，然后用透射电镜观察囊泡微观结构；第2天后细粒棘球蚴囊泡经PQ401体外干预的存活率图见图1所示；第2天后阴性组对细粒棘球蚴囊泡的电镜图见图2；第2天后DMSO组对细粒棘球蚴囊泡的电镜图见图3；第2天后PQ401干预组1对细粒棘球蚴囊泡的电镜图见图4；第2天后PQ401干预组2对细粒棘球蚴囊泡的电镜图见图5；第2天后PQ401干预组3对细粒棘球蚴囊泡的电镜图见图6；第2天后PQ401干预组4对细粒棘球蚴囊泡的电镜图见图7；第2天后PQ401干预组5对细粒棘球蚴囊泡的电镜图见图8。

通过图1至图8可以看出体外干预2天后， PQ401干预组1和PQ401干预组2 中的细粒棘球绦虫囊泡全部死亡，电镜结果显示细粒棘球蚴囊泡的细胞膜被破坏，结构不完整，皮层细胞坏死，细胞核肿胀，核基质密度极低，线粒体肿胀，内质网高度扩张，微毛结构几乎没有，合胞体带结构也不完整；说明在体外实验条件下，低浓度的PQ401在短时间内（2天）即对细粒棘球蚴囊泡具有较高的毒性作用，提示PQ401是一种细粒棘球蚴虫的体外杀虫剂。

二. 胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401体内实验（胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401简称PQ401）

1. PQ401小鼠急性毒性实验

1.1 实验目的：获得腹腔注射给药方式不同剂量PQ401对昆明白小鼠的急性毒性数据。

 1.2实验内容：

为了摸索PQ401治疗囊型包虫病小鼠动物模型的药物剂量，设计PQ401小鼠急性毒性实验。该实验最低剂量采用1000 mg/kg，并根据存活率数据依次递增PQ401的剂量。每个剂量选择2只昆明白小鼠，观察周期为7天至14天，PQ401小鼠急性毒性实验数据见表1所示；初步推测4000mg/Kg为安全剂量，遂采用10只昆明白小鼠重复该剂量的急性毒性实验，仅1只昆明白小鼠死亡。说明4000mg/kg是PQ401的安全剂量，按照该剂量计算药效学实验中PQ401的药物高剂量组为100mg/kg，低剂量组为50mg/kg。

 2. PQ401小鼠药效学实验

2.1实验目的：获得腹腔注射给药方式不同剂量PQ401对囊型包虫病小鼠动物模型的药效学数据。

 2.2实验内容

2.2.1 包虫病小鼠动物模型建立：

（1）无菌条件下挑选直径为2mm-至3mm的大小均一的细粒棘球蚴囊泡，腹腔注射接种于小鼠体内。

昆明白小鼠，6周龄至8周龄，体重20g 至25g。注意操作要稳，否则损伤较大；推注细粒棘球蚴囊泡时，一定要确保没有空气进入。

（2）造模时间：囊型包虫病小鼠动物模型成模周期为3个月。

（3）造模成功的判定标准：感染89天时，通过腹部B超检查囊型包虫病小鼠动物模型，腹部中存在直径超过0.5cm的细粒棘球蚴囊泡的昆明白小鼠，为造模成功的囊型包虫病小鼠动物模型。

②小鼠模型：腹腔注射分为溶剂组、模型组、阳性药物组（ABZ组即阿苯达唑组）、治疗组（PQ401高剂量组、PQ401低剂量组），共5组，每组10只，按造模成功率计算造模100只。

 2.2.2包虫病小鼠动物模型药物干预：

（1）选择造模成功的小鼠囊型包虫病动物模型，进入药效学实验。

（2）实验分组为PQ401高剂量组、PQ401低剂量组、阳性药物组（ABZ组即阿苯达唑组）、模型组（简称M组）和溶剂组（简称R组），PQ401高剂量组给药剂量为100 mg/kg、PQ401低剂量组给药剂量为50 mg/kg、阳性药物组给药阿苯达唑，给药剂量为50mg/kg，模型组为注射生理盐水，溶剂组为注射8%吐温80+8%乙醇的溶剂，给药剂量为20ml/kg，每组10只小鼠囊型包虫病动物模型，腹腔注射每周3次，给药3周。（2）50只小鼠囊型包虫病动物模型应用“PEMS 3.1 for Windows”，软件随机分组，编号，挂牌，称重，记录，染色标记每组1,2,3,4,5号。

（3）按照试验计划配制各浓度的药物：（同一组按同浓度不同药量给予）

溶剂（8%吐温80+8%乙醇）的配置：

精密称取24g吐温80（药用级）,用PBS定容至150ml，用涡旋器摇匀，即得16%吐温150ml，用0.22微米过滤膜过滤除菌2次。精密量取32ml 75%乙醇，用PBS定容至150ml，得16%的乙醇150ml，用0.22微米过滤膜过滤除菌2次。分别取取过滤除菌后的16%吐温80和16%乙醇同体积混合，即得所需的浓度溶剂300ml备用。

 PQ401高剂量组：精密称取105mgPQ401，置于已灭菌的研钵中，加入21ml已配置好的上述溶剂（8%乙醇+8%吐温80）充分研磨并且混匀，即为100mg/kg(5mg/ml)剂量。

 PQ401低剂量组：

精密称取54mgPQ401，置于已灭菌的研钵中，加入21.6ml已配置好的上述溶剂（8%乙醇+8%吐温80）充分研磨并且混匀，即为50mg/kg(2.5mg/ml)剂量。

阳性药物组：

精密称取57mg ABZ，置于已灭菌的研钵中，加入22.8ml已配置好的上述溶剂（8%乙醇+8%吐温80）充分研磨并且混匀，即为50mg/kg(2.5mg/ml)剂量。

模型组：生理盐水。

溶剂组：溶剂（8%吐温80+8%乙醇）。

上述5组配好的药液，拧紧并用封口膜密封好，置于液氮低温灭菌（20min），瞬间冻结成固体,然后置于37℃的恒温水浴箱中融化，如此反复操作3次，以此来进行灭菌；灭菌完成后置于4℃冰箱保存，为实验备用。

（4）腹腔注射给药3周后处死囊型包虫病小鼠动物模型，分别收集每只小鼠的细粒棘球蚴囊泡称取重量和记录细粒棘球蚴囊泡的个数，统计分析各实验组的囊湿重和细粒棘球蚴囊泡个数，囊湿重统计分析图见图9所示，细粒棘球蚴囊泡个数统计分析图见图10所示，各实验组随机选择2只小鼠的细粒棘球蚴囊泡用于透射电镜，观察微观结构。PQ401高剂量组对细粒棘球蚴囊泡的电镜图见图11，PQ401低剂量组对细粒棘球蚴囊泡的电镜图见图12，阳性药物组对细粒棘球蚴囊泡的电镜图见图13，模型组对细粒棘球蚴囊泡的电镜图见图14，溶剂组对细粒棘球蚴囊泡的电镜图见图15。

通过图9至图10可以看出，PQ401高剂量组和阳性药物组的囊湿重和细粒棘球蚴囊泡个数均显著降低，PQ401高剂量组和阳性药物组具有相当的治疗囊型包虫病的药效。通过图11至图15可以看出，PQ401高剂量组和阳性药物组的细粒棘球蚴囊泡超微结构变化显著，细粒棘球蚴囊泡细胞大量坏死，PQ401所导致的细粒棘球蚴囊泡组织坏死程度较阳性药物组的细粒棘球蚴囊泡坏死程度高。PQ401高剂量组细粒棘球蚴囊泡，角质层变薄或消失，微毛凌乱稀少不规整；皮层区也变薄，同时出现大量透明空泡，溶酶体增多。生发层细胞或解离或消失或变性坏死（细胞膜破裂），结构模糊不清，核仁或散开或消失，偶可见凋亡的裸核细胞。阳性药物组细粒棘球蚴囊泡，角质层疏松裂隙，皮层区变薄，微毛稀少，生发层中细胞间隙变大，皮层细胞数量少而且变性，核仁散开或消失，核异染色质增多，并且边集；另外，皮层区肌纤维细胞束散乱，纹理不清晰。PQ401低剂量组细粒棘球蚴囊泡超微结构出现一定的变化部分细胞死亡，角质层结构变薄，微毛稀少不规整排列；生发层变薄，皮层区内容物极少，出现透明的髓样小体或空泡，溶酶体增多，肌纤维束散乱分布偶可见破损变性的皮层细胞，核形不规整，核仁或消失或其电子云密度降低，呈现灰白色；核异染色质增多，且边集，溶酶体增多。模型组和溶剂组的细粒棘球蚴囊泡结构正常，细胞活性较高；角质层与生发层质地均匀，结构清晰可辨，皮层区有许多致密大小较均一的透亮小泡，其表面微毛致密丰富，排列整齐；皮层区的生发层细胞规整，核结构致密，核大且圆，核仁结构清晰异染色质较少成团聚；另外，皮层区肌纤维细胞结构清晰可辨。说明通过包虫病小鼠动物模型药物干预实验，表明PQ401腹腔注射方式给药能够治疗小鼠囊型包虫病，其治疗效果与阿苯达唑的治疗效果相当。

综上所述，本发明胰岛素类生长因子受体抑制剂PQ401是一种新型的抗包虫病药物；体内和体外两方面的药效学实验数据，均表明PQ401是一种高效的抗包虫病药物分子，能够破坏细粒棘球蚴囊泡组织结构，导致囊泡细粒棘球蚴囊泡细胞大量坏死；体内药效学实验数据表明该药物与临床常用的阿苯达唑治疗囊型包虫病的药效相当；鉴于临床包虫病患者长期服用阿苯达唑会导致耐药性，因此该药物可作为阿苯达唑的替代品进行治疗包虫病。

表1 PQ401小鼠急性毒性实验数据

给药剂量（mg/kg）给药体积数（ml）动物数死亡只数10000.62020000.62150000.62140000.6204000（重复）0.6101