用于使用微生物产生生物柴油而无需干燥过程的方法

摘要

本发明涉及用于在主要含有醇的环境中产生生物柴油而无需干燥过程和脂质组分提取过程的方法。本发明提供了用于产生生物柴油的方法，其中所述方法可以建立酯交换的最佳条件，从而以有效方式产生生物柴油，甚至无需催化剂，由此减少过程数目、生产成本和时间，同时提高生物柴油的产率。

说明书

技术领域

本发明涉及产生生物柴油的方法，其中在湿润微生物(包括微藻和产 油微生物)中，在环境条件下同时进行脂质组分的提取和酯交换 (trasesterification)反应而无需干燥和脂质提取步骤。

背景技术

生物柴油是脂肪酸甲酯(fatty acid methyl ester，FAME)，其是从植 物油、微藻和产油微生物等作为原料制备的非污染燃料，并且具有95％ 或更高的纯度。因为其物理性质与柴油类似，所以生物柴油可用作柴油交 通工具的添加剂或作为一般交通工具的燃料。

生物柴油具有减少由使用现有化石能源导致之空气污染和温室气体 的环境改进作用。此外，生物柴油从可重复使用的生物质产生，并且因此 避免了潜在的问题(例如能源的耗尽)。在生物柴油的情况下，二氧化碳 (其导致全球变暖)的净排放非常少，这是因为二氧化碳在生物质的产生 期间被除去。此外，由于高的氧含量(至少10％的氧)，所以生物柴油具 有高的完全燃烧比例，能够减少致癌微粒物，并且在泄漏的情况下因其低 毒性和高可生物降解性而产生较少的环境污染。

虽然根据物种存在差异，但是微藻在解剖学上可分为含有高纤维量的 细胞壁和含有多种物质的细胞质。然而，一些物种的脂质非常适合用于制 备生物燃料，因为它们与植物油极为相似。 微藻的生物质含有80％或更少的脂质、20％至40％的碳水化合物、30％ 至70％的蛋白质，并且一些物种还具有多至80％干重的脂质含量(参见 KSBB journal2010，25：109-115)。

微藻纤维主要是纤维素并且与基于植物的纤维素纤维相比具有相对 均一的直径。因此，微藻纤维可以避免由一种纤维中纤维素之非均一尺寸 引起的复合材料物理性质的改变所导致的缺点，其为植物纤维的一个已知 的难题。以实验室规模从微藻产生生物柴油、生物乙醇、生物丁醇、有机 酸等的一般方法如下。在首先培养微藻之后，为了纯化生物柴油、生物乙 醇和有机酸，通过离心、过滤和干燥步骤除去微藻中的大部分水分，其后 使用对脂质具有高选择性的溶剂来提取脂质，然后将提取的脂质转化为生 物柴油。或者，使用合适的酶和微生物来使微藻发酵，从而产生生物乙醇 或有机酸(例如，乳酸)。

在常规的生物柴油产生过程中，收获经培养的微藻以通过干燥步骤获 得微藻粉末，使用溶剂从干燥粉末中提取脂质，并对提取的脂质进行碱催 化剂或酸催化剂辅助的酯交换来产生FAME(脂肪酸甲酯)。由于现有的 生物柴油转化过程包括收获微藻后的干燥和脂质提取步骤，所以所述过程 复杂且昂贵。

除了微藻，还存在以商业规模从植物油或动物油产生生物柴油的方 法。所述方法(其是广泛已知的)包括向加热的脂质组分添加甲醇盐 (methoxide)并允许它们反应约20至60分钟以获得FAME。所述方法 还需要至少两步反应来获得FAME，这是因为脂质组分必须从植物或动物 中分离。

本发明人已经开发了省去干燥和脂质提取步骤并且在室温和常压下 仍提高生物柴油之产生的方法。另外，本发明人已经开发了产生生物柴油 的方法，其中酯交换可无需催化剂而有效地进行，从而简化了生物柴油产 生过程并且显著降低了成本。

发明概述

本发明涉及提供产生生物柴油的方法。

本发明还涉及提供无需催化剂而产生的生物柴油。

本发明的一个方面提供了产生生物柴油的方法，其包括：

1)培养微生物并离心培养物以获得沉淀(pellet)；

2)将步骤1)的所述沉淀添加至烷基醇并进行酯交换反应；以及

3)从步骤2)的反应产物提取脂肪酸甲酯(FAME)。

步骤1)的微生物可以是选自以下的至少一种：微藻、酵母、细菌和 真菌。

步骤1)的沉淀可以具有80重量％至98重量％的含水量。

可以以10至10000mL/1g所述沉淀干重的量添加步骤2)的烷基醇。

所述方法还可包括在将步骤2)的沉淀添加至烷基醇中后将沉淀与烷 基醇混合并将沉淀分散在烷基醇中。

所述烷基醇可以是甲醇或乙醇。

所述方法还可包括在步骤2)的酯交换反应期间向沉淀添加催化剂。

所述催化剂可以是固体催化剂。

所述固体催化剂可以是碱催化剂、金属氧化物、合金催化剂或上述材 料的混合物。

所述碱催化剂可以是选自以下的至少一种：氢氧化钠、氢氧化钾、氢 氧化钙、氢氧化镁、氢氧化铝、氢氧化钡、氢氧化铁、氢氧化锂、氢氧化 锌、氢氧化镍、氢氧化锡、氢氧化钴、氢氧化铬、氢氧化铵、氢氧化锆、 氢氧化钛、氢氧化钽、氢氧化铪、氢氧化铌和氢氧化钒，但不限于此。

所述金属氧化物可以是选自以下的至少一种：氧化钙、氧化镁、氧化 锶、氧化钡、氧化铁(II，III)、氧化铝、氧化铜、氧化钠、二氧化硅、 氧化钛、氧化锡、氧化锌、氧化锆、氧化铈、氧化锂、氧化银、氧化锑， 但不限于此。

所述合金催化剂可以是在基于甲醇的燃料电池中使用的催化剂，但不 限于此。

可以以0.01至10g/1g所述沉淀干重的量添加所述催化剂，但量不限 于此。

步骤2)的所述酯交换反应可以在3至85℃以及50至350rpm下进 行，并且封闭反应体系的压力可以是0.5至1.5巴(bar)，但温度和压力 不限于此。

所述方法还可包括在步骤2)的酯交换反应后使用电磁体回收磁性金 属氧化物、对所述磁性金属氧化物进行热处理以及连续地重复利用再循环 的金属催化剂。

本发明的另一个方面提供了通过根据本发明的生物柴油产生方法所 产生之生物柴油的用途。

通过本发明可有效地产生植醇。

附图说明

通过参考附图详细描述本发明示例性实施方案，本发明的以上和其他 目的、特征和优点对本领域的普通技术人员将变得更加明显，其中：

图1是示出手工制作之反应器的照片。

图2A是示出根据生物质状态、催化剂的量以及催化剂状态所产生之 脂肪酸甲酯(FAME)的量(mg/g)的图；

图2B是示出根据生物质状态、催化剂的量和催化剂状态所产生之 FAME的量(％DCW)的图；

图3A是示出根据催化剂类型所产生之FAME的量(mg/g)的图；

图3B是示出根据催化剂类型所产生之FAME的量(％DCW)的图；

图4A是示出根据催化剂的量和生物质的量所产生之FAME的量的 图，其通过响应面方法(response surface methodology，RSM)分析影响 酯交换反应的最优条件；

图4B是示出根据催化剂的量和温度所产生之FAME的量的图，其通 过RSM分析影响酯交换反应的最优条件；

图4C是示出根据生物质-催化剂比值和温度所产生之FAME的量的 图，其通过RSM分析影响酯交换反应的最优条件；

图4D是示出根据生物质的量和温度所产生之FAME的量的图，其通 过RSM分析影响酯交换反应的最优条件；

图4E是示出根据生物质-催化剂比值和产生之FAME量的皂化系数 的图，其通过RSM分析影响酯交换反应的最优条件；

图5是示出根据催化剂的量的产生之FAME和生物柴油组分的量的 图；以及

图6是示出在通过RSM推导的最优反应条件下通过使用酵母生物质 产生之FAME的图。

示例性实施方案的详细描述

本说明书中使用的术语“生物质(biomass)”指作为能源使用的生物 体。

本说明书中使用的术语“脂肪酸甲酯(FAME)”指生物柴油的主要 组分并且可以与生物柴油互换使用。

本说明书中使用的术语“湿润生物质(wet biomass)”指培养微生物 后仅通过离心未经干燥步骤产生的沉淀。

本说明书中使用的术语“干燥生物质(dry biomass)”指培养微生物 后通过干燥步骤从其中除去水分的沉淀。

本说明书中使用的术语“酯交换”指将微生物的脂质转化为FAME 的反应。

提供了用于产生生物柴油的方法，其包括：

1)培养微生物并离心培养物以获得沉淀；

2)向步骤1)的所述沉淀添加烷基醇并进行酯交换反应；以及

3)从步骤2)的反应产物提取FAME。

所述微生物可以是光合微生物或产油微生物(oleaginous  microorganism)。另外，具有不同脂质组分或FAME谱的藻类、酵母、 细菌和真菌可以用作用于FAME产生的原料，并且因此在多种活体中的 脂质组分可以有效地转化为生物柴油。

藻类优选选自微藻，酵母优选选自耶氏酵母(Yarrowia)，并且真菌 优选选自出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)，但这些并不是限制。

步骤1)的沉淀优选具有80重量％至98重量％的含水量，但不限于 此。

所述离心优选在3000至5000rpm下进行1分钟至10分钟，但不限 于此。

优选以10至10000mL/1g沉淀(湿润生物质)干重的量添加步骤2) 的烷基醇，但量不限于此。湿润生物质的干重是湿润生物质换算成细胞干 重(dry cell weight，DCW)的值。

所述烷基醇优选为甲醇和乙醇，并且更优选甲醇，但不限于此。

所述烷基醇使用固体催化剂反应以形成强碱(例如甲醇盐或乙醇盐)， 从而诱导酯交换(亲核取代的一种形式)。因此，当能够极好地除去醇中 质子的固体催化剂在富含醇的条件下与微生物原位反应时，可以在高温下 提取脂质组分并且通过由与所述固体催化剂反应形成之强碱进行酯交换。

优选地将步骤2)的沉淀添加至烷基醇中，随后进行混合和分散，但 这并不是限制。

所述方法还可包括在步骤2)的酯交换反应期间向沉淀添加催化剂。

所述催化剂优选固体催化剂，但不限于此。

可以从另一些脂质化合物(例如磷脂、半乳糖脂)的酯交换得到比中 性脂质更高的FAME产率。已经报道在过量甲醇中进行的一些酯交换方 法因前述细胞脂质的酯交换而经常显示出比常规酯交换过程更高的 FAME产率。

当烷基醇的量显著高于生物质或脂质的量时，与酯交换竞争的皂化被 抑制并且可以因富含烷基醇的条件而被最小化。

催化剂优选为碱催化剂、金属氧化物或合金催化剂，但不限于此。

所述碱催化剂优选为选自以下的至少一种：氢氧化钠、氢氧化钾、氢 氧化钙、氢氧化镁、氢氧化铝、氢氧化钡、氢氧化铁、氢氧化锂、氢氧化 锌、氢氧化镍、氢氧化锡、氢氧化钴、氢氧化铬、氢氧化铵、氢氧化锆、 氢氧化钛、氢氧化钽、氢氧化铪、氢氧化铌和氢氧化钒，但不限于此。

所述金属氧化物优选为选自以下的至少一种：氧化钙、氧化镁、氧化 锶、氧化钡、氧化铁(II，III)、氧化铝、氧化铜、氧化钠、二氧化硅、 氧化钛、氧化锡、氧化锌、氧化锆、氧化铈、氧化锂、氧化银和氧化锑。

所述合金催化剂优选为在基于甲醇的燃料电池中使用的催化剂，但不 限于此。

优选以0.01至10g/1g沉淀干重的量添加所述催化剂，但量不限于此。

步骤2)的酯交换反应优选地在4至60℃以及50至350rpm下进行， 但温度和压力不限于此。

当添加磁性金属氧化物作为催化剂时，根据本发明的产生生物柴油的 方法还可以包括在酯交换反应后使用电磁体回收金属催化剂，对所述催化 剂进行热处理以及连续地重复利用再循环的金属催化剂。磁性金属氧化物 可以是氧化铁(Fe₂O₃)、Nb-Ti合金等，但不限于此。

步骤3)的FAME提取可以包括通过相关领域中已知的各种提取方 法提取FAME，优选使用有机溶剂，分离FAME溶剂，并且使用有机溶 剂过滤器过滤所述FAME，但这些并不是限制。

另外，本发明提供了通过所述方法产生之生物柴油的用途。

下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。这些实施例不应当被曲 解为限制本发明的范围。提供实施例以向本领域普通技术人员充分描述本 发明。

实施例

<实施例1>不经干燥和脂质提取步骤而产生生物柴油的方法

<1-1>微藻培养

为了制备用作生物柴油的FAME，将微藻小球藻(Chlorella vulgaris) AG10032(由Biological Resource Center(BRC)，Korea提供)在7L发酵 罐中的BG11培养基(参见Rippka，R.，DeReuelles，J.，Waterbury，J.B.， Herdman，M.&Stanier，R.Y.(1979).Generic assignments，strain  histories and properties of pure cultures of cyanobacteria.J Gen  Microbiol111，1-61)中培养14天，所述发酵罐以0.1v/v/m的速率补充 空气并通过光以120μmol m^-2s^-1照射。测量培养微藻的细胞干重。使用 50mL锥形管在25℃下将50mL培养微藻以4000rpm离心5分钟，然 后除去上清以获得沉淀(具有干重为约0.1g的湿润生物质)。

<1-2>酯交换反应

将在实施例<1-1>中获得的0.1g沉淀(即湿润生物质，DCW基准) 不经干燥和脂质提取步骤而添加至500mL手工制作双夹套反应器(图1)， 并且随后在表1描述的条件下向其添加100mL甲醇和催化剂(NaOH， 由Sigma Corporation制造)。随后将所述混合物在室温(25℃)下反应 60分钟，同时以300rpm搅拌。在手工制作双夹套反应器的盖上提供冷 凝器以循环水，因此使由内部和外部加热导致的反应液体损失最小化。

此外，作为湿润生物质的对照，将在实施例<1-1>中获得的沉淀冷冻 干燥以完全除去水分(即，干燥步骤)，以获得干燥状态的生物质，将0.1 g干燥生物质添加至500mL双夹套反应器中，之后在表1中描述的条件 下向其添加100mL甲醇和催化剂。

表1

*湿润：82至85重量％的含水量

<1-3>FAME的分析

实施例<1-2>的酯交换反应后，将25mL的反应液体转移到锥形管中， 向其中添加10mL提取溶剂，其中己烷和叔丁基甲基醚以体积比1∶1混合， 然后从反应液体中提取FAME。向提取的FAME中进一步添加5mL4N 氢氧化钠溶液以诱导FAME溶剂层的分离。从分离的上清取出1mL，使 用聚四氟乙烯(PTFE)有机溶剂过滤器过滤FAME溶剂层，然后转移到 GC小瓶中，之后向其中添加50μl的C17内标材料(由Fluka Chemical  Corp.制造)以制备用于FAME含量分析的测定样品。通过气相色谱 (Shimadzu GC-2010，Japan)分析FAME(或生物柴油)并且使用Rt-wax 柱(最大温度：250℃)和火焰电离检测器(FID，最大温度：300℃)检 测。将1μl的各个样品注射到GC。检测时间设定为30分钟。使用FAME 混合18918(c8-c24，Supelco，Inc)作为GC分析中峰鉴别的标准物质。 通过与从标准物质获得的峰的保留时间比较来鉴别样品的各个峰，并且之 后进行定量。

结果，根据表1之反应条件(生物质状态(干燥、湿润)、催化剂类 型(固体、溶液)以及反应温度)的生物柴油的量显示出使用干燥生物质 获得的FAME产率为30mg/g(DCW)或更低，这在所有反应条件中是 最低的，并且是使用湿润生物质获得之生物柴油的最高量(在0.1g固体 丸型NaOH的条件中检测到180mg/g)的约1/6(图2)。这被认为是因 为干燥生物质颗粒聚集在一起使得阻止甲醇渗透入细胞，并且因此细胞中 脂质组分的提取效率显著降低，脂质组分与反应催化剂(通过甲醇与氢氧 化钠的键合产生的甲醇钠)的反应速率降低，因此所产生的生物柴油的量 降低。

此外，当使用液相的氢氧化钠时，产生的生物柴油的量平均为79mg/g (DCW)。当使用固相催化剂时，产生的生物柴油的量平均为146mg/g (DCW)。因此，使用液相催化剂获得之生物柴油的量约为使用固相催化 剂获得之生物柴油的量的一半，因此固体催化剂具有更高的效率。当使用 0.1g固相催化剂时，所产生的生物柴油的量是最高的(图2)。

此外，当催化剂的量高于预先确定的水平(0.1g)时，发现产生的 FAME的量降低。

<1-4>根据固体催化剂类型产生之生物柴油的量的比较

对根据固体催化剂类型产生之生物柴油的量进行比较。

具体地，将在实施例<1-1>中获得的0.1g沉淀(即，湿润生物质)添 加至500mL手工制作双夹套反应器中，然后根据NaOH的类型和摩尔比 (0.5g生物质/0.2g NaOH)在表2中描述的条件下向其中添加100mL 甲醇和金属氧化物(CaO、MgO、SrO和Fe₂O₃；由Sigma Corporation制 造)。随后，在室温下使混合物进行酯交换1小时，然后以类似于实施例 <1-3>的方式提取生物柴油，以测量产生的生物柴油的量。

结果，当使用氢氧化钠或氧化钙作为固体催化剂时，生物柴油的量是 最高的(即140mg/g(DCW)或更高)。当使用氧化镁、氧化锶或氧化铁 时，所述量为100mg/g(DCW)或更低，并且效率低(图3)。

表2

供参考，在实施例<1-3>和实施例<1-4>中使用的样品培养不同的时间 长度。因此，虽然其脂质含量可以根据培养生物质的不同状态而不同，并 且因此转化的生物柴油的量也可以不同，但是在转化效率上没有差异。

<实施例2>用于优化酯交换的RSM(响应面方法)分析

将沉淀添加至预定量的甲醇中，搅拌下分散均匀，然后使用Minitab 14进行RSM以根据催化剂的量获得原位酯交换效率(G.Vicente等： Industrial Crops and Products8(1998)29_35)(图4)。

结果，可以根据催化剂的量、生物质的量和反应温度来估计FAME 的量。另外，发现在4℃至70℃的温度范围中产生的生物柴油的量不存 在显著差异，因此所述反应可以在室温(即25℃)下高效地进行。此外， 发现生物质之量的增加对所产生的FAME的量没有显著的作用(图4B和 4D)。然而，生物柴油的量示出关于催化剂之量的模式，其中随着催化剂 的量减少，FAME的产率升高。为了鉴别最佳催化条件，在RSM中使用 模型的回归分析尝试中发现所述模型不适用于鉴别酯交换的最优条件。发 现用于产生生物柴油的最佳条件位于实施RSM之条件的范围之外。可以 从这两个结果推断原位酯交换可以无需催化剂而进行。

<实施例3>通过RSM分析根据催化剂的量来鉴别酯交换

通过RSM使用分散在甲醇中的生物质测量根据催化剂量的原位酯交 换效率。

具体地，将在实施例<1-1>中获得的0.1g沉淀(湿润生物质)添加至 100mL甲醇中并在搅拌下分散1小时。将均匀分散在甲醇中的生物质添 加至500mL双夹套反应器中，分别向其中添加0.00g、0.01g、0.02g、 0.05g、0.10g、0.20g、0.50g、1.00g、2.00g和3.00g的NaOH作为催 化剂并在25℃(室温)、300rpm搅拌下进行酯交换。此外，在酯交换之 后鉴别产生的FAME的类型和量。

结果，与RSM分析结果相似，催化剂的量和产生FAME的量彼此成 反比。当催化剂的量为0.20g或更低时，产生相似量的FAME。特别地， 当催化剂的量为0g(即，无催化剂)时，发现以高效率产生FAME(图 5)。

供参考，在实施例<1-2>中，使湿润生物质、甲醇和催化剂混合并反 应，并且不进行沉淀(湿润生物质)在甲醇中的分散。在实施例<3-1>中， 将沉淀均匀地分散在甲醇中，随后进行反应。一般地，已知溶剂(例如甲 醇，同时为反应物)在生物质中的扩散是决定湿润生物质之原位酯交换中 的反应速率和效率的限速步骤。因此，当甲醇通过实施例的步骤均匀地分 散在沉淀中时，迅速并高效地产生FAME而无需催化剂。

如上所述，干燥生物质颗粒聚集在一起使得阻止甲醇渗透入细胞，因 此细胞中脂质组分的提取效率显著降低。然而，在本发明的情况下，由于 甲醇的量相对高于湿润生物质，所以甲醇可以充分渗透入细胞。此外，甲 醇分散在湿润生物质中，这有助于提取细胞中的脂质组分。

<实施例4>通过RSM分析鉴别在确定的最佳反应条件下产生的生物柴油

为了鉴别各种微生物在用于本发明产生生物柴油过程中的适用性，在 通过RSM分析获得的反应条件中使用酵母生物质进行酯交换。

具体地，将解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)(由Biological Resource  Center(BRC)，Korea提供)在120μmol m^-2s^-1的光照射下在2L瓶中的 YM培养基中培养14天，同时以0.1v/v/m的速率供应空气。测量所培养 酵母的细胞干重。使用50mL锥形管将所培养酵母培养基在4000rpm下 离心5分钟，然后除去上清以获得沉淀(82重量％至85重量％的含水量)。 使一部分沉淀(0.5g干重)进行酯交换，在300rpm下于室温(25℃) 进行60分钟。随后，通过实施例<1-3>的方法鉴别产生的生物柴油的量。

结果，0.5g的酵母生物质转化为224.82mg/g的量的所产生FAME， 其对应于每单位生物质22％或更高的转化效率(图7)。

因此，发现本发明的无需干燥和脂质提取步骤的方法可应用于微藻以 及各种微生物生物质。

工业实用性

本发明的生物柴油制造方法比现有的工序简单，即便没有催化剂也有 效地生产出生物柴油，因此可以用于生物柴油或基于生物柴油之副产物的 制造。