基因修饰的组织工程化骨及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了基因修饰的组织工程化骨及其制备方法和应用，其中，制备基因修饰的组织工程化骨的方法包括：(1)构建pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP重组慢病毒载体；(2)将步骤(1)得到的重组载体包装成重组慢病毒；(3)将步骤(2)得到的重组慢病毒感染牙周膜干细胞，获得转染重组慢病毒的牙周膜干细胞；(4)将步骤(3)获得的所述转染重组慢病毒的牙周膜干细胞同β-磷酸三钙支架材料体外复合，获得所述基因修饰的组织工程化骨。该组织工程化骨可用于治疗牙周骨缺损疾病。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种基因修饰的组织工程化骨及其 制备方法。更具体地，具体涉及一种人类骨保护素基因修饰的组织工程化骨及其 制备方法，以及该组织工程化骨在制备治疗牙周骨缺损疾病材料中的用途。

背景技术

牙周病是发生在牙齿支持组织的炎症性、破坏性疾病，以牙槽骨的吸收破坏 为主要特征。在临床治疗中通过牙周病的基础治疗、牙周手术(根面处理技术、 引导性牙周组织再生术、骨移植)和药物治疗，对消除致病因素、促使炎症减轻 有一定疗效，但难以恢复正常的牙槽嵴高度、形成新附着。

组织工程技术为牙周组织再生提供了新方法。生长因子是组织工程的重要因 素，它们能调控包括牙周来源在内的多种细胞的增殖、迁移、分化和外基质的合 成，在牙周组织再生的修复中发挥重要作用。但是传统的组织工程方法应用生长 因子时，多将生长因子局部注射或复合细胞和支架材料后植入体内，由于生长因 子多为蛋白质或多肽，在体内极易降解，生物半衰期短，容易被体液冲走或稀释， 因此难以保持局部有效治疗浓度。

基因治疗为生长因子持续、稳定表达提供了新方法。借助基因治疗的手段(如 转基因技术)，将生长因子的基因转移到牙周组织相关靶细胞内，当基因导入靶 细胞后，这些细胞便可以充当微型“生物工厂”，持续释放细胞因子，促使靶细 胞的表型向再生方向分化；并通过自分泌或旁分泌作用对细胞自身以及周围未转 染的细胞产生作用，促使整个缺损区的所有细胞活化，从而提高牙周组织再生的 成功率。

目前利用组织工程和基因治疗技术以及两者相结合促进牙周组织修复再生 已成为牙周领域的研究热点。有部分学者利用该技术在牙周病治疗、促进牙槽骨 新生方面进行了研究，通过牙周膜细胞(Periodontal ligament cell_s，牙周膜细胞) 体外培养，并将骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein，BMPs)或血小板生 长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)等促进骨形成基因转染至牙周膜 细胞，回植到牙周组织缺损处，发现有促进牙槽骨形成的作用。然而，牙周组织 是由牙骨质、牙周膜、牙槽骨与牙龈共同构成的三维结构，牙周病是细菌等各种 病原因素对这四者的共同破坏，虽然通过牙周手术，包括使用牙周组织工程方法 在提供修复用细胞、促进组织形成等方面有一定作用，但是，在病变牙周组织中 主要是各种刺激因素导致的大量破骨细胞活化，抑制了牙周组织的成骨能力，使 组织修复无法达到理想效果。因此，单一依靠促进骨形成来治疗牙周病效果未尽 人意。

骨保护素(osteoprotegerin，OPG)是近年来发现的一种能阻止破骨细胞分化、 成熟，抑制骨吸收的关键因子。骨保护素是核因子κB受体活化因子配体(receptor  activator of nuclear factorκB ligand，RANKL)的天然诱饵受体，能竞争性地与 核因子κB受体活化因子配体结合，阻断核因子κB受体活化因子(Receptor  activator of nuclear factor-κB，RANK)与核因子κB受体活化因子配体间的相互 作用，从而抑制破骨细胞的形成和活化，抑制骨吸收。研究发现，核因子κB受 体活化因子配体水平升高可以导致牙周组织的破坏；检测牙周病患者龈沟液显 示，RANKL/OPG比率比健康人群明显升高；细菌产生的毒素或是组织表达的炎 症介质也是通过影响RANKL/OPG比率而影响组织修复的。这些研究结果表明， OPG/RANKL/RANK系统在牙周骨代谢中是重要的分子调节机制之一。

牙周组织中最重要的一种细胞是牙周膜细胞，有学者研究发现牙周膜细胞可 以表达骨保护素和核因子κB受体活化因子配体，在没有受到外界刺激时骨保护 素表达较核因子κB受体活化因子配体强，不利于破骨生成，以维持牙周内环境 的稳定。揭示了牙周膜细胞是通过OPG/RANKL系统来调节牙槽骨代谢的。由 于牙周膜细胞位于牙槽骨和牙骨质之间，其分泌的骨保护素可能在抵御炎症组织 中核因子κB受体活化因子配体介导的骨吸收中发挥一定的防御功能。

近年来，国内外学者利用骨保护素防治因破骨细胞过度活化而引起的骨吸收 疾病做了大量研究，发现骨保护素可有效抑制骨质疏松性骨吸收、恶性肿瘤骨转 移破坏等骨质吸收疾病。但使用骨保护素治疗牙周骨缺损还未见报道。

发明内容

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

发明人将组织工程化骨植入兔牙周骨缺损处，以β-磷酸三钙作为生长空间， 植入的牙周膜干细胞在局部分化成成骨细胞、成牙骨质细胞和成纤维细胞，直接 参与牙周骨组织的再生；同时植入的牙周膜干细胞在体内存活、发生迁移、吞噬 及分泌细胞外基质，并吸引体内细胞至缺损区域，从而促进了牙周骨组织再生； 另外植入的牙周膜干细胞不断分泌骨保护素蛋白，通过抑制核因子κB受体活化 因子配体与破骨细胞表面的核因子κB受体活化因子结合，抑制破骨细胞活化， 抑制牙槽骨吸收，从而提高牙周骨愈合过程。

本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于 提供了一种制备基因修饰的组织工程化骨的方法。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备基因修饰的组织工程化骨的 方法。根据本发明实施例。所述复合材料由含有hOPG基因的慢病毒修饰的牙周 膜干细胞和β-磷酸三钙制备而成。根据本发明具体示例，本发明的方法包括：

(1)构建pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP重组慢病毒载体；

(2)将步骤(1)得到的重组载体包装成重组慢病毒；

(3)将步骤(2)得到的重组慢病毒感染牙周膜干细胞，获得转染重组慢病 毒的牙周膜干细胞；

(4)将步骤(3)获得的所述转染重组慢病毒的牙周膜干细胞同β-磷酸三钙 支架材料体外复合，获得所述基因修饰的组织工程化骨。

发明人惊奇地发现，发明人惊奇地发现，利用本发明的重组载体能转染极难 转染的牙周膜干细胞并且不影响转染后的牙周膜干细胞与支架材料的黏附及其 正常的生长。利用该方法制备获得的基因修饰的组织工程化骨，能够促进牙周骨 组织的再生。

根据本发明实施例，步骤(1)进一步包括：全基因合成人骨保护素(Genbank  No.NM_002546)的编码序列区域；hOPG基因的编码序列区域克隆连接到T载 体上；使用合适的引物扩增含有两端酶切位点的hOPG基因编码序列片段；将基 因片段连接到pIRES-EGFP载体上；转化大肠杆菌，测序鉴定筛选出连接到载体 的克隆；使用合适的引物扩增出hOPG-IRES-EGFP序列，亚克隆到载体 pcDNA6.2w上；经BP重组到入门载体上，再经LR重组到pLENT6.3/V5载体 上。由此，利用该方法可以获得重组慢病毒载体，该慢病毒载体能够实现转染基 因在体内持续、稳定的表达；并能用于极难转染的干细胞和原代细胞。

根据本发明实施例，本发明制备方法中选用的酶切位点是BglI和BamHI。

根据本发明实施例，扩增含有酶切位点的hOPG基因编码序列片段使用的第 一引物序列为：SEQ NO 1(命名为SF-F1)、：SEQ NO 2(命名为SF-R1)，第一 引物的具体序列如下：

SF-F1：5’-AAATAGATCTGCCACCATGAACAACTTGCT-3’(SEQ NO 1)；

SF-R1：5’-ATACGTCGACAGCTGGGTCTTATAAGCAGC-3’(SEQ NO 2)；

由此，扩增的精确率好、效率高。

根据本发明实施例，扩增hOPG-IRES-EGFP序列使用的第二引物序列为：：

SEQ NO 3(命名为SF-F)、：SEQ NO 4(命名为SF-R2)，，第二引物的具体 序列如下：

SF-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCGCCACCAT  GAACAACTTGCTGTGCTGCG-3’(SEQ NO 3)；

SF-R2：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTTGTACA  GCTCATCCATGCCG-3’(SEQ NO 4)。

由此，扩增的特异性好、效率高。

根据本发明实施例，本发明前述的步骤(4)进一步包括：(1)磷酸三钙支 架材料的制备；(2)将pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP转染后的牙周膜干细胞与磷 酸三钙支架材料的体外复合。由此，该制备方法不影响转染后的牙周膜干细胞与 支架材料的黏附及其正常的生长，转染后的牙周膜干细胞与支架材料的复合效果 好。

根据本发明实施例，磷酸三钙支架材料的制备的具体操作如下：将颗粒型β- 磷酸三钙支架材料无水乙醇浸泡24h后，用质量浓度75％酒精冲洗浸泡15min， 用双蒸水漂洗3遍，经高温高压灭菌后置入24孔板中，用含10％胎牛血清的 DMEM培养液预湿备用。

根据本发明实施例，将pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP转染后的牙周膜干细胞 与磷酸三钙支架材料的体外复合的具体操作如下：将pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP 转染牙周膜干细胞，细胞消化后制备成5×10⁶/ml的细胞悬液，分别滴加于24孔 培养板中备用的β-磷酸三钙材料上，使细胞自然沉降在材料表面，2h后在培养 皿中缓慢注入含10％胎牛血清的DMEM培养液2ml，充分浸没材料，再加入适 量的培养基，在体积分数为5％的CO₂、37℃孵箱中培养。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种基因修饰的组织工程化骨。根据 本发明实施例，该产品是利用本发明前述的实施例的方法制备而成的。

发明人惊奇地发现，该产品利用组织工程联合基因治疗技术治疗牙周骨缺 损，能够显著促进牙周骨组织再生。

根据本发明再一方面，本发明还提供了上述组织工程化骨在制备治疗牙周骨 缺损疾病的材料中的用途。

发明人惊奇地发现，将基因修饰的组织工程化骨做为牙周骨缺损材料，利用 组织工程联合基因治疗技术治疗牙周骨缺损，能显著促进牙周骨组织再生。

本发明所述的Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系 统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统， DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。Gateway技术是基于已研 究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统(attB×attP→attL×attR)。BP 和LR两个反应就构成了Gateway技术。BP重组反应是利用一个attB DNA片段 或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆，产物是 attL1-基因-attL2。LR重组反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的 重组反应，产物是attB1-基因-attB2。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列 到一个或更多个目的载体。

本发明的优点和有益效果：利用pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP转染牙周膜干 细胞/β-磷酸三钙修复牙周骨缺损，本发明的重组慢病毒载体能够实现转染基因在 体内持续、稳定的表达；能够用于极难转染的干细胞和原代细胞；以慢病毒为载 体的基因转染不影响种子细胞与支架材料的黏附及其正常的生长， pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP转染牙周膜干细胞/β-磷酸三钙能显著促进牙周骨组 织再生，为组织工程联合基因治疗技术治疗牙周骨缺损提供可能性。

附图说明

图1显示了经过有限稀释法克隆化培养的牙周膜干细胞的细胞形态显微图 片，，其中

A显示了未染色细胞的形态的显微图片，

B显示了HE染色的细胞的形态的显微图片；

图2显示了MTT法检测纯化的牙周膜干细胞与未纯化的牙周膜细胞的生长 曲线示意图；

图3显示了牙周膜干细胞来源及表面标志鉴定的显微图片，其中

A显示了波形丝蛋白的显微图片，

B显示了角蛋白的显微图片，

C显示了STRO-1的显微图片；

图4显示了牙周膜干细胞成骨诱导后ALP活性测定结果示意图；

图5显示了牙周膜干细胞成骨诱导后各分子指标的检测结果的显微图片，其 中

A显示了碱性磷酸酶的显微图片，

B显示了矿化结节的显微图片，

C显示了骨钙素的显微图片，

D显示了I型胶原的显微图片；

图6显示成脂诱导后的牙周膜干细胞，其中

A显示了脂滴的形成的显微图片，

B显示了油性O染色阳性的显微图片；

图7显示了慢病毒重组质粒的图谱示意图；

图8显示了pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP转染牙周膜干细胞后的细胞形态的 显微图片，其中

A显示了光镜下图像的图片，

B显示了荧光显微镜下的图像的图片；

图9显示了QPCR检测hOPG基因的表达结果的示意图，其中

A显示了内参基因的扩增曲线和熔解曲线的示意图，

B显示了hOPG基因的扩增曲线和熔解曲线的示意图；

图10显示了利用Western Blot检测hOPG蛋白表达结果的图片；

图11显示了细胞与材料复合扫描电镜图像的图片；

图12显示术后12周组织学观察图像的图片；

图13显示了新生牙槽骨的激光共聚焦显微图像的图片；

图14显示了新生牙槽骨面积百分比示意图。

具体实施方式

慢病毒载体是近年来基因治疗载体研究的热点。慢病毒可以非常高效地将基 因转染到活体模式生物和几乎所有的哺乳动物细胞中，包括不分化的细胞。对于 干细胞，能大大提高目的基因转导效率，转染率达90％以上。牙周组织工程体内 动物实验的观察时间较长，通常为2-3个月，甚至更长时间。慢病毒载体可以将 外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。更重要的是，慢病 毒转染体系不会产生化学转染或腺病毒转染等引起的非特异性的细胞反应。本发 明利用慢病毒的这一特性，尝试使用基因治疗的方法使人牙周膜干细胞在牙周骨 缺损局部持续分泌表达，抑制局部大量破骨细胞的活化，抑制骨吸收，从而加快 牙周骨愈合过程的能力。

目前多数学者认为基因强化组织工程牙周组织的靶细胞首选为牙周膜干细 胞，它是一组具有多向分化潜能的未分化间充质细胞，直接取自牙周组织，具有 很强的增殖能力，一定条件下可分化为成纤维细胞、成骨细胞和成牙骨质细胞， 进一步形成新的牙周组织，而且自体细胞植入还可避免免疫排斥反应。

本发明利用携带人牙周膜干细胞基因的慢病毒转染牙周膜干细胞，然后将基 因修饰的细胞与β-磷酸三钙复合，构建组织工程化骨，修复兔牙周骨缺损。

下面将结合实施例进一步详细地描述本发明，然而应当理解，列举这些实施 例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。

实施例1牙周膜干细胞体外培养及分化研究

1.牙周膜细胞原代培养和生理指标的检测

1.1牙周膜细胞原代培养

分别采用组织块法和酶解组织块法进行细胞原代培养。空气栓塞法处死实验 动物。立即摘取兔上下颌骨，并置于75％酒精中浸泡15min。在超净工作台内， 用咬骨钳去除牙齿周围的牙槽骨，完整分离出兔牙齿。拔髓针完整拔除牙髓，用 含有双抗的PBS自根尖至牙冠反复冲洗，并用咬骨钳剪去牙冠及根尖部，只留 根中1/3段，加入3mg/ml的I型胶原酶，在水浴震荡器37℃下消化1h，将上清 接种于6孔板内，沉淀中加入胶原酶，继续消化1h，将组织块和消化下来的细 胞接种到前述6孔板中，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下于恒温孵箱中静置培养。 3d后更换培养液弃去未贴壁的细胞，2-3d换液1次，收集对数生长期的牙周膜 细胞的培养上清备用。细胞生长达80％汇合时，用2.5g/L的胰酶消化传代。有 限稀释法克隆化培养纯化牙周膜细胞

将收集的对数生长期牙周膜细胞的培养上清1500r/min离心10min，经 0.22μm直径的小滤器过滤后，与培养基以1：1比例混合作为适应性培养基。取 对数生长期的第一代细胞用适应性培养基倍比稀释，调整细胞密度至10-15个 /ml，吹打混匀，接种于96孔培养板中，100μl/孔，培养12h后标记单个细胞孔， 并补液至200μl/孔，待克隆长至孔底1/3-1/2时，用胰酶消化分别移至24孔板和 6孔板中扩大培养。

1.2牙周膜细胞的生理指标的检测

1.2.1MTT法检测细胞生长周期

分别取第4代克隆化培养的兔牙周膜细胞和未纯化的兔牙周膜细胞的单细 胞悬液，各以2×10³/孔接种于96孔板中，每孔培养液200μl，共9组，每组10 个复孔。连续培养9d，每3d换液。每天各取10孔，每孔分别加入MTT溶液(5g/L) 20μl，37℃继续孵育4h，终止培养，吸去上清液。每孔加入150μl DMSO，吹打 混匀。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，求均值。以 时间为横轴，光吸收值为纵轴，绘制细胞生长曲线。

1.2.2细胞来源及间充质干细胞表面标志鉴定

取生长状态良好的克隆化培养的细胞制作细胞爬片。采用免疫荧光方法鉴定 波形丝蛋白、角蛋白和间充质干细胞标志STRO-1的表达。

2.牙周膜干细胞的成骨诱导

2.1碱性磷酸酶活性检测分别将利用矿化液(含10mmol/lβ-甘油磷酸钠、 50μg/ml维生素C、1×10^-8mol/L地塞米松和10％小牛血清的L-DMEM培养液) 诱导和未诱导的克隆化培养的细胞以5×10⁴/ml的细胞浓度，加入96孔板，每孔 100μl，各接种24孔，每3天换液一次。于接种后3d和7d，按照碱性磷酸酶组 化试剂盒说明操作，选择510nm波长，酶联免疫检测仪分别测定12孔诱导组和 未诱导组细胞的光吸收值，检测细胞的碱性磷酸酶活性。

2.2骨钙素、1型胶原免疫细胞化学染色取生长状态良好的克隆化培养的细 胞制备细胞爬片，以2×10⁴/ml的密度接种于置有盖玻片的6孔板中，用10％小 牛血清的DMEM培养24h，待细胞伸展至60％汇合后，换矿化诱导液(含 10mmol/lβ-甘油磷酸钠、50μg/ml维生素C、1×10^-8mol/L地塞米松、10％小牛血 清的L-DMEM培养液)连续培养。培养21d时取部分细胞爬片，行骨钙素、1 型胶原免疫细胞化学染色。

2.3矿化结节染色取生长状态良好的克隆化培养的细胞接种后，用矿化液连 续培养至28d，经4％多聚甲醛固定30min，行茜素红染色，观察矿化结节形成情 况。

3.牙周膜干细胞的成脂诱导

取生长状态良好的克隆化培养的细胞制备细胞爬片，以2×10⁴/ml的密度接 种于置有盖玻片的6孔板中，用10％小牛血清的DMEM培养液培养24h，待细 胞伸展至60％汇合后，换成脂诱导液(含1×10^-6mol/L地塞米松，10mg/L胰岛 素，0.5mmol/L异丁基黄嘌呤，0.2mmol/L吲哚美辛，10％小牛血清L-DMEM 的培养液)，观察细胞形态变化，油红O染色。

4.实验结果

本实验采用组织块法和酶解组织块法进行兔牙周膜细胞的原代培养，并采用 有限稀释法进行兔牙周膜细胞克隆筛选，获得单细胞克隆来源的细胞(图1)， 克隆形成率为0.52％；细胞生长曲线结果显示，克隆化培养的牙周膜细胞和未克 隆化培养的牙周膜细胞生长曲线(图2)，均呈倒“S”形，在培养的第2天细胞 生长速度加快，第7天各自的生长速度减慢，总体来说克隆化培养的牙周膜细胞 生长慢于未克隆化培养的牙周膜细胞；细胞免疫荧光鉴定波形丝蛋白表达阳性， 角蛋白表达阴性，间充质干细胞表面标志STRO-1表达阳性(图3)；并向成骨、 脂肪细胞诱导分化，初步研究了牙周膜细胞的分化潜能，成骨诱导后，ALP活 性增高(图4)，ALP染色阳性，体外可形成矿化结节，茜素红染色阳性，免疫 细胞化学染色结果显示OC和COLⅠ均呈阳性表达(图5)；成脂诱导后，油红 O染色阳性(图6)。本实验结果表明牙周膜细胞具有间充质干细胞表型和多向 分化潜能，可作为牙周组织工程的种子细胞。

实施例2慢病毒载体介导hOPG基因转染牙周膜干细胞

1.PCR扩增人骨保护基因

登陆Genbank查询人骨保护素基因(Genbank No.NM_002546)的mRNA序列。 根据文献报道设计人骨保护素基因cDNA的特异引物序列，由美国Invitrogen公 司进行全基因合成hOPG基因的编码序列区域。

2.C端融合IRES-EGFP的中间载体的构建

(1)根据所需融合表达的基因序列设计并合成4条引物，引物序列如下所 示：

SF-F1：

5’-AAATAGATCTGCCACCATGAACAACTTGCT-3’(SEQ NO 1)；

SF-R1：

5’-ATACGTCGACAGCTGGGTCTTATAAGCAGC-3’(SEQ NO 2)；

SF-F：

5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCGCCACCATGAA  CAACTTGCTGTGCTGCG-3’(SEQ NO 3)；

SF-R2：

5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTTGTACAGCTCAT  CCATGCCG-3’(SEQ NO 4)；

(2)将hOPG基因的编码序列区域克隆连接到T载体上；

(3)使用引物SF-F1、SF-R1扩增含有BglI和BamHI酶切位点的hOPG基 因编码序列片段，PCR反应体系如表1所示，反应条件如表2所示：

表1PCR反应体系

10×缓冲液 5μl 10×增强剂 5μl Mg2+ 1μl dNTP 1μl DNA 10ng 引物(10μM) 1μl×2 去离子水 至50μl

表2PCR反应条件

(4)将扩增的基因片段连接到经BglI和BamHI酶切处理的pIRES-EGFP 载体上；

(5)转化大肠杆菌，测序鉴定筛选出连接到载体的克隆；

(6)使用引物SF-F、SF-R2扩增出hOPG-IRES-EGFP序列，亚克隆到载体 pcDNA6.2w上，用于后续的BP重组。

3.重组慢病毒载体构建

应用Gateway重组技术构建慢病毒表达载体 pLENT6.3/V5-hOPG-IRES-EGFP，构建成功的重组载体的示意图如图7所示。

(1)配制以下反应体系(总体积8μl)：

线性化attB表达克隆    1-7μl

供体载体((150ng/μl)  1μl

TE缓冲液(pH8.0)       补平至8μl

(2)取出BP MIX冰上融解；

(3)漩涡混匀BP MIX，迅速2s；

(4)加入2μl BP MIX，上下轻轻混匀；

(5)25℃孵育1h；

(6)取3μl至一TUBE管中，其余-20℃保存；

(7)加入以下试剂：

目的载体(150ng/ul)  1μl

TE缓冲液(pH8.0)  4μl

(8)取出LR MIX，2min内冰上融解；

(9)每次2s，涡旋2次，快速漩涡混匀；

(10)加入2μl LR MIX，上下轻轻混匀；

(11)25℃孵育2-4h(如果需要更多克隆可以过夜反应孵育)；

(12)每管加1μl蛋白酶K，37℃10min；

(13)用One Shot Stbl3转化质粒，涂板(Amp抗性)，挑克隆，抽质粒， 测序。

(14)验证测序结果正确后，扩增质粒备用。

4.慢病毒包装

取细胞状态良好，处于对数生长期的HEK293T细胞，细胞消化计数后，每 个10cm的细胞培养皿接种3×10⁶个细胞，37℃，5％的CO₂培养箱中培养过夜。 9μg Packaging Mix和3μg重组慢病毒质粒加入至1.5ml Opti-MEM中，36μl Lipofectamine 2000加入至1.5ml Opti-MEM中，室温放置5min；混合质粒和 Lipofectamine 2000稀释液，轻轻混匀，室温孵育20min；细胞培养皿中的细胞 用Opti-MEM小心的洗两遍后，加入5ml Opti-MEM。将3ml质粒脂质体复合物 小心地加入到细胞培养皿中，轻轻混匀，37℃，5％的CO₂培养箱中孵育4-6h 后，更换完全培养基。48h后收集细胞培养上清，3000rpm离心15min，去除 细胞残余，上清用0.45μm的滤器过滤分装，每管1.0ml。将病毒原液在50000g 下超速离心2h，去除上清，重悬于200μl DMEM培养液中，分装小管，放置于 -80℃保存备用。

5.慢病毒滴度测定

将目的细胞培养至对数生长期，选取细胞生长状态良好的细胞进行实验：第 一天，细胞胰酶消化计数细胞后，接种24孔板(每孔2х10⁵个细胞)，37℃培养 过夜，感染时细胞长至30～50％的融合密度；第二天，转染时，将保存于-80℃冰 箱中病毒液37℃水浴融解，用含有5％FBS的细胞培养基进行10倍梯度稀释， 从10^-1稀释到10^-6(每个浓度梯度做二个重复)。病毒梯度稀释时，轻轻地颠倒 混匀稀释液，不能漩涡混匀；去掉24孔板中的培养基，轻轻颠倒每管慢病毒稀 释液，各取1ml加入每孔细胞中。如果细胞适合则加入聚酰胺(Polybrene)终浓 度至8μg/ml，轻摇使混匀，37℃过夜培养；第三天，去除含慢病毒的培养基，加 入2ml完全培养基；第四/五天，在荧光显微镜下观察各孔中EGFP表达量，计 算病毒滴度(TU)/ml。

TU/ml＝(平均阳性细胞数/视野)×(视野数/孔)

病毒体积(ml)×稀释倍数

6.转染效率测定

以未转染的同时期细胞为背景荧光，随机计数多个低倍视野(х100)中荧光 及白光观察细胞计数，计算细胞的转染效率。以表达EGFP绿色荧光的细胞为转 染阳性细胞，统计同一视野下转染阳性细胞和总细胞数。根据以下公式计算转染 效率：转染效率＝EGFP阳性细胞数/总细胞数。

7.病毒感染靶细胞

病毒转染前一天，将状态良好，处于对数生长期的细胞用0.25％胰酶消化， 用完全培养基悬浮成单细胞悬液，细胞计数后，按照每孔5х10⁵个细胞接种于6 孔板的每个孔中；病毒转染时所用培养基中预先加入聚酰胺(终浓度8μg/m1)；6 孔板中换入新鲜配置培养基：lml/孔以MOI＝10加入适量的慢病毒，混匀后置于 细胞培养箱；病毒加入后6h，在6孔板中换入新鲜不加聚酰胺的培养基，5％的 CO₂的培养箱中继续培养。

8.q-PCR检测mRNA水平上目的基因的表达

慢病毒感染实验后48h收集各组细胞，抽提RNA，逆转录后，通过q-PCR 技术，检测各组细胞中目的基因的表达。

(1)总RNA提取(Trizol法)

a)每个细胞样品中各加入1ml Trizol液，用枪头吹吸混匀，尽量让细胞全 部裂解，室温放置5min。

b)每管中各加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，反复颠倒混匀15s，然后12000g， 4℃离心10min。

c)取上层水相于一新的离心管中，每管中各加0.5ml异丙醇，轻轻混匀， 室温放置10min，然后12000g，4℃离心10min。

d)弃去上清液，每管中加入1ml的75％的酒精轻轻洗涤沉淀，12000g，4℃ 离心10min。

e)小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10min，注意不要干燥过分， 否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，55℃-60℃水溶10min。

(2)反转录cDNA

a)取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管，每个样本加入如下成分得到混合物 1。

组分体积

5μg总RNA         3μl

(50μM)Oligo(dT)  1μl

10mM dNTP         1μl

DEPC水补至10μl

b)把混合物165℃温水浴5min，然后立即冰浴2min。

c)在混合物1里加入如下成分，得到混合物2共20μl体系。

组分体积

10xRT缓冲液 2μl

25mM镁离子 4μl

0.1M DTT                    2μl

RNaseout40U/μl             1μl

SuperScrip III RT(200U/μl) 1μl

混合物1                     10μl

总体积20μl

d)50℃处理50min。

e)85℃处理5min，立即放置到冰上。

f)在每管混合物2中加入1μl的RNase H，37℃处理20min。

g)cDNA放在-20℃保存备用。(可以保存半年)

(3)q-PCR

表3PCR体系中各组分的体积

项目 反应中各组分体积 来源 超纯水 36.8μl 美国invitrogen公司产品 10xPCR缓冲液 5μl 美国invitrogen公司产品 镁离子(25mM) 3μl 美国invitrogen公司产品 dNTPs(25mM) 0.4μl TaKaRa 上游引物(10μM) 1μl 上海英骏 sybr(50x) 1μl 美国invitrogen公司产品 下游引物(10μM) 1μl 上海英骏 Tap酶(5U/μl) 0.3μl PlatinumTaq 模板 1.5μl   总体系 50μl  

表4PCR反应条件

(4)ΔΔCt计算方法及结果分析

基因的表达量F＝2^-ΔΔCt，目标基因的沉默效率为1-2^-ΔΔCt：

ΔΔCt＝(待测样品的目的基因的Ct的平均-待测样本的看家基因的Ct的平 均)-(对照样品的目的基因的Ct的平均-对照样本的看家基因的Ct的平均)。

备注：2^-ΔΔCt值越大，说明该基因的表达量越高。

9.Western Blot检测目的蛋白的表达，按照常规步骤进行。

电泳时间：80V30min，120V60min

转膜：100V7min

封闭：5％脱脂奶粉室温1h

一抗：参照hOPG抗体说明书

二抗：羊抗鼠IgG-HRP1：5000稀释，室温孵育1h

X光片曝光时间：1-5min

10.统计学处理

采用SPSS17.0软件进行统计处理，计量资料均以均数士标准差(x±s)表示。 组间比较采用单因素方差分析检验，P<0.05为差异有统计学意义。

11.实验结果

本实验成功获取人骨保护素成熟肽编码序列，构建含有人骨保护素基因和 EGFP基因的慢病毒表达载体，应用HEK293T细胞进行病毒包装，纯化，浓缩 及病毒滴度测定，并成功转染兔牙周膜干细胞。本实验中，慢病毒滴度测定结果 为1.5×10⁶TU/ml，测得最适MOI＝10，转染效率为90％以上。

人骨保护素基因转染牙周膜干细胞后，荧光显微镜下观察出现荧光，表明细 胞转染成功(如图8所示)。

q-PCR检测人骨保护素基因的表达情况结果显示，转染组2^-ΔΔCt值是未转染 组的3311.65倍(图9)，结果表明hOPG基因已成功转入牙周膜干细胞中。 Western-blot检测人骨保护素基因的表达情况结果显示， pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP感染组出现60kD左右的目的蛋白带(图10)。这说 明获得的高滴度pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP在体外感染牙周膜干细胞后能有效 地表达人骨保护素蛋白。实验在基因和蛋白水平上证明人骨保护素基因已成功转 入牙周膜干细胞。

实施例3慢病毒载体介导hOPG基因转染牙周膜干细胞修复牙周骨缺损

将pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP转染兔牙周膜干细胞，并与β-磷酸三钙 (β-tricalcium phosphate，β-TCP)复合，植入兔牙周骨缺损处，评价其在体内 修复兔牙周骨缺损的效果。

1.兔牙周膜干细胞的分离与培养，方法同实施例1。

2.pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP转染兔牙周膜干细胞，方法同实施例2。

3.β-磷酸三钙支架材料的制备将颗粒型β-磷酸三钙无水乙醇浸泡24h后，用 质量浓度75％酒精冲洗浸泡15min，用双蒸水漂洗3遍，经高温高压灭菌后置入 24孔板中，用含10％胎牛血清的DMEM培养液预湿备用。

4.细胞与β-磷酸三钙体外复合将pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP转染牙周膜 干细胞及未转染的牙周膜干细胞消化后制备成5×10⁶/ml的细胞悬液，分别滴加 于24孔培养板中备用的β-磷酸三钙材料上，使细胞自然沉降在材料表面，2h后 在培养皿中缓慢注入含10％胎牛血清的DMEM培养液2ml，充分浸没材料。再 加入适量的培养基，在体积分数为5％的CO₂、37℃孵箱中培养。细胞与β-磷酸 三钙支架材料的复合物用于倒置相差显微镜及扫描电镜下观察细胞与材料的复 合情况，及兔牙周骨缺损的体内植入。

5.扫描电镜观察将上述已构建好的细胞与β-磷酸三钙材料复合物分别于 体外培养2d、7d后，经PBS清洗两次，用含体积分数3％戊二醛4℃固定2h， PBS清洗，梯度酒精逐渐脱水，醋酸异戊酯置换30min；CO₂临界点干燥，离子 溅射镀膜仪镀膜，进行扫描电镜观察。

6.牙周骨缺损手术将20只新西兰大白兔(6-8月龄，体质量2.2～2.6kg， 雌雄各半)随机分为4组，每组5只。实验用兔采用速眠新Ⅱ(0.25ml/kg)与戊 巴比妥钠(18mg/kg)复合麻醉后，在下颌颏部备皮，消毒，沿下颌骨下缘偏上 做一弧形切口，切开皮肤、皮下组织、肌肉和骨膜，暴露牙槽骨；以快速球钻在 生理盐水冷却下去骨，至下颌切牙根面，形成一冠根向10mm，近远中向5mm， 深度为4mm的骨缺损，彻底刮治暴露的牙根面，去除残余牙周膜；按照实验分 组，在牙周缺损处植入相应材料：第1组为空白对照组，不植入任何材料；第2 组植入β-磷酸三钙；第3组植入牙周膜干细胞/β-磷酸三钙；第4组植入 pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP转染牙周膜干细胞/β-磷酸三钙；覆盖胶原膜 (Bio-Gide，Geistlich Biomaterials，Wolhusen，Switzerland)；分层缝合。手术均 在无菌条件下进行。术后保持伤口区清洁，分笼饲养，庆大霉素8万单位肌注预 防感染，每日一次，连续3天。

7.组织学观察术后12周处死实验动物。参照Donath等组织磨片技术，梯 度乙醇脱水，树脂包埋，磨片机进行30μm厚的牙周组织磨片制备。甲苯胺蓝染 色，封片，光镜下观察新生牙槽骨情况。

8.激光共聚焦显微镜观察取pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP转染牙周膜干细 胞/β-磷酸三钙组实验样本，用4％多聚甲醛固定2天，磨片机进行牙周组织磨片 后，激光共聚焦显微镜观察EGFP阳性的回植细胞。

9.组织形态学测量应用Image-Pro Plus6.0计算机图像分析软件进行成骨面 积定量分析，每样本随机选取3张磨片，分别测量及计算新骨成骨面积占缺损面 积的百分比。

10.统计学分析实验数据以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS17.0软件 包进行统计学分析。多组均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统 计学意义。

11.实验结果：

扫描电镜结果显示，β-磷酸三钙生物陶瓷在扫描电镜下表面呈多孔三维立体 网状结构，孔隙分布均匀，且孔隙间相互交通连接(图11A)。细胞接种2d时， 材料表面有一定数量的细胞贴附，并伸出胞浆突起附着于材料表面，围绕孔隙生 长(图11B、11C)；培养7d时，细胞增殖明显，细胞数量明显增多，重叠生长 并连接成片，材料表面已被细胞覆盖，部分区域分泌较多的细胞外基质。细胞间 伸出突起互相连接，细胞跨越微孔表面或向孔内长入(图11D、11E)。且 pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP转染牙周膜干细胞/β-磷酸三钙分泌细胞外基质旺 盛，与未转染组无明显差别，说明以慢病毒为载体的基因转染并没有影响种子细 胞与支架材料的黏附及其正常的生长，增殖。

组织学结果显示，手术后可见术区有轻微的红肿，约5天后红肿消退，所有 实验动物无炎症感染反应。术后12周取材制作病理切片进行组织学观察：空白 对照组牙周缺损内充满大量软组织，几乎无牙槽骨形成(图12A)。β-磷酸三钙 组有很少量新骨形成，β-磷酸三钙周边和中央可见类骨质形成，材料剩余较多(图 12B、12C)。牙周膜干细胞/β-磷酸三钙组可见新生牙槽骨形成，骨小梁互相连接， 较β-磷酸三钙组多(图12D、12E、12F)。pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP转染牙周 膜干细胞/β-磷酸三钙可见新生牙槽骨形成，骨量较多，相互连接成片，新生牙槽 骨骨成熟程度较高，可见骨单位形成。新生骨正接近于正常骨结构(图12G、12H、 12I)。

激光共聚焦显微镜结果显示，pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP转染牙周膜干细 胞/β-磷酸三钙组，在牙周骨缺损处，可以看到新生的牙槽骨有明亮的绿色荧光蛋 白表达(图13)，说明植入的牙周膜干细胞在体内存活、增殖，并且参与了新骨 形成过程。

组织形态学测量新骨形成面积及统计结果显示，术后12周， pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP转染牙周膜干细胞/β-磷酸三钙组新骨形成量最大， 新生牙槽骨面积百分比为(50.4±7.3)％，与空白对照组(0％)，β-磷酸三钙组 (16.2±6.5)％和牙周膜干细胞/β-磷酸三钙(35.6±8.9)％相比，均具有统计学意 义(P<0.05)。各组新生牙槽骨面积百分比见图14。